脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

Membrane Structural and Functional Biology Groupへようこそ。私の名前はマーティン・カフェリーです。私たちの研究の焦点は、最初のスライドにその概略図が示されている生体膜であり、細胞内小器官と細胞内小器官を囲む膜は、分子的に薄い構造であり、わずか2つの脂質分子が横切ってタンパク質がちりばめられています。

私たちは、脂質とタンパク質の両方に適用される構造と機能に興味を持っています。ただし、このJOシリーズでは、膜タンパク質に焦点を絞ります。私たちは、これらの膜タンパク質が分子レベルでどのように機能するかを理解しようとしていますが、これには2つの理由があります。

まず、何かがどのように機能するかを知ることに知的満足感があります。第二に、自転車や車と同じように、それがどのように機能するかを知ることで、誤動作した場合にそれを修正できる可能性があります。ドラッグデザインは、この種の仕事の明らかな成果です。

膜タンパク質が分子レベルでどのように機能するかを理解するために私たちが取っているアプローチは、その結晶構造を決定することです。これには、タンパク質を構成するすべての原子、または少なくともすべての非水素原子の3次元空間での位置を確立することが含まれます。この目的のために使用する方法は、略して高分子X線結晶構造解析MXと呼ばれます。

ここでは、MXを使用して構造がMXを使用して決定された膜タンパク質の例を示し、そのタンパク質の結晶がmxを行うために必要です。ご想像のとおり、図に示すように、高分子結晶構造解析を使用した構造化された決定には多くのステップが関与しています。ここは。通常、これらには、膜タンパク質標的の同定、およびそれの生成、精製、および結晶化が含まれます。

回折測定は、家庭用またはシンクロトロンX線源を使用して結晶に対して行われます。回折データを処理して電子密度マップを作成し、分子モデルでフィッティングします。このモデルを改良すると、タンパク質の作用機序を探求し、構造ベースの薬剤設計に使用することができます。

この記事のこのJOの焦点は、いわゆるインメソ法による脂質メソ相を使用して、膜タンパク質の画分品質の結晶を生成する方法を示すことです。この方法とその範囲に関する最近のレビューは、参考文献1で入手できます。ここで従うステップバイステップのプロトコルは、エンドメゾン膜タンパク質結晶化試験の設定に必要なステップと所要時間をまとめたフローチャートを参照して説明されています。

このビデオでは、赤い破線で囲まれた手順について説明します。手動モードでのメソ結晶化で行う必要がある項目をここに示します。それらは、宿主成分を作製するための精製膜タンパク質脂質の濃縮溶液を含み、通常は脂質をより明白にするためのモノオールを含む。

このビデオでは、赤色染料沈殿剤溶液、精製水パイプペッティングデバイス、使い捨てチップ、ガスタイトハミルトンシリンジの品揃え、一部には取り外し可能な針、タンパク質溶液と脂質を混合してミームを生成するために使用される狭口径カプラーがドープされています。ハミルトンガラス顕微鏡スライドとカバースリップのリピーティングディスペンサー。井戸作成ピンセット、欠けた氷のティッシュ、電卓、そして最も重要な実験ノート用の理想的にサイロ化された穴あきダブルスティックスペーサーテープ。

次の手順を使用して、ガラスサンドイッチ結晶化プレートを調製します。ローディングには、サイロ化された顕微鏡スライドをベンチに置きます。穴あきダブルスティックスペーサーテープのストリップの片面から保護紙カバーを取り外します。

粘着テープを下にして、スライド圧力の表面に接触させます。テープをスライドに密封します。ブレイヤーまたはローラーを使用して、テープとローラーの間にアルミホイルを配置して、ウェルのベースを保護できます。

テープから2番目の紙カバーをはがして、上部の粘着面を露出させます。この手順により、積み込みの準備ができているガラス板が生成され、積み込みが完了するとすぐに天井が天井になります。個々のサイロ化されたカバーは、プレートのすぐ近くで滑り、ウェルの天井を迅速かつ効率的にします。

脂質を摂氏45度の温度制御ブロックに3分間置き、溶融させます。使用される脂質は通常、モノランドであることに注意してください。このビデオでは、脂質が溶けている間、脂質が見えるように赤い染料が追加されています。

