Name: 電子線結晶学による構造生物学研究用小型膜タンパク質の二次元結晶化トライアルの評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学ぶ 電子線結晶学による小型膜タンパク質の二次元結晶化条件の最適化手法。デタージェント可溶化、脂質添加、透析結晶化、クライオ電子顕微鏡による構造解析のプロセスを理解できます。

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我々は我々の方法に関連する経験と観察のいくつかに貢献し、貴重なタンパク質サンプルを、提供するための私達の協力者に感謝する。ギュンターSchmalzingは親切にこのプロジェクトに参加するFRする機会を提供した。バーバラArmbruster氏、ヤコブブリンクとデリックミルズは、その卓越したヘルプや機器の入力のために感謝されています。資金は、NIHの助成金HL090630によって提供されていました。

1。二次元結晶化トライアルのグリッドの準備<ol><li>炭素でコーティングされた400メッシュ銅EMグリッドは負染色することによって調製される。酢酸ウラニルは、頻繁に使用され、長期的なグリッドの長期保存のための使用だけでなく、適合性の前に数ヶ月のためのソリューションのストレージの条件で染色を提供しています。対照的に、このようなウラニルギなどの他の負の汚れ、優れた染色を提供している間は、新鮮な1を行う必要がある。二次元結晶化試験のスクリーニングに使用されるグリッドの多数の高速な準備作業については、ネガティブ染色を変更したバージョンが使用されます。サンプル2μLの体積は、炭素で覆われたEMのグリッド上にピペットで、60秒間インキュベートする再び30の後、グリッドの端からブロットされ、直ちに適用され、その後、1％酢酸ウラニルの2μL、これをWhatman＃4ろ紙（ビデオ図1）の破れた部分とエッジからブロッティングが続きます。 S.ろ紙の破れたエッジとリム上のグリッドに触れると、プロテオリポソー​​ムを除去することなく液体の最適な除去を保証します。さらに、グリッドの端に乾燥には炭素膜の改良維持を保証。繊細な炭素膜の破損がサンプルの付着を防止し、サンプルの不正確な表現につながることができるようにケアは、準備とグリッドの取扱いに注意する必要があります。 5μLの伝統的に大規模なサンプルの量があったと日常的にグリッドの準備のために使用されていますが、貴重なサンプルを2μLまたは2以下にボリュームを削減することで保存することができます。 </li><li>可能な限り最大の膜を生成するために、我々のサンプルのいくつかは、グリセロールまたはショ糖の高濃度（10-20％）が透析緩衝液中に存在する必要があります。グリセリンまたはスクロースが高粘度であり、適切にバッファを貫通するから酢酸ウラニルを防ぐため、不完全膜を染色するので、これは、グリッドの準備にマイナスの影響を持つことができます。したがって可能な格子が不明瞭になります。バッファーはグリセロール/ショ糖を含まないバッファ（図示せず）によってサンプルと交換の遠心分離によって交換することができる、またはグリッドが似てネガティブ染色の前に数サイクルに1つのバッファまたはグリセロール/ショ糖を含まない緩衝液で洗浄することができるのどちらかクライオEMは3,4で使用される手法。 </li></ol> 2。 EMによる二次元結晶化トライアルの評価<ol><li>試料ホルダーのタイプに応じて、いずれかまたは複数のグリッドがロードされます。中間倍率としてここに呼ばれる2 - 10K、の倍率は、実験ノート5の中のメモを取られている膜、形態、サイズ、の分散の平均の分布と程度の第一印象が可能になります。 CCDカメラはフィルムで、利用できない場合、適切な領域は、CCDカメラの助けを借りて、代表的な概要として記録またはされています。 </li><li>約400 - 800 ×の範囲の低倍率は、全体のサンプルの概要/グリッドが望まれる時間に使用されます。両方否定的染色およびカーボン膜、グリッド上のサンプルの濃度、および場合によっては不均一なプロテオリポソー​​ム分布の潜在的な部分的な破損：すべてのグリッドで採用されていないが、低倍率では、いくつかの側面の面でグリッドの準備の評価の助けの貴重な情報を提供します。個々のグリッドの四角形は、双眼鏡やCCDカメラで表示される場合があります。一部のEMSとは、より高い倍率で、後で検査のためにリコールすることができる特定の興味のあるポジションを、保存することが可能です。 </li><li>興味のグリッド領域が低いか中間倍率で識別されると、倍率は約50K - 60Kに変更されます。膜、水晶とユニットセルのサイズに応じて、既知の場合、として30Kと低いと80Kという高倍率が使用されている。 30 - 80Kの倍率の範囲は、2次元結晶のスクリーニングの目的のために高倍率と呼ぶことにする。焦点は、低用量のセットアップ、画像/写真の設定に続いてスイッチ付き、または関心のある領域の近傍でのフォーカスの設定のいずれかで発生します。 <ol class="lalpha"><li>関心の領域が実際に膜であるかどうかのあいまいさのケースでは、サンプルはプロテオリポソー​​ムの大きさの炭素フィルム、マイカ、またはその他の成果物のために検査されます。この目的のために、エッジは典型的な折りたたみや形態を明らかにする。 </li><li>今関心の領域がCCDカメラで検査されます。 CCDイメージは30K - 80K膜のサイズに応じて倍率、、タンパク質または単位セルサイズ、または既知の結晶性の領域で収集されます。