Name: 脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-21T17:00:00.000+00:00
Duration: 22 min
Description: 学ぶ膜タンパク質の脂質中間相結晶化法。Caffreyグループのin meso法を用いて、高品質結晶を作製する手順を解説。構造生物学的研究と創薬設計への応用に役立つ。

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この作業に貢献し、ほとんどがカフリーの膜構造機能生物学研究グループ、両方過去と現在のメンバーからなる人も多い。すべてに私たちは暖かいおかげと感謝の意を表する。この作品は、科学財団アイルランド（07/IN.1/B1836）、国立衛生研究所（GM75915）、およびリムリック大学からの補助金によって部分的にサポートされていました。

<ol><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination.+Use+of+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure determination. Use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallising+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallising membrane proteins in lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phase+diagram+of+the+monoolein%2Fwater+system%3A+metastability+and+equilibrium+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+meso+structure+of+the+cobalamin+transporter%2C+BtuB%2C+at+1.95+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution.</a> J. Mol. Biol. 364, 716-734 (2006).</li>
<li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room+to+move%3A+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+meso+crystal+structure+and+docking+simulations+suggest+an+alternative+proteoglycan+binding+site+in+the+OpcA+outer+membrane+adhesin%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin.</a> Proteins. 71, 24-34 (2008).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li>
</ol>

立方相は、変数の数の変化で大幅に変更することができる繊細かつダイナミックな環境です。それはすべての潜在的な落とし穴を説明するマニュアルモードでのメソ結晶化試験でのセットアップの説明を与えることは不可能である。しかし、多くの困難は、高価なタンパク質溶液に適用する前に技法を実践し、そして混合時に注射器に加えられた圧力に調停を使うことによって回避することができます。正しく行えば、 メソの方法でタンパク質のさまざまな結晶を得ることができる、の数は絶えず増加しています。 メソ結晶化試験でのセットアップがここで与えられた説明は、マニュアルモードに焦点を当てています。プロセスはすることができ、多くの場合、結晶化条件の大規模スクリーニングを必要とするような場合には結晶化プレートの自動セットアップを容易にするために変更されます。

機械加工、独自のナローボアカプラ用*完全な詳細は、参考文献3に記載されています。

脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

脂質中間相を使用して膜タンパク質を結晶化するための詳細なプロトコルが記述されています。このメソッドは、様々に脂質キュービック相としてまたはメソの方法で呼ばれています。メソッドは、X線原核生物と真核生物のタンパク質の結晶構造、単量体であるタンパク質、ホモとヘテロ多量体、発色団含有し、発色団を含まない、とアルファを解決するために使用されているという点で非常に汎用性であることが示されている-ヘリカルとβ-バレルタンパク質。 メソ結晶化に使用しての最近の成功は、人間工学的β2-アドレナリン作動性およびアデノシンA2a Gタンパク質共役受容体である。プロトコルは、モノオレインベースの中間相に膜タンパク質を再構成するため、および手動モードでの結晶化を設定するために表示されている。このような結晶の収穫など、全体的なプロセスの追加の手順は、将来のビデオの記事で対処すべきです。タンパク負荷の中間相を準備するために、手動で結晶化プレートを設定するために必要な時間は約1時間です。

ここで脂質中間相で手動での膜タンパク質の結晶化の試験を設定するにはカフリーの膜構造機能生物学研究グループに実装されたプロシージャが記述されています。

脂質メソフェイズを用いた膜タンパク質の結晶化に関する詳細なプロトコルを記述する。この手法は、さまざまに...と呼ばれてきた。

crystallizing-membrane-proteins-for-structure-determination-using

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

注文した膜タンパク質アレイの形成のために2次元（2D）の結晶化試験を評価すると、電子線結晶学における非常に重要かつ困難な作業です。 90kDa -...

電子線結晶学による構造生物学研究用小型膜タンパク質の二次元結晶化トライアルの評価

プロトコルは、LCP結晶化試験と収穫結晶の設定、LCP - FRAPプリ結晶アッセイで初期条件を見つけることが、脂質キュービック相（LCP）におけるタンパク質の再構成から開始して膜タンパク質の回折品質結晶を得るために不可欠な手順を説明します。...