100マイクロリットルのガスタイトハミルトンシリンジを2台用意します 脂質タンパク質の混合ステップでは、タンパク質溶液を含むシリンジからテフロンファーオイルを取り除きます。脂質を保持するシリンジをその隣に置きます。この場合、falはそのまま残ります。

ナローボアカプラーを2つのシリンジの間に置き、カプラーを脂質シリンジフィンガーに接続します。カプラーをシリンジに締めますが、締めすぎないでください。脂質シリンジのバレルからプランジャーを取り外します。

脂質が溶けていることを確認してください。ピペットを30マイクロリットルに設定し、30マイクロリットルの溶融脂質キャップをゆっくりと取ります。脂質バイアル。

脂質は、摂氏マイナス80度の窒素またはアルゴンの下に保存する必要があります。彼ができるだけ多くの溶融脂質を注射器の開放端にゆっくりと送達します。エアギャップを生じさせないように注意してください。

プランジャーを溶融ヒョウと接触するバレルに置き、シリンジを垂直に保持した状態でプランジャーをゆっくりとバレルまで進めます。図のように、うっかり閉じ込められた気泡は、その過程で上昇し、放出されます。現在、バレルには溶融脂質のプラグがあり、その容量を正確に決定する必要があります。

これは、シリンジバレルのマーキングを読み取ることで実行できます。この場合、容量は23マイクロリットルで、これは実験ノートに記録されています。カプラーから伸びる針にファーをスライドさせます。

プランジャーを使用して、溶融した脂質をバレルに押し上げ、カプラーの中心部にある針にゆっくりと穏やかに押し込みます。針がわずかに過剰に充填されている場合、脂質はその開放端で打ち出されているのが見えます。プランジャーをわずかにバックアップすることで、余分な脂質をカプラーに引き込むことができ、カプラーの針の先端とちょうど同じ高さになります。

この場合、シリンジカプラーユニットはフル装備で、タンパク質シリンジと組み合わせる準備ができています。溶液を14, 000Gで10分間、摂氏4度で5〜10分間回転させて、大きな凝集体を除去する必要があります。結晶化試験を設定する前に、氷のバケツからタンパク質溶液を取り出し、室温で平衡化します。

タンパク質の量を計算するので、オリアンの20°Cの完全な水和またはそれに近い立方体相を形成するために使用する溶液。水による完全な水分補給は、状態図のように重量の40%近くの水で行われます。脂質注射器に23ミリグラム/マイクロリットルの密度で0.94ミリグラムのモノラルを装填したことを思い出してください。

これは脂質の21.6ミリグラムに相当し、したがって、21.6倍4を6または14.4ミリグラムまたは14.4マイクロリットルのタンパク質溶液で割ったものが必要であり、25または50マイクロリットルのハミルトンシリンジは必要な量のタンパク質溶液を取り、タンパク質溶液のバレル内のプランジャーのテフロン先端に溶液を移します。気泡を避けながら、針を慎重に引き抜き、シリンジ内のタンパク質溶液の量を測定します。これは、前の手順で提供された値と一致する必要があります。

脂質をロードしたシリンジと組み合わせるための準備として。タンパク質溶液を慎重にバレルにインチして、その開放端と同じ高さになるようにします。これは、バレル終端端から見下ろすことで観察できます。

リピンタンパク質溶液、ロードされたシリンジは、Mexがこれを行うための準備として結合する準備ができており、タンパク質シリンジを脂質シリンジに取り付けられたカプラーの開放端にねじ込みます。カプラーを介して2つのシリンジを組み合わせました。一方のシリンジの脂質からカプラーを通ってもう一方のシリンジのタンパク質溶液まで、連続した量の液体が存在する必要があります。

攪拌の準備として、組み立てられたユニットは、片方の注射器を右手に、もう片方を左手に持って、片方のユニットに保持されます。トルクは、両手の指と親指を使用して、カプラーの溝に対するシールが締め付け時に無傷のままであることを確認して、カプラーを介して両方のバレルに加えられます。この段階で組み立てられた混合装置は、ALSを損傷し、締め付けの下で漏れを引き起こし、漏れにもつながります。