小規模および/または主に疎水性の膜タンパク質の格子は、CCDの画像自体の視覚的評価では必ずしも表示されません。どちらかの全体像は、オンラインフーリエ変換（FT、または高速のFT - FFT）に使用されます。順序付き配列が小さい場合は、このFTは、しかし、ノイズのかなりの量が含まれます。このように、縮小箱入り画像サイズはSmaIでの改善された信号対雑音比が可能になりますLER結晶と容易に識別。この目的のために、ボックスは画像の上に移動され、ライブFTが評価されます。 ビームの強度/輝度は低用量サンプルの条件だけでなく、心のCCDカメラの設定を維持する調整されます。使用されるCCDカメラによっては、ライブFTのガンマは、順序付けられた配列の最適な識別のために調整されます。過度に高い値は、ノイズの寄与に起因するスポットを隠蔽したりすることができます、そして過度に低いガンマ値が識別されるから弱いスポットを防止します。これらの弱い点はほとんどノイズレベルよりFTの斑点のある小さな結晶配列が原因である可能性があります。 より高い分解能でデータをサンプル6の少数の収集されているが、一般的にネガティブ染色2D結晶の分解能に制限されたり、およそ15Aの解像度よりも優れていると想定してはいけません。約-400 nmのデフォーカスで、斑点のない以上の1から3までの注文が簡単に識別できることが期待されています。サンプルは一般的に低温電子顕微鏡データの収集が達成可能な最高解像度の適切な指示を与えるとして、解決のために評価されません。スポットと可能mosaicityのシャープネスはも記載されています。 </li></ol></li><li>異なる膜だけでなく、膜の形態は、高倍率での順序のために評価されます。小さいのではなく、大きなプロテオリポソー​​ムまたは膜のパッチが最も有望な分野を含むことができるので、これは、最初または2次元結晶化試験の中間段階では特に重要です。 2次元結晶の非常に低い割合では、順序付けられた配列の最初の同定以来、多数の画像の画像取得とFT、または光学回折は、頻繁にサイズと品質2,4,7の急速な向上につながることが必要になります。 </li></ol> 3。代表的な結果理想的に順序付けられたプロテオリポソー​​ムは容易に認識可能な、シャープなスポットを表示する。大と規則正しい結晶は容易にCCDの画像や顕微鏡写真の光学回折のオンライン- FTによって識別されます。 例のサイズは数ミクロンまでである18kDaの小さな膜タンパク質の2次元結晶を示しています。 FT上のスポットを簡単に識別し、シャープされています。ライブ- FTのボックスの動きは、格子がmosaicityなしで連続であることを示しています。より広範な可溶性ドメインを持つ大規模タンパク質の格子は、EMの小さな画面上で識別することができます。 CCDイメージコレクションとFTは、より良い評価の手段を提供すると、例えば、可能な限りmosaicity（ショーFT）の情報を得ることが必要である。順序付けされていないプロテオリポソー​​ムのFTを計算する場合、ノイズは、最初のスポットと誤解することができます。ライブ- FT用のボックスが移動させながら、しかし、斑点が表示されなくなります。一方、小規模のアレイは、不審な結晶で、ライブFTが画像領域上にもわずかに移動するときに静止して、残りの自分の斑点を持つことになります。さらに、これらの小さな結晶は、通常、同一のユニットセルサイズを持つことによって認識することができる、と別のFTSでスポット間の距離は、特定の大きさの円を持つなど、様々な方法で測定することができます。脂質の結晶は、異なる格子の形態とFTが表示されます。 それは初期の試験で降水量が発生することも珍しくありません。ここに再構成せずにタンパク質沈殿はいえ、小さな脂質凝集体と区別する必要があります。低倍率で析出されているように見えるサンプルは、頻繁に高い倍率で見た場合の脂質凝集体であることが判明する。 30 50Kでの検査時には、これらの暗い構造のエッジは、それらが蛋白質の無降水量を有する膜で構成することが明らかに。脂質凝集体は、以下の実験で大規模な膜にサイズを大きくする可能性があるので、これらは重要な観察である。 サンプル評価の悪い結果は、しばしば適切かつ高速なスクリーニングを防ぐ低膜濃縮に接続されています。これは、頻繁に透析の2次元結晶化のための高タンパク質濃度を使用することで克服することができる。また、膜は、貯蔵中のエッペンドルフチュー​​ブの下部に数日間のために解決するために残すことができます。いくつかのケースでは膜の急速な、またはほとんどインスタントセトリングが発生し、チューブの底からペッティングすれば、グリッド上でより高い膜密度になります。別のはるかに高速のオプションは、チューブの底からの後続のサンプリングとサンプルの遠心分離（1〜3分間3000から8000 rpmで）です。 最適な条件下でのサンプルは、2次元結晶の大部分が含まれます。それは最も大きく、最もよく秩序2D結晶がデータ収集のために視覚的に選択されているように、膜の均質な外観を目指す必要はありません。サンプルはのために使用されている場合、結晶化試験は同様に繰り返されている場合、サンプルのこれらのタイプは簡単に認識されます。高解像度の画像の最大数は、結果として低温電子顕微鏡データの収集、。 <img src="/files/ftp_upload/1846/1846fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1この図は、ワットマンの破れた部分第4濾紙でグリッドの端をブロッティングを示しています。

