Pull-down di Calmodulina proteine ​​leganti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di testare le proteine che si legano a Cal Modlin in modo calcio-dipendente. Ciò si ottiene raccogliendo prima le proteine di interesse. Successivamente, le velocità sierologiche della calmodulina vengono preparate per il legame con le proteine.

Quindi le proteine vengono incubate con velocità sierologiche di calmodulina. Infine, vengono alluse le proteine che si legano in modo calcio-dipendente. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano proteine che si legano alla calmodulina in presenza o assenza di calcio attraverso l'analisi del sangue occidentale.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti, come la cromatografia calma e l'immunoprecipitazione, è che richiede meno proteine e meno tempo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della segnalazione della modlin della vacca, come ad esempio quali proteine si legano alla modlin della vacca in modo dipendente dal calcio e come le modifiche post-traduzionali possono influenzare il loro legame alla modlin della mucca. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di manipolazione delle perle sono essenziali e la descrizione del resus e della ritenzione delle perle è difficile da seguire senza vederla.

Per preparare il tessuto per l'iniezione omogenea, fette organotipiche dell'ippocampo con un virus contenente un plasmide che esprime la proteina ricombinante di interesse. In questo esempio, la proteina ricombinante è la Neuro Grandin marcata con GFP. Lasciare che il tessuto esprima la proteina durante la notte circa 12-18 ore dopo l'iniezione virale, aggiungere un millilitro di tampone di dissezione a una capsula di Petri.

Trasferire il tessuto coltivato con l'inserto nella piastra di Petri e aggiungere due millilitri di tampone di dissezione all'inserto per immergere il tessuto utilizzando un bisturi. Raccogliere da cinque a 10 fette di tessuto ippocampale organotipico raschiando delicatamente il tessuto dalla membrana dell'inserto con una pipetta da pascolo rovesciata. Trasferire il tessuto sospeso in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Quindi, centrifugare i campioni a 1500 RCF per un minuto. Per separare il tessuto dal tampone di dissezione, rimuovere con cautela il surnatante mediante aspirazione. Assicurarsi di non disturbare il pellet.

Per ogni fetta utilizzata, aggiungere il tessuto a 30-60 microlitri di tampone di omogeneizzazione con una pipetta da un millilitro con una punta tagliata, quindi omogeneizzarlo accuratamente utilizzando un pestello prima di rimettere l'omogenato nella provetta originale. Per rimuovere i detriti cellulari, centrifugare l'omogeneizzato rimanente a 1100 RCF per 10 minuti e raccogliere accuratamente la laccia per aspirazione evitando la contaminazione del pellet. Aliquotare il 10% del surnatante come campione dell'input.

Conservare il surnatante rimanente sul ghiaccio durante la preparazione delle perle di cal sero per l'uso. Successivamente, per ogni pipetta a scomparsa, 400 microlitri di cal Modlin Sero sospeso accelerano in una provetta da microcentrifuga da due millilitri con un fondo relativamente piatto per massimizzare la superficie e l'interazione delle soluzioni con le perle durante le incubazioni, ruotare la provetta per microcentrifuga su un lato per bagnare le perle, quindi centrifugare le perle a 21, 000. RCF per 30 secondi.

E rimuovere con cura il surnatante per aspirazione. Assicurarsi di non disturbare le perle per lavare le perle a 100 microlitri del rispettivo tampone di omogeneizzazione contenente due millimolari di cloruro di calcio per le perle utilizzate per abbattere le proteine leganti la calce cal modlin. O due millimolari E-D-T-A-A noti chelanti del calcio per le perle utilizzate per abbattere le proteine leganti la molina apocale.

Picchiettare delicatamente il tubo su Resus. Sospendere le perle e centrifugare a 1500 RCF per un minuto. Rimuovere con cura il surnatante per aspirazione, facendo attenzione a non disturbare le perle per legare le proteine agli sferoi di calmodulina per l'abbassamento.

Iniziare dividendo lo SNAT in due volumi uguali. A seconda della condizione per aliquota, aggiungere la quantità appropriata di cloruro di calcio o EDTA al supernat fino a una concentrazione finale di due millimolari. Aggiungere il surnatante alle perle lavate nell'apposito tampone di omogeneizzazione.

Picchiettare delicatamente il tubo per mescolare. Incubare i campioni a quattro gradi Celsius per tre ore su un agitatore. Sospendiamo le perline ogni 30 minuti circa per aumentare l'efficienza della legatura.

Quindi centrifugare i campioni a 1500 RC F per tre minuti. Rimuovere 50 microlitri di surnatante come campione di proteina non legata e rimuovere con cura la stalla rimanente mediante aspirazione e gettarla. Lavare le perle tre volte come prima con 100 microlitri dell'apposito tampone di omogeneizzazione.

Il passaggio più difficile in questa procedura è l'elucian delle proteine bersaglio in modo efficiente. Il modo migliore per garantire il successo è utilizzare il giusto tipo di tubo per ridurre al minimo la perdita di perle e risospendere adeguatamente le perle nel riscaldamento del tampone di eluizione. Il tampone di eluizione in anticipo può anche aiutare in modo significativo a eluire la proteina a 50 microlitri di tampone eluciano alle perle.

I campioni che sono stati omogeneizzati e legati in un tampone contenente calcio sono allusi in un tampone contenente EDTA e i campioni che avevano un tampone contenente EDTA sono allusi con calcio. Incubare le perle a temperatura ambiente per 30 minuti su uno shaker. Mescolare le perline picchiettando delicatamente il tubo ogni cinque minuti circa.

Centrifugare le microsfere a 1500 RCF per tre minuti e rimuovere con cura i 50 microlitri di SNAT per il campione di proteina legata mediante aspirazione. Assicurati di non disturbare le perline. Eseguire la pagina SDS e il western blotting per identificare la proteina di interesse come controllo positivo nella condizione opposta.

Proteina Prop Pro nota per legare Cal Modlin. Questa figura mostra un esempio di un test di pull down di Cal Modlin che verifica il legame di Cal MODLIN di GFP TAG Neuro Grandin rispetto al neuro Grandin endogeno. L'input omogeneo mostra che la GFP neuro Grandin è stata espressa in aggiunta alla neuro Grandin endogena e alla chinasi 2 dipendente dalla calmodulina di calcio, come previsto sulla base del legame noto della neuro Grandin endogena.

La Neuro Grandin marcata con GFP è stata allusa in assenza di calcio e non si è legata in presenza di calcio. Al contrario, la chinasi di controllo calmodulina dipendente dal calcio 2 è stata allusa solo in presenza di calcio e non è stata legata in sua assenza. Ciò dimostra che le perle di calmodulina funzionavano correttamente e che l'EEU era efficiente.

Ancora più importante, questo dimostra che il neuro grin GFP si lega ad Apoch Cal Modlin in modo simile alla forma endogena, suggerendo che il tag GFP non altera la funzione di una proteina ricombinante. Una volta padroneggiata questa tecnica, escluse la pagina SDS e l'analisi del sangue occidentale, possono essere completate in sei ore se eseguite correttamente Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di etichettare tutti i campioni e le provette per la condizione appropriata perché qualsiasi cambiamento nella concentrazione di calcio può compromettere l'intero esperimento. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare in modo efficiente la capacità di particolari proteine di legare un modulo CAL in modo dipendente dal calcio.

Raccogliendo le proteine di interesse, incubandole con le velocità SRO comodulanti opportunamente preparate, eludendo le proteine legate e testandole utilizzando l'analisi del sangue occidentale.