βバレル外膜タンパク質の構造決意を目指して - 構築物から結晶へ
2016年7月4日
βバレル外膜タンパク質(OMP)は、グラム陰性菌、ミトコンドリア、葉緑体の外膜内で多くの機能を果たします。ここでは、X線結晶構造解析またはNMR分光法による構造決定に十分な量のβバレルOMPを生成するためのプロトコルを提示することにより、構造研究における既知のボトルネックを軽減したいと考えています。
この方法の全体的な目標は、結晶化して脱離するミリグラム量の外膜ベータバレルタンパク質を得ることです。この方法は、βバレルタンパク質が細胞膜にどのように挿入されるかなど、膜タンパク質のフォールディングおよび輸送分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、ベータバレルタンパク質に対して堅牢であることです。
一般に、この方法に不慣れな人は、精製、結晶化、および屈折のための界面活性剤の選択が難しいため、苦労するでしょう。Susan Buchananの研究室のポスドクであるJeremy Guerinが、私自身と研究室の同僚に加えて、手順を実演します。この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、膜へのin vivo発現のためのコドン最適化標的外膜タンパク質、またはOMP遺伝子を含むT7発現ベクターの構築から開始します。
1マイクロリットルのプラスミドを50マイクロリットルのBL21(DE3)ケミカルコンピテントセルにピペットで移し、ピペッティングで上下させて穏やかに混合することにより、コンストラクトを発現細菌の発現株に変換します。氷上で30分間インキュベートします。インキュベーション後、ウォーターバスを使用して摂氏42度で30秒間加熱パルスし、その後1分間氷の上に戻します。
予熱したSOC培地1ミリリットルを加え、ベンチトップシェーカーインキュベーターを使用して摂氏37度で1000RPMで1時間振とうします。インキュベーション後、100マイクロリットルの細胞を適切な抗生物質を含むLB寒天プレートにプレートし、37°Cで逆さにして一晩インキュベートします。次に、5ミリリットルのLB含有抗生物質培養物に1つのコロニーを接種することにより、小規模な発現試験を行います。
5〜10コロニーで繰り返します。摂氏37度で成長し、約ゼロポイント6の600ナノメートルで光学密度に振とうします。各培養チューブに5マイクロリットルの1モルIPTGを添加することにより、標的OMPの発現を誘導し、さらに1〜2時間成長させます。
すべてのコロニーの発現レベルを比較するには、微量遠心分離機を使用して、各培養物の1ミリリットルを15, 000倍Gで1分間遠心分離します。上清を除去し、細胞を200マイクロリットルの1X SDS-PAGEローディングバッファーに再懸濁します。摂氏100度で5分間加熱し、その後、Gの15, 000倍で5分間再び遠心分離します。
SDS-PAGEを使用して、10%ゲルの各ウェルに20マイクロリットルをピペットで移し、サンプルを分析します。ゲルを一定の200ボルトで35分間運転します。最後に、Gの6000倍で10分間遠心分離することにより細胞を回収します。
細胞を溶解バッファーに、細胞ペースト1gあたり5ミリリットルの割合で再懸濁します。フレンチプレスまたは細胞ホモジナイザーを使用して細胞を溶解します。次に、溶解した細胞をGの15,000倍で摂氏4度で30分間回転させ、溶解していない細胞と細胞の破片を取り除きます。
上清をきれいなチューブに移し、再び4°Cで1時間高速で遠心分離します。得られたペレットは、目的のタンパク質を含む膜画分です。Dounceホモジナイザーを使用して、メンブレン画分を再懸濁します。
まず、メンブレンを移し替え、次に洗剤なしで2倍の濃度で可溶化バッファーを追加します。再懸濁したメンブレンをメスシリンダーに注ぎ、最終濃度が1X可溶化バッファーに達するまで水を加えます。サンプルをビーカーに移し、界面活性剤をゆっくりと加えて、臨界ミセル濃度の約10倍の最終濃度にします。
次に、標的タンパク質がメンブレンから抽出される容易さに応じて、摂氏4度で0.5〜16時間撹拌します。最後に、可溶化したサンプルをGの300,000倍で摂氏4度で1時間遠心分離します。1〜5ミリリットルのIMACカラムを調製するか、あらかじめ充填されたカラムを使用してください。
その後のクロマトグラフィーステップを摂氏4度で実行します。水で洗い流して、防腐剤の痕跡を取り除きます。自動精製システムを使用している場合は、製造元の指示に従ってカラムを取り付けてください。
イミジゾールを含まない500ミリリットルのIMACバッファーAと1モルのイミジゾールを含む250ミリリットルのIMACバッファーBを調製します。10カラム容量のIMACバッファーAを使用してIMACカラムを平衡化し、イミジゾールをタンパク質サンプルに最終濃度25ミリモルまで加えて混合します。次に、サンプルを平衡化したIMACカラムに毎分2ミリリットルでロードします。
フロースルーを収集します。次に、バッファーBを使用して、イミジゾールの濃度が増加する5つのカラム容量でIMACカラムを洗浄します。最終濃度 250 ミリモルで 5 カラム容量でサンプルを溶出し、溶出したサンプルを 2 ミリリットルの分画で回収します。
280ナノメートルの吸光度に基づくSDS-PAGE分析を使用して、フロースルー、洗浄画分、および溶出画分を分析します。SDS-PAGE分析で確認されたターゲットβバレルOMPを含むフラクションをプールします。次に、プールしたサンプルにTEVプロテアーゼを添加し、摂氏4度で穏やかに揺さぶりながら一晩インキュベートして、6X histadineタグを取り外してください。
サンプルプロテアーゼ溶液をIMACカラムに再度ロードして、ターゲットベータバレルOMPを切断されたタグおよび切断されていないサンプルから分離します。フロースルーには、タグのない劈開されたサンプルが含まれます。結晶化の準備をするには、サンプルをゲルろ過カラムにロードし、結晶化に使用する界面活性剤を含むバッファーに入れます。
