Name: βバレル外膜タンパク質の構造決意を目指して - 構築物から結晶へ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 学ぶ βバレル外膜タンパク質の発現・精製・結晶化手法。T7発現ベクター構築からIMAC精製、ゲル濾過までの標準プロトコルを解説。膜タンパク質構造生物学研究に有用です。

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UV画像を提供してくださったCNRSのHerve Celiaさんと、SONICC画像を提供してくださったパデュー大学化学科のChris DettmarさんとGarth Simpsonさんに感謝いたします。国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所および国立衛生研究所の学内研究プログラムからの資金提供に感謝いたします。さらに、国立総合医科学研究所(AMSおよびCJ)、国立アレルギー感染症研究所(N.N. 1K22AI113078-01)、およびパデュー大学生物科学部(N.N.)からの追加資金に感謝します。

<ol><li>Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+beta-barrel+membrane+proteins+in+bacteria+and+eukaryotes%3A+evolutionary+conservation+and+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence.</a> Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).</li>
<li>Ricci, D. P., Silhavy, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bam+machine%3A+A+molecular+cooper%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The Bam machine: A molecular cooper.</a> Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).</li>
<li>Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Barrel+membrane+protein+assembly+by+the+Bam+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Biochem%22%5BJournal%5D)">beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex.</a> Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).</li>
<li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+iron+piracy+by+pathogenic+Neisseria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria.</a> Nature. 483, 53-58 (2012).</li>
<li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insight+into+the+biogenesis+of+beta-barrel+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins.</a> Nature. 501, 385-390 (2013).</li>
<li>Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+YaeT%3A+conformational+flexibility+and+substrate+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition.</a> Structure. 16, 1873-1881 (2008).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+an+essential+component+of+the+outer+membrane+protein+assembly+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine.</a> Science. 317, 961-964 (2007).</li>
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<li>Phan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+FimD+usher+bound+to+its+cognate+FimC-FimH+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate.</a> Nature. 474, 49-53 (2011).</li>
<li>van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M. Jr, Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+long-chain+fatty+acid+transporter+FadL%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL.</a> Science. 304, 1506-1509 (2004).</li>
<li>Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+biology+of+beta-barrel+membrane+proteins%3A+a+summary+of+recent+reports%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports.</a> Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).</li>
<li>Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TonB-dependent+transporters%3A+regulation%2C+structure%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Micro%22%5BJournal%5D)">TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function.</a> Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).</li>
<li>Siburt, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hijacking+transferrin+bound+iron%3A+protein-receptor+interactions+involved+in+iron+transport+in+N.+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae.</a> Metallomics. 1, 249-255 (2009).</li>
<li>Cornelissen, C. N., Hollander, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TonB-Dependent+Transporters+Expressed+by+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Micro%22%5BJournal%5D)">TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae.</a> Front in Micro. 2 (117), (2011).</li>
<li>Dautin, N., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+secretion+in+gram-negative+bacteria+via+the+autotransporter+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Micro%22%5BJournal%5D)">Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway.</a> Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).</li>
<li>Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+V+secretion%3A+mechanism%28s%29+of+autotransport+through+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+of+the+Royal+Soc+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane.</a> Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).</li>
<li>Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchanan%2C+SK+%22Comprehensive+Biophysics%22">Comprehensive Biophysics</a>. Engelman, E. H., Tamm, L. K. 5, Academic Press. 139-163 (2011).</li>
<li>Buchanan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+colicin+I+receptor+bound+to+the+R-domain+of+colicin+Ia%3A+implications+for+protein+import%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import.</a> EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).</li>
<li>Yamashita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+Ail-mediated+adhesion+in+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis.</a> Structure. 19, 1672-1682 (2011).</li>
<li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+%28LIC-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).</li>
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<li>Rosenbusch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+major+envelope+protein+from+Escherichia+coli.+Regular+arrangement+on+the+peptidoglycan+and+unusual+dodecyl+sulfate+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding.</a> J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).</li>
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<li>Robert, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+factor+Omp85+recognizes+its+outer+membrane+protein+substrates+by+a+species-specific+C-terminal+motif%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Bio%22%5BJournal%5D)">Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif.</a> PLoS Bio. 4, e377(2006).</li>
<li>Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+C-terminal+insertional+signal+in+Gram-negative+bacterial+outer+membrane+proteins+species-specific+or+not%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not?</a> BMC Genomics. 13, 510(2012).</li>
<li>Agah, S., Faham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in bicelles.</a> Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).</li>
<li>Ujwal, R., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles.</a> Methods. 55, 337-341 (2011).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cur+Op+in+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).</li>
<li>Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+bacteriorhodopsin+at+1.55+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution.</a> J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).</li>
<li>Kato, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+channelrhodopsin+light-gated+cation+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel.</a> Nature. 482, 369-374 (2012).</li>
<li>White, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+agonist-bound+neurotensin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the agonist-bound neurotensin receptor.</a> Nature. 490, 508-513 (2012).</li>
<li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+beta2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li>
<li>Haupert, L. M., Simpson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+protein+crystallization+trials+by+second+order+nonlinear+optical+imaging+of+chiral+crystals+%28SONICC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC).</a> Methods. 55, 379-386 (2011).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