避けられない試行錯誤と時折のサンプルの損失を伴う経験の問題です。したがって、脂質と水または緩衝液を使用してシステムの感触をつかむために、貴重なタンパク質溶液を使用して混合に影響を与える前に、親指または人差し指でタンパク質溶液をタンパク質シリンジからカプラーを介して脂質シリンジに駆動し、組み立てられた混合ユニットのタンパク質側のプランジャーを限界まで進めます。ユニットが効果的に密閉されている場合、この動作により、脂質側のプランジャーが等しく反対の動きをします。

脂質側のプランジャーは、脂質シリンジの内容物をコラーを通ってタンパク質シリンジに戻すために使用されます。このプロセスは何度も繰り返されます。場合によっては、均質なミサ相を生成するために 100 以上のパッセージが必要になります。

混合の開始時には、カプラーを通る材料の前後の動きが不均一になる可能性があり、混合を行うために余分な力が必要になることがあります。これは予想されたことです。初期混合は通常、サンプルに不均一な曇りの発生を伴い、再び予想されます。

均質化が進むにつれて。プランジャーを前後に動かすのに必要な力によって感知されるテクスチャーは、出現する立方晶相の視覚的外観と同様に、ビスカス立方晶相により均一で特徴的になります。条件が適切で、立方晶相が形成される場合、分散液はシリンジバレル内で光学的に透明に見えるはずです。

したがって、シリンジバレルのマーキングは、バレル内のメソフェーズを通じてはっきりと読み取ることができる必要があります。着色タンパク質の場合、メソ相はタンパク質の色を持ちますが、光学的には透明になります。シリンジミキサーを氷上に短時間置くことにより、混合中にサンプルをごくわずかに冷却すると、均質化と透明性の達成が促進されます。

ただし、過度に激しい混合を避けるため、摩擦加熱によりサンプルの温度が上昇する可能性があるため、サンプルを過度に考慮しないように注意することが重要です。この時点で、キュービックミサ相が形成され、タンパク質が脂質ブレーに再再構成されます。これで、ミサ相を結晶化プレートの個々のウェルに分注する準備が整いました。

ただし、最初に、メソフェーズをリピーティングディスペンサーに取り付けられた10マイクロリットルのハミルトンシリンジに移す必要があります。このプロセスは、シリンジをディスペンサーに薄く結合することから始めます。シリンジにキュービックミーズをセットします。

針とプランジャーをシリンジから取り外します。テフロンファルはそのままにしておきます。小さなコインを使用して、ディスペンサーから保持ナットを取り外します。

ラチェットアームを完全に引き抜いた状態で。プランジャーと針なしでシリンジをディスペンサーの保持リングに挿入します。シリンジに面した保持結び目ガスケット側を元に戻し、シリンジの開放端にしっかりとねじ込みます。

シリンジが保持リングの中央に適切に配置され、バレルがラチェットアームと平行に位置合わせされていることを確認するように注意する必要があります。どちらもI.These 2つの要件は、プランジャーが自由に動作しない場合、負荷中にソースシリンジに圧力が蓄積し、漏れが発生する可能性があるため、重要です。グリッパーナットでプランジャーをグリップリングに通し、数回転緩めてプランジャーをシリンジの開放端に導きます。

ラチェットアームを押してプランジャーをバレルに完全に動かし、プランジャーがバレル内を自由に移動し、バレル内を通り抜けることを確認します。ネジとガイドバーが緩んでしまった場合は、締め直し、プランジャーが自由に動くことを確認し直してください。分注シリンジの装填準備が整いました。

組み立てたミキシングユニットの片側にあるプランジャーをゼロマイクロリットルの目盛りマークに移動します。メソ位相をもう一方のシリンジとカプラーに移します。ULが所定の位置に設置された空のシリンジをミキシングユニットから外し、ロードされたシリンジを10マイクロリットルのディスペンシングシリンジのネジ式終端に取り付けられたカプラーにすぐに接続します。