<ol><li>Johansen, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+field+electron+microscopy+of+biological+specimens+V.+A+low+dose+pre-irradiation+procedure+reducing+beam+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage.</a> Micron. 7, 145-156 (1976).</li>
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<li>Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).</li>
</ol>

サンプルの適切な評価は、膜の十分な数の慎重な評価が必要です。例えば、180以上の画像化されたプロテオリポソームの外のような低％2などの結晶配列を持つ試料は二次元結晶化の条件7の迅速な最適化のための重要な情報を与えた。 タンパク質の時折部分的沈殿が発生したものの、タンパク質の沈殿が発生すると、グリッドは、低倍率での検査の後、さらにスクリーニングから放棄される可能性があります。 100nm未満のさえ非常に小さな膜はいえ順番に関する有益な情報を与えることができる、と二次元結晶のサイズを大きくするためのパラメータは、次の透析実験で実装することができます。 研究所では、スクリーニング8,9のプロセスに有望な自動化の様々な程度の導入を進めています。ここで概説されてまだサンプルはまだ二次元結晶のサイズ、形態、およびオーダーの評価と知識の手順が必要になります。将来的には、これらのスクリーニングの手順、さらに重大な小さな結晶性の領域のより困難な評価を行う、より高い解像度にますます小型2次元結晶のデータ...

