Un flusso di lavoro modulare per l'analisi quantitativa, strutturale e funzionale dei biofilm di Leptospira

Studiamo i biofilm come strutture protettive che permettono la persistenza ambientale e dell'ospite, indagando la dinamica della formazione, la composizione molecolare, le caratteristiche adattative e il contributo all'infezione. Combinando bioanalisi cristalline, imaging temporale testuale, microscopia confocale, microscopia elettronica a scansione e trasscrittomica nei nostri laboratori, progredisce la ricerca sui biofilm attraverso analisi multidimensionale integrata. Per cominciare, coltivare cellule di Leptospira in mezzo EMJH in tubi di vetro a fondo piatto a vite con tappo a vite.

Incubare le colture in condizioni aerobiche a 30 gradi Celsius senza scuotere fino a raggiungere la fase logaritmica media. Assicurarsi che le colture raggiungano una densità ottica compresa tra 0,2 e 0,4 a 405 nanometri, che corrisponde a due a cinque volte dieci alla potenza di otto celle per millilitro. Utilizzando un microscopio a campo oscuro a ingrandimento 20x, verifica che le cellule siano modali e non raggruppate.

Diluire la coltura aritmica di fase a metà logaritmia verificata a un rapporto uno a 100 in un mezzo EMJH fresco per ottenere circa una volta per 10 alla potenza di sei celle per millilitro e mescolare delicatamente per inversione senza vortex. Ora usa pinze sterili per posizionare una membrana policarbonatica idrofila sterile da 0,1 micrometri piatta sul fondo di ogni pozzo in una piastra sterile da 24 pozzi con coperchio. Aggiungi un millilitro di medium EMJH sterile in ciascun pozzo e pre-ammolla la membrana per due ore a 30 gradi Celsius.

Successivamente, rimuovere la soluzione di ammollo da ogni pozzo senza spostare la membrana e aggiungere 1,5 millilitri di sospensione batterica diluita, assicurandosi che la membrana rimanga saldamente in posizione sul fondo. Poi, posiziona un vassoio pieno d'acqua all'interno dell'incubatrice per mantenere l'umidità. Incubare la placca a 30 gradi Celsius in condizioni statiche per permettere la formazione di biofilm.

Lasciare la piastra fino a tre settimane per ceppi a crescita lenta. Nel momento desiderato, aspirare con cura quanta più coltura possibile senza disturbare il biofilm. Sciacqua delicatamente ogni pozzo con un millilitro di PBS sterile mantenendo la membrana piatta contro il fondo.

Aggiungi un millilitro di aldeide al 4% di paraforma in PBS in ogni pozzo e incuba a 37 gradi Celsius per 30 minuti per fissare i campioni di biofilm. Dopo l'incubazione, rimuovere il fissativo e risciacquare delicatamente due volte con un PBS da un millilitro. Aggiungi un millilitro di soluzione di viola cristallina allo 0,1% di peso in volume in ogni pozzo e incuba a temperatura ambiente per 15 minuti, assicurandoti che il scorrimento di copertura sia completamente sommerso.

Poi elimina il colorante viola cristallino da ogni pozzo e risciacqua due volte con un millilitro di PBS. Inclina il piatto e svuota tutto il liquido rimasto. Lascia la piastra a temperatura ambiente ad asciugarsi all'aria finché il substrato non appare completamente asciutto, preferibilmente durante la notte.

Successivamente, aggiungi 500 microlitri di tampone eluciano composto per il 50% di etanolo e il 50% di acido acetico glaciale in volume in ciascun pozzo. Pipetta su e giù per sciogliere completamente la colorazione legata al biofilm. Ora, trasferire 200 microlitri di ogni campione su una micropiastra otticamente trasparente di 96 pozzi.

Misurare l'assorbenza a 570 nanometri e sottrarre i valori di fondo dai controlli non inoculati processati in tutte le fasi. Registra la media e la deviazione standard per almeno tre repliche tecniche. Ottieni i biofilm nelle piastre del pozzo come dimostrato in precedenza.

Aggiungere una soluzione di aldeide paraforma al 4% e glutaraldeide all'1% in tampone di sodio 0,2 molari a pH 7,4 nei pozzi. Incubare i campioni fissi per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Rimuovere il fissativo e risciacquare il campione due volte con PBS per preservare il biofilm attaccato alla superficie minimizzando il distacco.

Ora immergi il slip di copertura in tetrossido all'1% di osmio diluito in PBS e incuba per un'ora per migliorare il contrasto della microscopia elettronica a scansione. Poi risciacqua il substrato due volte con PBS. Disidratare i campioni immergendoli sequencialmente per 10 minuti ciascuno in serie di etanolo gradato.

Successivamente, aggiungi 500 microlitri di esamildisilazano e incuba per cinque minuti. Poi sostituisci con esesimildisilazano fresco e incuba per altri cinque minuti. Successivamente, rimuovere la soluzione in eccesso e lasciare che il campione si asciughi completamente all'aria sotto una cappa a pompa.

Ora monta i campioni essiccati su stub di microscopia elettronica a scansione usando nastro di carbonio conduttivo a doppia faccia. Lo sputter rivestono i campioni con uno strato sottile, circa 10 nanometri di oro o platino, per aumentare il contrasto elettronico per l'imaging. Infine, carica i pezzi preparati nel microscopio elettronico a scansione utilizzando il supporto campione appropriato.

Evacua la camera durante la notte se possibile per migliorare la qualità delle immagini. Successivamente acquisire immagini secondarie di elettroni da cinque a quindici kilovolt utilizzando ingrandamenti adeguati per visualizzare l'ultrastruttura del biofilm. Dopo 21 giorni di incubazione, la colorazione viola cristallina ha rivelato motivi visibili di biofilm sia su filtri in policarbonato sia su coperture di vetro per Leptospira interrogans e Leptospira biflexa.

Ogni specie mostra impronte architettoniche distinte come forme a punti, ramificate o reticolate. Le misurazioni di assorbanza a 570 nanometri hanno confermato una maggiore ritenzione del viola cristallino nei biofilm di Leptospira byflexa rispetto a quelli di Leptospira interrogans in tutti i punti temporali, indicando un maggiore accumulo di biomassa nel ceppo. La microscopia elettronica a scansione dei biofilm di Leptospira interrogans ha catturato i primi depositi della matrice extracellulare in biofilm di tre giorni, una faccia basale matura e canalizzata con struttura tridimensionale a 14 giorni e consolidamento matriciale completamente sviluppato con architettura densa entro 21 giorni.

Il nostro protocollo ottimizzato sincronizza letture complementari da culture identiche, aumentando la robustezza, riducendo la variabilità e rivelando informazioni dinamiche e strutturali, disponibili con approcci a metodo singolo. Integrando analisi complementari, i nostri risultati hanno standardizzato la valutazione dei biofilm, chiarendo la dinamica e l'architettura delle leptospire. Collegano la struttura alla virulenza e rafforzano la ricerca comparativa riproducibile.

I mutanti futuri collegheranno la regolazione alla morfologia e dinamica dei biofilm, chiarendo la persistenza ambientale e valutando strategie che interrompano le informazioni sui biofilm o promuovono la dispersione.