Pull-down di Calmodulina proteine ​​leganti

L'obiettivo generale di questa procedura è testare le proteine che si legano alla calmodulina in modo dipendente dal calcio. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo le proteine di interesse. Successivamente vengono preparate le perle di calmodulina per il legame proteico.

Successivamente, le proteine vengono incubate con microsfere di calmodulina. Infine, vengono eluite le proteine che si legano in maniera dipendente dal calcio. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano le proteine che si legano alla calmodulina in presenza o in assenza di calcio mediante analisi western blot.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti, come la cromatografia in condizioni di bassa forza ionica e la precipitazione immunochemica, è che richiede minori quantità di proteina e meno tempo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della segnalazione della cow modlin, ad esempio quali proteine si legano alla cow modlin in maniera dipendente dal calcio e come le modifiche post-traduzionali possano influenzare il loro legame con la cow modlin. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le operazioni di manipolazione delle perline sono essenziali e la descrizione del risospensionamento e del trattenimento delle perline risulta difficile da seguire senza osservarle direttamente.

Per preparare il tessuto per iniezioni omogenee su fettine ippocampali organotipiche con un virus contenente un plasmide che esprime la proteina ricombinante di interesse. In questo esempio, la proteina ricombinante è Neuro Grandin marcata con GFP. Lasciare che il tessuto esprima la proteina per tutta la notte, circa da 12 a 18 ore dopo l'iniezione virale, aggiungere un millilitro di buffer di dissezione in una piastra di Petri.

Trasferire il tessuto coltivato con l'inserzione nella piastra di Petri e aggiungere due millilitri di buffer per dissezione all'inserzione per immergere il tessuto utilizzando un bisturi. Raccogliere da cinque a 10 fette di tessuto ippocampale organotipico staccando delicatamente il tessuto dalla membrana dell'inserzione con una pipetta Pasteur invertita. Trasferire il tessuto sospeso in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Successivamente, centrifugare i campioni a 1500 RCF per un minuto. Per separare il tessuto dal buffer di dissezione, rimuovere con attenzione il soprannatante mediante aspirazione. Assicurarsi di non disturbare il pellet.

Per ogni fetta utilizzata, aggiungere il tessuto da 30 a 60 microlitri di buffer di omogeneizzazione con una pipetta da un millilitro con punta tagliata, quindi omogeneizzare accuratamente utilizzando un pestello prima di rimettere l'omogenato nel suo tubo originale. Per rimuovere i detriti cellulari, centrifugare l'omogenato rimanente a 1100 RCF per 10 minuti e raccogliere con attenzione il surnatante mediante aspirazione, evitando contaminazioni dal pellet. Aliquotare il 10% del surnatante come campione dell'input.

Conservare il surnatante rimanente sul ghiaccio durante la preparazione delle perle cal sero da utilizzare. Successivamente, per ogni saggio di immunoprecipitazione, pipettare 400 microlitri di cal Modlin Sero speeds sospesi in un tubo microcentrifuga da due millilitri con fondo relativamente piatto per massimizzare la superficie e l'interazione delle soluzioni con le perle durante le incubazioni, ruotare il tubo microcentrifuga lateralmente per bagnare le perle e quindi centrifugare le perle a 21.000 RCF per 30 secondi.

E rimuovere con attenzione il soprannatante mediante aspirazione. Assicurarsi di non disturbare i campioni mentre si lavano con 100 microlitri del rispettivo buffer di omogeneizzazione contenente o due millimoli di cloruro di calcio per i campioni utilizzati per l'arricchimento di proteine leganti la calmodulina in presenza di calcio, oppure due millimoli di EDTA, un noto chelante del calcio, per i campioni utilizzati per l'arricchimento di proteine leganti l'apocalmodulina.

Battere leggermente sul tubo per risospendere. Sospendere le perle e centrifugare a 1500 RCF per un minuto. Rimuovere con attenzione il soprannatante per aspirazione, avendo cura di non disturbare le perle per legare le proteine alle sfere di calmodulina per il saggio di pull-down.

