Rilevamento della senescenza utilizzando luce riflessa nella frazione vascolare stromale adiposa

Studiamo la senescenza degli adipociti in diverse deposi di grasso e condizioni metaboliche, come obesità e iperinsulinemia. I tradizionali saggi SABG basati su Brightfield non permettono davvero il multiplexing e sono molto soggettivi. Il nostro nuovo protocollo è meno soggettivo e permette il multiplexing.

Per cominciare, recupera il tubo contenente il tessuto adiposo umano. Omogeneizzare 10 grammi di tessuto adiposo e aggiungerli a un tubo contenente lo 0,05% di enzima collageno di tipo uno per ottenere circa un milione di cellule della frazione vascolare stromica, o SVF. Aliquota 500.000 celle in ogni tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Aggiungi un millilitro di paraformaldeide al 2% al tubo per la fissazione cellulare. Poi, incuba su un dondolo a temperatura ambiente per 20 minuti. Centrifuga a 600G per 10 minuti e rimuovi il surnatante.

Prepara la soluzione di colorazione con X-Gal utilizzando il kit di tintura senescence beta-galactosidasi secondo le istruzioni del produttore. Aggiungi un millilitro della soluzione di colorazione in tre tubi freschi. E regolare il pH a cinque, sei e otto usando soluzioni di acido cloridrico molare o idrossido di sodio molare.

Usa un misuratore di pH calibrato per verificare il pH. Aggiungere la soluzione di colorazione X-Gal regolata con pH a ciascuno dei tubi etichettati contenenti 500.000 celle. Incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore senza anidride carbonica.

Centrifuga le celle a 600G per 10 minuti. Dopo aver rimosso il surnanteante, lava le cellule con PBS. E centrifugare di nuovo a 600G per 10 minuti.

Una volta rimosso il soprantagente, per identificare le cellule endoteliali all'interno della SVF eterogenea, incubare le cellule con CD31 specifici per cellule endoteliali o controllare gli anticorpi primari IgG a quattro gradi Celsius durante la notte. Lavare le cellule tre volte con PBST allo 0,1% per 10 minuti a temperatura ambiente su un oscillatore per rimuovere l'anticorpo primario non legato. E centrifuga a 600G per 10 minuti.

Dopo aver scartato il soprantantante, incubare le cellule con un anticorpo secondario per un'ora a temperatura ambiente su un oscillante. Centrifugare a 600G per 10 minuti per rimuovere la soluzione secondaria di colorazione anticorpale. Lavare le celle tre volte usando PBST e poi centrifugare come dimostrato in precedenza.

Risospendere le cellule nel montante antifade. Pipetta la sospensione cellulare su vetri del microscopio e indurisci durante la notte a temperatura ambiente per immobilizzare le cellule. Il giorno dopo, aggiungi 100 microlitri di glicerolo al 100%.

Metti sopra un sottocopertura e sigillalo con lo smalto. Posiziona il vetrino preparato sul palco di un microscopio confocale. Nell'interfaccia software del microscopio, seleziona l'opzione Light Path e regola l'impostazione del beam splitter su T90R10.

Successivamente, verifica i valori di lunghezza d'onda di taglio per gli specchi dicroici secondari, o SDM, nell'impostazione Mirror. Nel menu Rivelatore, clicca sull'opzione Colorante e Selezione Rivelatore per assegnare canali e lunghezze d'onda di eccitazione. Poi, imposta i valori percentuali di intensità di potenza laser per ogni laser specifico nell'intervallo dal 10 al 15%. Nel menu Serie, nella sezione LSM, attiva l'opzione Z su On. Imposta la dimensione del passo Z all'ottimale di sistema di 0,74 micrometri.

Successivamente, nel menu Sezione Z, inserisci il valore per il campo di input start e definisci uno stack Z basato sul segnale a membrana per catturare l'intero volume della cella. Nel pannello Acquisizione, inserisci il nome del file e la posizione di salvataggio nel campo di input LSM. E clicca su LSM Start per avviare l'acquisizione dell'immagine.

