電子線結晶学による構造生物学研究用小型膜タンパク質の二次元結晶化トライアルの評価

この手順の全体的な目標は、電子結晶構造解析による膜タンパク質の構造決定に最適な2D結晶化条件を特定することです。これは、まず精製中に適合する界面活性剤を使用して、天然の脂質二重層からタンパク質を可溶化することによって達成されます。手順の2番目のステップは、外因性脂質を追加し、タンパク質脂質界面活性剤混合物の透析によって界面活性剤を除去することであり、慎重に制御された条件下で2D結晶が得られます。

手順の3番目のステップは、サンプルをフラッシュして凍結してガラス質の状態にすることです。手順の最後のステップは、クライオemによるデータの収集です。最終的には、データの計算画像処理を通じて、タンパク質の最終的な構造をもたらす結果を得ることができます。

こんにちは、研究室から来ました。私は e ジョージア工科大学の生物学部。こんにちは、私はティナ

私はジョージア工科大学の化学・生化学学部のベリー研究室と生物学部のシュミット・クレイ研究室の出身です。ジョージア工科大学生物学部のイングルボルグ・シュミット・クライ研究室のマット・ジョンソンです。今日は、emによる2D合唱試験の評価手順を示します。

私たちの研究室では、このプロトコルを使用して、2D結晶化条件を特定し、最適化しています。では、始めましょう この手順を開始するには、カーボンコーティングされた400メッシュの銅透過型電子顕微鏡またはTEMグリッド上にネガティブ染色されたサンプルを準備します。プロテアリポソームサンプルの2マイクロリットルをカーボンで覆われたTEMグリッドの下でピペットで移動し、60秒間インキュベートします。

サンプルが均等に分布しない場合は、ピペットチップの側面でそっとスワイプします。次に、端から破れたワットマンナンバー4の濾紙でブロックします。これにより、プロテアリポソームを過度に除去することなく液体を最適に除去し、繊細な炭素膜を保存するのに役立ちます。

ブロッティング直後。30秒後に1%酢酸小便器の染色液を2マイクロリットル塗布し、グリッドの端から吸い取ります。繰り返しになりますが、サンプルに高濃度の高濃度のグリセロールまたはスクロースが含まれている場合は、通常は10〜20%の範囲で、ネガティブ染色の前にグリセロールまたはスクロースを含まないバッファーでグリッドを数回洗浄すると、小便器テート溶液による適切な染色を可能にするのに役立ちます。

グリッドが準備されたら、電子顕微鏡を使用してサンプルを低倍率で視覚化し、膜の発生分布と形態、および全体的なグリッド品質を評価します。次に、高倍率を使用して画像を取得し、画像のRIA変換を実行して2D結晶を識別します。電子顕微鏡サンプルホルダーで低グリッドを開始するには、平均膜分布の第一印象を得るために、2000〜10, 000 xの中間倍率を使用します。

膜の分布範囲、その形態、およびサイズを実験ノートに書き留めます。CCDカメラで代表的なビューを記録します。次に、必要に応じて、約400〜800 xの範囲の低倍率でサンプルを観察し、グリッドの概要を把握します。

これにより、サンプル濃度、不均一なプロテア、リポソーム分布、およびカーボン膜の部分的な破損の問題を明らかにすることにより、グリッド調製を評価するための貴重な情報を提供できます。低倍率または中倍率でグリッド状の関心領域を特定します。次に、高倍率を使用して、さまざまな膜で可能な順序を評価します。

これは、2D結晶化試験の初期段階では重要です。整然とした領域を持つ有望なプロテアリポソームを特定し、後の実験で再現性を検証するために、2D結晶をスクリーニングするための最適な高倍率設定を決定するには、50, 000から60, 000 xの間の倍率で開始します。2D結晶の寸法と単位セルサイズに応じて、高倍率設定は30, 000まで下げるか、80, 000まで上げることができます。

ここでは、隣接する場所で、関心のある画像領域に対して、関心領域が実際に膜であるかどうかが不確かな場合は、約マイナス400ナノメートル以上で焦点をぼかします。サンプルに、カーボンフィルム、MICA、またはプロテアリポソームと間違えられる可能性のあるその他のアーティファクトの破片がないか検査します。また、典型的な膜の折り畳みと形態を識別するために、エッジを観察します。

次に、CCDカメラで対象領域を検査します。最適な高倍率設定でCCD画像を収集することにより、CCD画像自体の視覚的評価では、より小さい、またはほとんど疎水性の膜タンパク質の格子を観察できない場合があります。この場合、画像全体がオンラインの foer transform または ft に使用されます。

ただし、順序付けられた配列が小さい場合、このFTには大量のノイズが含まれ、信号対雑音比を改善し、ボックス化された画像サイズを縮小し、縮小されたボックスを画像上に移動し、ライブFTを実行して、順序付けられた配列を最適に識別するためにライブFTのガンマ関数を調整します。ガンマ値が高すぎると、ノイズの影響でスポットが不明瞭になる可能性がありますが、値が低すぎると、弱いスポットが特定されなくなります。ネガティブに染色された2D結晶の分解能は、マイナス400ナノメートルのDFOで約15オングストロームになると予想してください。

1〜3桁のスポットを特定することを期待してください。スポットとモザイクの鮮明さに注意してください。18キロダルトンの小さな膜タンパク質の2D結晶は、最大で数ミクロンの大きさです。

FTS上のスポットは、ライブFTボックスの鋭く識別しやすい動きは、格子がモザイクなしで連続していることを示しています。T-E-M-C-C-D画像コレクションの小さな画面で、より広範な可溶性ドメインを持つより大きなタンパク質の格子を同定でき、FTは、無秩序なプロテアのFTのモザイクノイズなどの特性を含む格子品質をより良く評価するために必要です。リポソームは、そのスポットが小さなタンパク質の2D結晶によるものなのか、ノイズによるものなのかを判断するために、弱いスポットと間違われることがあります。

ライブフィートのボックスを移動します。スポットがすぐに消える場合はノイズですが、小さな領域でも変化しない場合は、脂質結晶が明確な形態とftを示すため、結晶が存在する可能性があります。これらの脂質結晶は、画像の目視検査と一貫した単位セルサイズによっても認識できます。

初期試行では降水が発生する可能性があります。高倍率での検査は、タンパク質の沈殿と脂質凝集体を区別するために使用されます。脂質凝集体の場合、再構成が実際に発生した可能性があり、次の実験では、30,000〜50,000 xで再構成を誘導するのではなく、膜サイズを大きくして秩序を生み出すために必要なパラメータの調整のみが必要になります。

これらの暗い構造のエッジは、それらがタンパク質を含まない膜で構成されていることを示しています。最適な条件下での沈殿サンプルには、2D結晶が大部分含まれます。データ収集のために最大かつ最も秩序ある2D結晶が視覚的に選択されるため、膜の均質な外観を目指す必要はありません。

これらのタイプのサンプルは、結晶化してクライオEMデータ収集に使用し、高解像度の画像の最大数をもたらすと、簡単に認識できます。この手順を行う際に、TEMによる小さなメモリタンパク質の2D結晶のスクリーニング方法のみを示します。この時点までにすでにかなりの時間と労力を投資してきたため、有望な結晶化条件を見落とさないように徹底することを覚えておくことが重要です。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。