1ミリリットルの画分を採取し、280ナノメートルの吸光度に基づくSDS-PAGE分析を用いて分析します。標的タンパク質を含む画分をプールし、1ミリリットルあたり約10ミリグラムに濃縮します。サンプルを調製する前に、ゲル装置を組み立てます。
予冷したゲルランニングバッファーを使用するか、低温室でゲルを泳動します。0.22ミクロンの遠心フィルターを使用してサンプルをろ過し、微粒子と沈殿物を除去します。次に、0.25マイクロリットルのサンプルを2本の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブにピペットで移します。
次に、1つを「煮沸」、もう1つをRTとラベル付けします。次に、各チューブに9.75マイクロリットルのサンプルバッファーを加え、ピペッティングで混合します。両方のサンプルに、10マイクロリットルの2X SDSローディングバッファーも加え、ピペッティングで穏やかに混合します。沸騰させた「サンプル」を摂氏95度で5分間茹で、RTサンプルを室温で放置します。
その後、茹でた「サンプル」を手短に回します。次に、20マイクロリットルの両サンプルを、あらかじめ組み立てたネイティブゲルにロードします。ゲルを一定の150ボルトで60分間泳動した後、ゲルを取り出し、染色溶液に浸して結果を視覚化します。
以前に発表されたJoveメソッドを使用して、界面活性剤、バイセル、および脂質キュービック相での結晶化試験を進めます。結晶化ヘッドをUV顕微鏡で可視化し、結晶が実際にタンパク質であり、未解決のタンパク質、脂質、界面活性剤であることを確認します。鉛結晶は、家庭用ソースまたはシンクロトロンでスクリーニングされ、結晶が収縮するかどうかを確認します。
よく収縮する結晶を採取した後、HKL2000などの処理ソフトを用いてデータを加工します。得られたファイルをPhoenix Suitなどの構造決定用ソフトウェアスイートに転送し、初期位相と構造決定のための分子置換を実行します。YIURの結晶構造は、この方法を用いて2.6オングストローム分解能で決定されました。
このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、2週間で完了します。このビデオを見れば、構造研究のために細菌の外膜タンパク質を発現および精製する方法を十分に理解できるはずです。
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概要
この記事では、構造研究に十分な量のβバレル外膜タンパク質（OMPs）を生産するためのプロトコルを紹介します。この方法は、膜タンパク質の折りたたみと輸送を理解するために不可欠なこれらのタンパク質の結晶化と回折を容易にすることを目的としています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 構造生物学
- 生化学
- 膜タンパク質
背景
- βバレルOMPsは、グラム陰性細菌、ミトコンドリア、葉緑体における様々な機能に不可欠です。
- その構造を理解することで、膜タンパク質のダイナミクスに関する洞察が得られます。
- これらのタンパク質の結晶化は、構造研究における大きなボトルネックとなってきました。
- 精製と結晶化のための界面活性剤の選択は、研究者にとってしばしば課題となっています。
研究の目的
- ミリグラム量のβバレルOMPsを生産するための堅牢な方法を開発すること。
- X線結晶解析またはNMR分光法による構造決定を可能にすること。
- この分野に新しく取り組む研究者が直面する課題に対処すること。
使用された方法
- 最適化されたコドンのターゲットOMP遺伝子を含むT7発現ベクターの構築。
- 膜への統合を促進するためのOMPのin vivo発現。
- 精製と結晶化のための特定の界面活性剤の使用。
- 経験豊富な研究者による実験室での手順のデモンストレーション。
主要な結果
- この方法は、結晶化に適したβバレルOMPsを成功裏に生産します。
- 膜タンパク質の挿入を研究するための信頼できるアプローチを提供します。
- 研究者はプロトコルのガイダンスを受けて方法を複製できます。
- 経験豊富な人員によるデモンストレーションは、プロセスの理解を深めます。
結論
- この方法は、βバレルOMPの研究における重要な進歩を表しています。
- 構造生物学研究の新たな道を開きます。
- 将来の研究では、この技術を活用して膜タンパク質の機能を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Determining the structure of β-barrel outer membrane proteins (OMPs) is a critical bottleneck in antimicrobial target validation and mechanistic de-risking for Gram-negative pathogens. Reliable production of milligram quantities enables structure-based drug discovery and predictive confidence in target engagement. This method supports early discovery workflows by providing purified, crystallizable OMPs for downstream screening and lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing purified OMPs for structural and functional studies.
- Operational Value: Supports biological de-risking through reproducible expression and purification workflows.