Iniziare suddividendo il SNAT in due volumi uguali. A seconda della condizione per aliquote, aggiungere la quantità appropriata di cloruro di calcio o EDTA al soprannatante per ottenere una concentrazione finale di due millimolari. Aggiungere il soprannatante alle perle lavate nel tampone di omogeneizzazione appropriato.

Battere leggermente il tubo per mescolare. Incubare i campioni a quattro gradi Celsius per tre ore su un agitatore. Sospendiamo periodicamente le perle ogni 30 minuti circa per aumentare l'efficienza del legame.

Successivamente centrifugare i campioni a 1500 RC F per tre minuti. Rimuovere 50 microlitri di sopranatante come campione di proteina non legata e rimuovere con attenzione il surnatante rimanente mediante aspirazione, quindi scartarlo. Lavare le perle tre volte come in precedenza con 100 microlitri del rispettivo tampone di omogeneizzazione.

Il passaggio più difficile di questa procedura è l'eluizione delle proteine bersaglio in modo efficiente. Il modo migliore per garantire il successo consiste nell'utilizzare il tipo giusto di provetta per minimizzare la perdita di perline e nel risospendere adeguatamente le perline nel buffer di eluizione riscaldato. Riscaldare preventivamente il buffer di eluizione può inoltre aiutare significativamente. Per eluire la proteina, aggiungere 50 microlitri di buffer di eluizione alle perline.

I campioni che sono stati omogeneizzati e legati in un buffer contenente calcio vengono diluiti in un buffer contenente EDTA e i campioni che contenevano EDTA nel buffer vengono diluiti con calcio. Incubare le perle a temperatura ambiente per 30 minuti su un agitatore. Mescolare le perle picchiettando delicatamente il tubo ogni circa cinque minuti.

Centrifugare le perle a 1500 RCF per tre minuti ed eliminare con attenzione i 50 microlitri di SNAT per il campione di proteina legata mediante aspirazione. Assicurarsi di non disturbare le perle. Eseguire una SDS-PAGE e una western blotting per identificare la proteina di interesse come controllo positivo nella condizione opposta.

Proteina Pro nota per legare la calmodulina. Questa figura mostra un esempio di saggio di immunoprecipitazione con calmodulina per testare il legame della neurograna con etichetta GFP rispetto alla neurograna endogena. Il campione di input omogeneo mostra che la neurograna GFP è stata espressa in aggiunta alla neurograna endogena e alla chinasi II dipendente da calmodulina e calcio, come previsto in base al noto legame della neurograna endogena.

Neuro Grandin marcato con GFP è stato eluito in assenza di calcio e non si è legato in presenza di calcio. Al contrario, la chinasi due dipendente dalla calmodulina calcio-controllata, usata come controllo, è stata eluita solo in presenza di calcio ed è risultata non legata in sua assenza. Questo dimostra che le perle di calmodulina funzionavano correttamente e che le EEU erano efficienti.

È molto importante notare che GFP neuro grin si lega all'apoch calmodulina in modo simile alla forma endogena, suggerendo che il marcatore GFP non ha alterato la funzione della proteina ricombinante. Una volta padroneggiata questa tecnica, escludendo la corsa SDS-PAGE e l'analisi Western blot, l'intero procedimento può essere completato in sei ore se eseguito correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale ricordare di etichettare tutti i campioni e le provette con la condizione appropriata, poiché ogni variazione nella concentrazione di calcio può compromettere l'intero esperimento. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come determinare in modo efficiente la capacità di specifiche proteine di legare un modulo CAL in maniera dipendente dal calcio.

Raccogliendo le proteine di interesse, incubandole con le SRO (ossidi ridotti di silicio) opportunamente preparate come co-modulanti, eluendo le proteine legate e analizzandole mediante analisi immunoblot.