<table><tbody><tr><td>カーボン膜コーティング済み400メッシュ銅製TEMグリッド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピンセット：通常用および抗キャピラリー用 </td><td></td><td></td><td>Dumont #5およびDumont N5AC、またはそれに類するもの</td></tr><tr><td>マイクロピペットおよびピペットチップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman #4 ろ紙</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% ウラニル酢酸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2D結晶のスクリーニングを行う透析試料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリセロール/スクロースフリー透析バッファー</td><td></td><td></td><td>任意</td></tr><tr><td>JEOL-1400透過電子顕微鏡（TEM）</td><td></td><td></td><td>類似 80 &amp;#8211; Lab6またはタングステンフィラメント、およびフィルムおよび／またはCCDカメラ（Gatan Orius SC1000および／またはUltraScan1000 CCDカメラとGatan Digital Micrographソフトウェアパッケージ、あるいはTietzカメラ（TVIPS））を搭載した120kV透過電子顕微鏡（TEM） </td></tr></tbody></table>

電子線結晶学による構造生物学研究用小型膜タンパク質の二次元結晶化トライアルの評価

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

電子線結晶学は、どちらかあるいは、または構造と機能膜タンパク質の質問だけでなく、可溶性タンパク質を研究するために三次元結晶化とX線結晶構造解析と組み合わせて使用​​することができる手法として発展してきた。透過型電子顕微鏡による二次元（2D）の結晶のスクリーニングは、（EM）を最適化し、低温電子顕微鏡による高分解能のデータ収集のためのサンプルを選択し、見つけるのに重要なステップです。ここでは、潜在的に結晶化条件の最適化に重要な情報を供給できるよう、大規模および順序だけでなく、小規模な2次元配列の両方を識別するための基本的な手順を説明します。 EMで異なる倍率で作業することによって、重要なパラメータの範囲のデータが得られる。低倍率では、形態や膜サイズで貴重なデータを提供しています。より高い倍率で、可能な限り順番と二次元結晶の寸法が決定されます。この文脈では、CCDカメラとオンライン - フーリエ変換は、順序とサイズのためのプロテオリポソー​​ムを評価するために高倍率で使用されているか説明しています。 膜タンパク質の2次元結晶は、最も一般的に透析して再構成によって栽培されているが、スクリーニングの手法は、単層、ネイティブの2Dクリスタルの助けを借りて生産結晶の等しく適用可能である、と可溶性タンパク質の配列を命じた。さらに、ここで説明する方法は、さらに小さいの2D結晶だけでなく、私たちの例と大規模なタンパク質の格子がより容易に識別できる可能性があるとしても小さい蛋白質が同定におけるケアの同じ量を必要とする大規模な膜タンパク質のスクリーニングに適用可能である審査の早い段階で。

注文した膜タンパク質アレイの形成のために2次元（2D）の結晶化試験を評価すると、電子線結晶学における非常に重要かつ困難な作業です。 90kDa - ここでは、のためにスクリーニングし、15の範囲で主に小型の膜タンパク質の2次元結晶の同定に我々のアプローチを説明します。