βバレルのOMPは、グラム陰性菌、ミトコンドリアと葉緑体中で重要な役割を果たし、これらのそれぞれの細胞小器官の外膜に不可欠な分子メカニズムに関する豊富な情報を提供する構造解析のための重要な標的です。しかし、構造分析のための十分なサンプルを生成することは必ずしも簡単ではないので、一般的なパイプラインを詳細に結晶に構築物からの処理を説明するための、構造決意に対する目標βバレルのOMPの十分な量の生産のために提示されています。これらのプロトコルは、テストの結果、グラム陰性菌から、ほとんどのOMPのために働くことが判明しているが、それには限界が発現および精製のための他の方法が必要になる場合があり、特にミトコンドリアと葉緑体のためのいくつかのターゲットは、ありますがあります。このように、ここでの方法は、ほとんどのグラム陰性細菌からのOMPを伴うプロジェクト、まだ発現レベルのために適用可能であるべきです精製試料の量は、ターゲットOMPに依存して変化します。 構造研究のためのβバレルのOMPの発現のために、2つの一般的なアプローチ、（1）in vivo発現は、外膜との...

βバレルのOMPは、ミトコンドリア、葉緑体、およびグラム陰性菌1-3の外膜で見つけることができます。彼らはαヘリックスタンパク質と同様の役割を果たしているが、彼らはそれぞれの鎖が密接に隣接する二つの鎖に接続されて8月26日、反平行のβ鎖に至るまで中央の膜に埋め込まれたβバレルドメインからなる非常に異なる倍を持っています（ 図1及び2）。 βバレルドメインの最初と最後のストランドは、その後、周囲の膜からβバレルドメインを閉じて密封するために、（ミトコンドリアVDACを除く）反平行にほぼ独占的に、互いに相互作用します。すべてのβバレルのOMPは、これらのループは、時々そのようなプロ結合ナイセリアトランスフェリンにおいて見出されるような75残基と同じ大きさで、リガンド相互作用および/またはタンパク質 - タンパク質接触に重要な役割を果たして変化配列および長さの細胞外ループを有しますテインA（のTbpA）4。 βバレルのOMPは、タンパク質の機能的な目的（ 例えば、バマ5-7、FimD 8,9、ファドル10）のような追加のドメインを果たすN末端 ​​またはC末端ペリプラズム拡張機能をも持つことができます。 βバレルのOMPの多くの種類が11存在するが、より一般的なタイプの2は、フィールド、（1）TonB依存トランスポーター及び（2）オートトランスポーターとあまり慣れているため、例として、以下に記載されています。 TonB依存トランスポーター（ 例えば、FEPA、のTbpA、のbtuB、Cirの、 など ） は 、栄養のインポートのために不可欠であり、C末端の22本鎖β-内側に隠れて発見された〜150残基からなるN末端 ​​プラグドメインを含みますバレルドメインは、外膜12（ 図3）の中に埋め込 ​​まれました。このプラグインのドメインを自由にバレルドメインを通過する基板を防ぎながら、基質結合は、プラグドメイン番目の内のコンホメーション変化を誘導しますリードで（プラグ転位によって、またはプラグの部分的/完全な排出のいずれかによって）、その後ペリプラズムに外膜を横切って基板搬送を容易にすることができる形成を細孔します。 TonB依存のトランスポーターは、直接ヒト宿主タンパク質4,13,14から鉄などの栄養素をハイジャック特殊なトランスポーターを進化させてきたような髄膜炎菌などのグラム陰性菌のいくつかの病原性株の生存のために特に重要です。 オートトランスポーターは、グラム陰性菌のV型分泌系に属し、βバレルドメインからなるβバレルのOMP（ESTA及びESPPと同様に、通常、12ストランド）とで分泌または提示されているいずれかのパッセンジャードメインですセル15,16（ 図3）の表面。これらのβバレルのOMPは、多くの場合、サービングパッセンジャードメインと細胞の生存と病原性において重要な役割を果たしいずれかのプロテアーゼ、付着、および/または他のEFなどfectorそれは病因を媒介します。 このようなX線結晶学、NMR分光法、および電子顕微鏡（EM）、私たちは順番に、それらは、外膜内で機能する方法を正確に解読するために使用することができ、原子分解能でのOMPのためのモデルを決定することを可能にするような構造の方法。該当する場合は、この貴重な情報は、薬物およびワクチンの開発のために使用することができます。例えば、トランスフェリン結合タンパク質A（のTbpA）はナイセリアの表面上に見出され、それが直接ヒトトランスフェリンを結合し、その後抽出し、自身の生存のために鉄をインポートするため、病原性のために必要とされます。 TbpAがなければ、 ナイセリアはヒト宿主から鉄を除去することができず、非病原性にされます。 