- Predictive Value: Facilitates structure-guided target assessment and portfolio triage for antimicrobial programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces detergent-solubilized OMPs suitable for biophysical assay development and ligand screening.
- Operational Value: Delivers standardized, quantifiable protein outputs enabling reproducible compound evaluation.
- Platform Reuse: Generates purified OMPs compatible with downstream biophysical and structural platforms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides structurally validated OMPs that bridge discovery to preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Enables structure-based understanding of OMP function in virulence and transport pathways.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions through validated structural models of target proteins.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, delivering purified OMPs for structural and functional characterization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via structural analysis of purified OMPs.
- Screening: Enables assay readiness through production of homogeneous, concentrated protein samples.
- Analytics: Yields quantifiable outputs (yield, purity, monodispersity) essential for comparative condition assessment.
- Translational Research: Connects structural data to preclinical continuity by validating target conformation and function.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for OMP production across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through structural data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of OMP production for structural studies.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing failure rates in downstream screening and crystallization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on structural tractability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, bacterial expression, and membrane protein biochemistry.
- Depends on access to centrifugation, chromatography, and crystallization screening infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of detergent selection and purification protocols.
- Involves adaptation considerations for OMPs from mitochondria or chloroplasts versus Gram-negative bacteria.
- Practical limitations include variable expression yields and detergent sensitivity across OMP targets.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
In Vivo Membrane-targeted Expression
3:09
Isolation from Membrane Fractions
4:41
Purification Using Immobilized Metal-affinity Chromatography (IMAC), Ion-exchange, and Gel Filtration
7:09
Heat Modifiability Assay
8:35
Results: Crystals to Structure Determination for the Putative Vaccine Target YiuR from Yersinia pestis
9:29
Conclusion