E salva i file nel nostro formato microscopio nativo. Dopo l'acquisizione, si usano le frecce di navigazione Z per verificare il segnale e la distribuzione focale dei diversi coloranti su tutto lo stack Z. Carica il file salvato su Immagine J.In finestra pop-up Opzioni di importazione Bio-Format, clicca su Ok.

Clicca su Menu Immagine per aprire il file. E dal menu a tendina, seleziona Colore, poi Divide i canali per aprire i diversi canali come finestre separate. Successivamente, regola il contrasto di luminosità e ottimizza i valori LUT usando l'opzione Modifica nel menu Immagine per una visualizzazione migliorata dell'immagine.

Usa la barra di scorrimento dell'asse Z in basso nel frame per attraversare le sezioni ottiche e verificare le caratteristiche cellulari in tutto lo stack. Nel menu Immagine, scegli Stack. Successivamente, seleziona la funzione Z Project per generare le proiezioni di intensità sommate dell'immagine confocale tridimensionale.

Nella finestra di dialogo Proiezione Z, definisci i range di inizio e fine delle fette. Seleziona il tipo di proiezione e clicca su Ok per ottenere l'immagine composita 2D finale. Successivamente, naviga nel menu Immagine.

Seleziona l'opzione Tipo per regolare il tipo di immagine a 16 bit. Poi, salva ed esporta le immagini come file TIF a 16 bit. Importare le immagini salvate in CellProfiler versione 4.2.8 per la segmentazione automatica delle celle, la quantificazione dell'intensità luminosa riflessa per ogni cella ed esportazione dei valori di misurazione dell'intensità in un foglio di calcolo.

Nel foglio di calcolo, defini la soglia per la positività della beta-galactosidasi associata alla senescenza come la somma dell'intensità media della luce riflessa della condizione pH 8 più tre deviazioni standard. Classificare le cellule in condizioni di pH 6 come beta-galactosidasi associate alla senescenza se i loro valori di intensità superano la soglia stabilita. La colorazione di beta-galactosidasi associata alla senescenza a luce riflessa nelle cellule SVF umane ha prodotto pattern chiari e riproducibili su tre livelli di pH.

Al pH 5, la maggior parte delle cellule mostrava un segnale forte dovuto all'elevata attività enzimatica endogena. Al valore standard del test di pH 6, l'intensità e la frequenza del segnale diminuirono, permettendo l'identificazione specifica delle cellule beta-galactosidasi associate alla senescenza. A pH 8, il segnale era minimo e questo fungeva da base per definire la soglia di positività.

I test di sensibilità di rilevamento hanno mostrato che l'imaging a luce riflessa ha superato Brightfield in tutte le condizioni di pH. A pH 5, la luce riflessa mostrava forti precipitati X-Gal, mentre Brightfield catturava solo i depositi più grandi. Al pH 6, la luce riflessa identificava cellule positive troppo deboli o diffuse per essere viste in campo brillante.

A pH 8, l'imaging con luce riflessa ha rilevato un segnale minimo, coerente con una bassa attività enzimatica, superando Brightfield nell'identificare i precipitati X-Gal a livelli di attività intermedi e inferiori. Nel complesso, questo flusso di lavoro di imaging con luce riflessa integra la rilevazione simultanea di beta-galattosidasi associata alla senescenza dipendente dal pH e di marcatori basati sulla fluorescenza, come CD31, facilitando valutazioni di senescenza multi-caratteristica a risoluzione cellulare singola all'interno di popolazioni eterogenee di SVF. Questo protocollo consente misurazioni sensibili e quantitative dell'attività SABG consentendo contemporaneamente sia altri marcatori di senescenza sia altri marcatori cellulari.

La sfida principale, direi, è l'installazione iniziale della microscopia. Ma una volta ottimizzato questo, puoi usare gli stessi parametri di acquisizione tra gli esperimenti. Studi futuri potranno combinare questo saggio con altri marcatori subcellulari per vedere come il SABG si relazioni ai diversi processi cellulari.