カップリングの気密性は非常に重要です。すでに述べたように、100マイクロリットルシリンジのプランジャーを押し下げて分注シリンジを装填し、メソ位相がカプラーを介して移動するようにします。カップリングがきつく、分注シリンジのプランジャーが自由に動作する場合、分注シリンジが充填されると、プランジャーはローディングプランジャーの運動方向に移動し始める必要があります。

カプラーを取り付けた状態でローディングシリンジをディスペンシングシリンジから外します。短くて平らな先端の針を分注シリンジのスチール終端に固定し、所定の位置に慎重に締めます。.clamp グリップリングの結び目を締めて、プランジャーをラチェットアームに取り付けます。

結び目を締めすぎないように注意する必要があります。これにより、プランジャーが傷つき、変形して使用できなくなる可能性があるためです。クランプ状態でラチェットアームに提供される移動範囲は、1インチ以下に制限することが重要です。

これを超えて示されるように、プランジャーは座屈する傾向があり、配送が失敗する可能性があります。Lはラチェットドラムを数回押し下げてバレル内のプランジャーを進め、それによって針の空隙量を埋め、針をロードします。この手順は、針の先端からメサ相の連続したストリングが出てくるまで、最大10回繰り返す必要があります。

これで、針は結晶化試験の設定に使用できるようになり、すぐに開始する必要があります。結晶化試験を設定する前に、タンパク質をロードした立方体相を長時間保持することはお勧めできません。一部のタンパク質は、沈殿剤を添加しないと立方晶相で不安定になるため、マルチウェル結晶化プレートとカバースリップを表面に置き、ローディングを容易にするためにベンチから数インチ高くします。

最適なコントラストと視認性の向上は、表面がわずかに暗いときに達成されます。沈殿物溶液を均質化し、バイアルのキャップを外します。分注シリンジを片手で垂直に保持し、沈殿物分注支柱を1マイクロリットルに設定し、フリーハンドを使用して針先をウェルの基部の中央と真上に配置します。

ナンバーワン。リピーティングディスペンサーのディスペンのボタンを押して、ガラス面にミーズのボーラスを排出します。ボーラス容量は200ナノリットルです。

標準的なリピーティングディスペンサーを10マイクロリットルのシリンジで使用する場合、針の先端はウェルの基部から数百マイクロメートル以上上にないはずです 適切な送達を確保するためには、再現性のある送達が容易に達成されます。少し練習するだけです。隣接する4つのウェルにミーズを充填した後、各ミーズボーラスの上に1マイクロリットルの沈殿液を置きます。

特許および標準的な使い捨て可能な先端ごとの2マイクロリットルをできるだけ早く使用して、水密シールの効果のためにそれらを均一に覆うために満ちた井戸の上にカバーのスリップを直角に置く。へらを使用して、スペーサーテープの露出したスティック粘着面に接触するカバースリップに圧力をかけます。ミーズと沈殿剤の分注プロセスは、プレート上のすべてのウェルがロードされ、密封されるまで繰り返すことができます。

これで、プレートの検査とインキュベーションの準備が整いました。追跡のためにプレートに明確にラベルを付けます。感光性タンパク質は通常、プレートをインキュベーションチャンバーに入れる前にアルミホイルで包むことによって処理されます。

これらは取り外して、控えめなまたは適切な色の光で顕微鏡で調べることができます。プレートを通常摂氏20度前後の温度制御されたチャンバーに定期的に置きます。10倍または20倍に合った偏光顕微鏡を使用して、壁の結晶成長を検査します。

目的は、著者の研究室で使用したスケジュールは、0 1 2 3 5 7 14 21 30 postセットの日です。ミーズボーラスを注意深く検査します。.厚さ140ミクロンのサンプル内の焦点深度を調整します。

検査は、通常の光と交差した偏光子、通常の光で見たときに立方晶相で成長する無色の膜タンパク質結晶との間の両方で行う必要があります。こんな感じ。偏光で見るとメソに生えている無色の膜タンパク質結晶は、通常の光で見るとメソに生えている天然色の膜タンパク質は、これやこれに見えます。

構造化された決定の全体的なプロセスにおける次のステップは、結晶を回収して凍結冷却し、結晶からのX線回折を記録して処理することです。これらのトピックについては、このシリーズの別の JoVE 記事で取り上げています。