電子結晶構造解析は、三次元結晶化およびX線結晶構造解析に代わる手法として、あるいはそれらと組み合わせて使用できる手法として発展してきました。

本手順の全体的な目的は、電子結晶学による膜タンパク質の構造決定に向けた、最適な2D結晶化条件を特定することです。これは、まず精製過程で適合性の高い界面活性剤を用い、天然の脂質二重層からタンパク質を可溶化させることで達成されます。手順の第2ステップでは、外来性脂質を添加し、タンパク質・脂質・界面活性剤の混合物を透析して界面活性剤を除去することで、厳密に制御された条件下で2D結晶を形成させます。手順の第3ステップは、サンプルを急速凍結してガラス状態にすることです。手順の最終ステップは、クライオ電子顕微鏡（cryo EM）を用いてデータを収集することです。最終的に、データの計算機的な画像処理を通じて、タンパク質の最終構造が得られます。こんにちは。私はジョージア工科大学生物学部研究室のティナ・ドレッドです。私はジョージア工科大学化学・生物化学科のBerry研究室および生物学科のSchmidt Kray研究室に所属しています。そして、私はジョージア工科大学生物学科のIngleborg Schmidt Cry研究室のMatt Johnsonです。本日は、電子顕微鏡を用いた2Dコロイド結晶試験の評価手順についてご紹介します。当研究室では、2D結晶化条件の同定および最適化のためにこのプロトコルを使用しています。それでは、手順を開始しましょう。まず、カーボンコートを施した400メッシュの銅製透過電子顕微鏡（TEM）グリッド上に、ネガティブ染色試料を調製します。プロテオリポソーム試料 2 µLをカーボン被覆TEMグリッドの下にピペットで滴下し、60秒間インキュベートします。サンプルが均一に広がっていない場合は、ピペットチップの側面で静かに撫でて広げます。次に、ちぎったWhatman No.4フィルターペーパーを用いて、端から液体を吸い取り、ブロックします。これにより、プロテアリポソームを過剰に除去することなく液体を最適に除去でき、繊細なカーボンフィルムを保護することができます。ブロッティング直後に、1%酢酸ウラニル染色は液を2 µL滴下し、30秒後にグリッドの端からブロッティングします。なお、サンプルに高濃度の粘性グリセロールまたはスクロース（通常10～20%の範囲）が含まれている場合は、陰性染色を行う前に、グリセロールまたはスクロースを含まないバッファーでグリッドを数回洗浄すると、酢酸ウラニル溶液による適切な染色が可能になります。グリッドの準備が完了した後、電子顕微鏡を用いて低倍率でサンプルを観察し、膜の出現分布、形態、およびグリッド全体の品質を確認します。その後、高倍率を用いて画像を取得し、得られた画像にRIA変換を施して2D結晶を同定します。まず、電子顕微鏡のサンプルホルダーにグリッドをセットし、膜の平均的な分布について概観するため、2000〜10,000倍の中倍率で観察します。膜の分布範囲、形態、およびサイズを実験ノートに記録します。代表的な視野をCCDカメラで撮影してください。次に、必要に応じて、400〜800倍程度の低倍率でサンプルを観察し、グリッドの全体像を確認します。これにより、試料濃度、タンパク質やリポソーム分布の不均一性、およびカーボンフィルムの部分的な破損といった問題を明らかにすることができ、グリッド作製を評価するための貴重な情報が得られます。低倍率または中倍率で、目的のグリッド領域を特定してください。その後、高倍率を用いて、異なる膜における秩序の有無を評価します。これは2D結晶化試験の初期段階において極めて重要です。秩序だった領域を持つ有望なタンパク質リポソームを特定し、その後の実験での再現性を検証するため、2D結晶スクリーニングに最適な高倍率設定を決定するには、まず50,000から60,000 xの倍率から開始してください。2D結晶の寸法および単位格子のサイズに応じて、高倍率設定を30,000まで下げるか、あるいは80,000まで上げることがあります。関心領域に隣接する場所において、関心領域が本当に膜であるか不確実な場合は、約−400 nmまたはそれ以上にデフォーカスします。サンプルに、プロテオリポソームと見間違えそうなカーボンフィルムの破片やMICA、その他のアーティファクトがないかを確認してください。また、端部分を観察し、典型的な膜の折りたたみや形態を確認します。