Separazione elettroforetica delle proteine

La separazione di singole proteine da miscele proteiche complesse può essere ottenuta mediante elettroforesi su gel in elettroforesi su gel di poliacrilammide, altrimenti nota come migrazione delle proteine di pagina in risposta a un campo elettrico attraverso i pori nella matrice gel. La combinazione della dimensione dei pori del gel e della dimensione e della forma della carica proteica determina la velocità di migrazione della proteina. In questo video, dimostreremo un metodo per la separazione elettroforetica delle proteine.

Ciao, sono il Dr.Bobul Chakravarti del Centro Proteomico del Keck Graduate Institute of Applied Life Sciences. Oggi vi mostrerò una procedura per eseguire l'elettroforesi su gel 1D. Quindi iniziamo.

Per iniziare, assemblare il sandwich di lastre di vetro dell'apparecchio per elettroforesi secondo le istruzioni del produttore utilizzando due lastre di vetro pulite e due distanziatori da 1,5 millimetri. Ora blocca il sandwich della lastra di vetro al supporto di colata. Successivamente, preparare la soluzione di gel separatore che è stata descritta nei protocolli attuali.

Aggiungere la quantità specificata di 10% di ammonio per solfato e mescolare delicatamente per mescolare. A causa dell'elevata concentrazione di acrilammide, il degasaggio non è necessario. Utilizzando una pipetta di plastica monouso da 10 millilitri, applicare immediatamente la soluzione di gel separatore sul sandwich lungo un bordo di uno dei distanziatori fino a quando l'altezza della soluzione tra le lastre di vetro è di circa 11 centimetri.

Quindi, utilizzare un'altra pipetta per coprire lentamente la parte superiore del gel con uno strato di circa un centimetro di spessore di acqua, alcol isobutilico saturo o acqua distillata. Fallo stratificando delicatamente l'acqua contro il bordo di uno, quindi l'altro dei distanziatori consente al gel di polimerizzare da 30 a 60 minuti. A temperatura ambiente, il rivestimento d'acqua assicura che il gel di acrilammide polimerizzi in linea retta.

Una volta che il gel polimerizza, siamo pronti per versare il gel di impilamento per versare il gel di impilamento. Per prima cosa, versare lo strato di acqua distillata, quindi risciacquare con un x tris CL in SDS a un pH di 8,8. Ora prepara la soluzione di gel da impilare come indicato nei protocolli attuali.

Quindi, utilizzando una pipetta di plastica, lasciare che la soluzione di gel da impilare goccioli lentamente al centro del panino lungo un bordo di uno dei distanziatori fino a quando l'altezza della soluzione nel panino è di circa un centimetro dalla parte superiore delle piastre. Fare attenzione a non introdurre bolle d'aria nel gel da impilare. Una volta versato il gel, inserire un pettine di teflon da 0,75 millimetri nello strato di soluzione di gel impilabile.

Lasciare polimerizzare la soluzione di gel di impilamento da 30 a 45 minuti A temperatura ambiente, siamo ora pronti per preparare i campioni di proteine. Per iniziare la preparazione del campione di proteine. Diluire una parte del campione proteico da analizzare in un rapporto uno a uno con due tamponi XSDS.

Per le soluzioni proteiche diluite, prendere in considerazione l'utilizzo di una miscela di tampone campione da cinque a uno per sei volte SDS. Se il campione è un pellet proteico precipitato, sciogliere la proteina in 50-100 microlitri di un tampone XSDS. Ora riscaldate i campioni per tre-cinque minuti a 100 gradi Celsius in una provetta da microcentrifuga con tappo a vite sigillato a bagnomaria.

Quindi, rimuovere con cura il pettine in teflon senza strappare i bordi dei pozzetti in poliacrilammide. Dopo aver rimosso il pettine, sciacquare i pozzetti con un tampone per elettroforesi XSDS. Quindi, utilizzando una pipetta, riempire i pozzetti con un tampone per elettroforesi XSDS.

Una volta che i pozzetti sono stati risciacquati e riempiti con il tampone, fissare il sandwich di gel alla camera tampone superiore. Seguendo le istruzioni del produttore, riempire la camera tampone inferiore con la quantità consigliata di un tampone per elettroforesi XSDS. Quindi, posizionare il sandwich attaccato alla camera tampone superiore nella camera tampone inferiore.

A questo punto, riempire completamente la camera tampone superiore con un tampone per elettroforesi XSDS, in modo che i pozzetti del campione del gel di impilamento siano riempiti con il tampone. Il gel è ora pronto per essere caricato utilizzando un pipettatore automatico da 25 o 100 microlitri con puntali di caricamento del gel, caricare il campione proteico in uno o più pozzetti applicando con cura il campione come uno strato sottile sul fondo dei pozzetti. Pozzetti di controllo del carico con standard di peso molecolare.

Aggiungere anche un volume uguale di un tampone campione XSDS a tutti i pozzetti vuoti per evitare la diffusione delle corsie adiacenti. Ora siamo pronti per iniziare l'elettroforesi su gel. Per far funzionare il gel, collegare l'alimentatore alla cella e farla funzionare a 30 milli pile di corrente costante per una lastra di gel di 1,5 millimetri di spessore.

Dopo che il colorante tracciante blu al mentolo ha raggiunto il fondo del gel separatore, scollegare l'alimentazione. Ora che il gel ha terminato di funzionare, scartare il tampone per elettroforesi e rimuovere la camera tampone superiore con il sandwich di gel attaccato. Orientare il gel in modo che l'ordine dei pozzetti del campione sia noto.

Quindi rimuovere il panino dalla camera tampone superiore e adagiare il panino su un foglio di carta assorbente o carta assorbente. Quindi, con cautela, fai scorrere uno dei distanziatori a metà del bordo del sandwich per tutta la sua lunghezza. Utilizzare il distanziatore esposto come leva per aprire la lastra di vetro, esponendo accuratamente il gel.

Rimuovere il gel dalla piastra inferiore. Taglia un piccolo triangolo da un angolo del gel in modo che l'orientamento della corsia non vada perso durante la colorazione e l'asciugatura. La procedura di elettroforesi su gel è ora completa.

Il gel può ora essere elaborato utilizzando varie procedure di rilevamento delle proteine. Ti abbiamo appena mostrato come separare le proteine usando l'elettroforesi su gel. Quindi questo è tutto.

Grazie per l'attenzione e buona fortuna con il tuo esperimento.