脂質中間相における膜タンパク質の結晶化

Bicellesは、脂質二重層内での膜タンパク質（MPS）を維持するが結晶化ロボットによるハイスループットスクリーニングを容易にするユニークな相挙動を持っている脂質/両親媒性物質混合物である。この手法は、正常に原核生物と真核生物の両方のソースから高解像度の構造体の数を生産している。このビデオでは、結晶化の試験を設定する（手動でだけでなく、ロボット制御）と媒体から結晶を収穫、bicelle混合物中にMPを搭載した、脂質bicelleの混合物を生成するためのプロトコルについて説明します。...

脂質Bicelle法を用いた膜タンパク質のハイスループット結晶化

本明細書では、高分子のX線結晶構造解析を用いた構造決定に使用するための脂質中間相における膜タンパク質のハイスループット結晶化ロボットのアプローチを説明しています。メソッドに不可欠な粘性及び粘着性のタンパク質を含んだ中間相を扱うことができる3つのロボットが導入される。...

脂質中間相における膜タンパク質のハイスループット結晶化のためのロボットの使用

本明細書では、高分子のX線結晶構造解析を用いた構造決定に使用するための脂質立方相とスポンジで栽培収穫とクライオクールな膜タンパク質の結晶に構造·機能研究グループCaffrey膜で実装されたプロシージャが記述されている。...

高分子結晶学による構造決定のための脂質メソフェーズで栽培膜タンパク質の収穫とクライオ冷却結晶

脂質膜にプロトタイプ電位依存性カリウムチャネルの完全な再構成のための手順が説明されています。再構成されたチャネルは、生化学的アッセイ、電気録音、リガンドのスクリーニングおよび電子結晶学的研究に適している。これらの方法は、他の膜タンパク質の構造的および機能的研究の一般的なアプリケーションを有することができる。...

構造と機能研究のための脂質膜へのKvチャネルの再構築

βバレル外膜タンパク質(OMP)は、グラム陰性菌、ミトコンドリア、葉緑体の外膜内で多くの機能を果たします。ここでは、X線結晶構造解析またはNMR分光法による構造決定に十分な量のβバレルOMPを生成するためのプロトコルを提示することにより、構造研究における既知のボトルネックを軽減したいと考えています。...

βバレル外膜タンパク質の構造決意を目指して - 構築物から結晶へ

X線自由電子レーザーおよびシンクロトロン源での連続結晶学のための脂質立方晶相における膜タンパク質微結晶の調製と送達の手順を説明します。これらのプロトコールは、可溶性タンパク質微結晶の取り込みおよび送達にも適用できるため、液体注入と比較してサンプル消費量を大幅に削減できます。...

準備とシリアルフェムト秒結晶学のための脂質立方相におけるタンパク質微結晶の配達

脂質単層は、構造研究のための2次元(2D)タンパク質結晶を形成するための基礎として何十年も使用されてきました。それらは空気水の界面で安定しており、電子のイメージ投射のための薄い支持材料として役立つことができる。ここでは、生物学的研究のための脂質単層を調製するための実証済みのステップを紹介します。...

電子結晶学研究のための脂質単層法を用いたサンプル調製

このプロトコルはステロールの運送者ABCG5/G8の結晶化のための組み立てを記述する。ABCG5/G8は、ハンギングドロップ結晶化のためにバイセルに再構成されます。このプロトコルは特殊な材料や基質を必要としないため、X線結晶構造解析によってタンパク質の構造を決定するために、あらゆる実験室でアクセスしやすく、簡単に適応できます。...

脂質バイセル環境下でのABCG5/G8結晶化によるX線結晶構造解析

学ぶ膜タンパク質の脂質中間相結晶化法。Caffreyグループのin meso法を用いて、高品質結晶を作製する手順を解説。構造生物学的研究と創薬設計への応用に役立つ。

脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

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