次に、CCDカメラで関心領域を観察します。最適な高倍率設定でCCD画像を収集しても、小さい、または大部分が疎水性である膜タンパク質の格子は、CCD画像自体の視覚的な評価では観察できない場合があります。この場合、画像全体を用いてオンラインでのフーリエ変換（FT）を行います。ただし、秩序配列が小さい場合、このFT（フーリエ変換）にはかなりのノイズが含まれることになります。S/N比を向上させるには、ボックス画像のサイズを小さくし、縮小したボックスを画像上で移動させながらライブFTを実行してください。また、秩序配列を最適に識別するために、ライブFTのガンマ関数を調整します。ガンマ値が高すぎるとノイズの影響でスポットが隠れてしまい、逆に低すぎると弱いスポットが識別できなくなります。ネガティブ染色した2D結晶の分解能は、DFO（暗視野焦点）が-400 nmのときにおよそ15 Åになると予想されます。1〜3次までスポットが確認されることが予想されます。スポットの鋭さおよびモザイクの有無に注意してください。18 kilodaltonの小さな膜タンパク質の2次元結晶は、サイズが最大で数ミクロンに達します。FTS上のスポットが鮮明であり、ライブFTボックスの移動が容易に識別できることは、格子がモザイクなく連続していることを示しています。より広範な可溶性ドメインを持つ大きなタンパク質の格子は、T-E-M-C-C-D画像収集の小さな画面上で識別可能ですが、無秩序なタンパク質のFTにおけるモザイクノイズなどの特性を含め、格子品質をより正確に評価するにはFTが必要です。リポソームが弱いスポットと誤認される可能性があるため、スポットが小さなタンパク質の2D結晶によるものか、あるいはノイズによるものかを判断する必要があります。ライブFT（Fourier transform）用のボックスを移動させます。スポットがすぐに消える場合はノイズですが、たとえ狭い範囲であっても変化せずに残る場合は、脂質結晶が特有の形態とFTを示すため、結晶が存在している可能性が高くなります。これらの脂質結晶は、画像の目視検査および一定の単位格子サイズによっても識別可能です。初期の試行において沈殿が生じることがあります。タンパク質の沈殿と脂質凝集体を区別するために、高倍率での観察を行います。脂質凝集体であった場合は、実際には再構成が起こっていた可能性があり、以降の実験では、再構成を誘導することよりも、膜サイズを大きくし、秩序を形成させるために必要なパラメータの調整のみが必要となります（30,000から50,000 ×g）。これらの暗い構造の端から、それらがタンパク質を含まない膜で構成されていることが分かります。最適な条件下での沈殿サンプルには、高比率で2D結晶が含まれます。データ収集には、最大で最も秩序だった2D結晶を視覚的に選択するため、膜の見た目を均一にする必要はありません。これらの種類の試料は、結晶化が容易に認識でき、クライオ電子顕微鏡（cryo EM）によるデータ収集に使用することで、最大限の高解像度画像を得ることができます。ここでは、この手順において、透過電子顕微鏡（TEM）を用いて小型膜タンパク質の2次元結晶をスクリーニングする方法を説明します。ここまでの段階で多大な時間と労力を費やしているため、有望な結晶化条件を見逃さないよう、徹底的に確認することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功を願っております。

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提示されたプロトコルは、96ウェルハイスループット透析プレートを使用してタンパク質結晶化条件と結晶成長をスクリーニングするための簡単なアプローチを説明しています。微結晶の大規模な成長のためのダイアライザーチューブの使用は、シリアル結晶学およびMicroEDアプリケーションでも実証されています。...

マイクロダイアリシス による ハイスループットタンパク質結晶化

学ぶ 電子線結晶学による小型膜タンパク質の二次元結晶化条件の最適化手法。デタージェント可溶化、脂質添加、透析結晶化、クライオ電子顕微鏡による構造解析のプロセスを理解できます。

電子線結晶学による構造生物学研究用小型膜タンパク質の二次元結晶化トライアルの評価

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