TbpA 4に結合したヒトトランスフェリンの結晶構造が解明された後、それは2つのタンパク質が関連するどのくらい鮮明になった、のTbpAのどの領域が相互作用を媒介、のTbpAによって鉄抽出のための重要な何であったか残基、およびどのように1はのTbpAを標的ナイセリアに対する治療薬を開発する可能性があります。したがって、生存と病原性グラム陰性細菌中のβバレルのOMPの重要性を与えられただけでなく、ミトコンドリアと葉緑体機能、および追加の構造膜タンパク質のこのユニークなクラスに関する情報とそれらが機能するシステムの必要性、一般的なプロトコルは、構造的な方法によって特徴づけのために高レベルでターゲットのOMPを発現させ、精製の全体的な目標が提示されています。

<table><tbody><tr><td>結晶化ロボット</td><td>TTP Labtech、Art Robbins-Any</td><td></td>は<td>、LCP結晶</td></tr><tr><td>化PCRサーモサイクラーEppendorf</td><td>、BioRad-Media</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シェーカー</td><td>ニューブランズウィック、Infors HT-UV-vis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分光計</td><td>Eppendorf-SDS-PAGE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>装置</td><td>BioRad</td><td>1645050、1658005</td><td>を除いて、ここで動作する必要があります</td></tr><tr><td>SDS-PAGEおよびネイティブゲルBioRad</td><td>、Life Technologies</td><td>4561084、EC6035BOX(BN1002BOX)</td><td></td></tr><tr><td>AkTA Prime</td><td>GE</td> <td>Healthcare-AkTA</td><td></td></tr> <tr><td>Purifier</td><td>GE</td> <td>Healthcare-Microcentrifuge</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Eppendorf-Centrifuge</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(低速-中速)</td><td>Beckman-Coulter-Ultracentrifuge</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(高速度)</td><td>ベックマン・コール</td><td>ター-SS34</td><td></td></tr><tr><td>ローター</td><td>ソルバル</td><td>タイプ</td><td></td></tr><tr><td>45 Tiローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>タイプ</td><td></td></tr><tr><td>70 Tiローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ダウンスホモジナイザー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>06 435C</td><td></td></tr><tr><td>エマルシフレックス</td><td>アベスチン</td><td>透</td><td></td></tr><tr><td>析チューブ</td><td>シグマ</td><td>D9652</td><td></td></tr><tr><td>LCP ツール</td><td>ハミルトン、TTP Labtech-VDX</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>24 ウェルプレート</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>サンドイッチプレート</td><td>ハンプトンリサーチ、分子寸法</td><td>HR3-151、MD11-50 (MD11-53)</td><td></td></tr><tr><td>グレース 結晶化シート</td><td>グレース バイオラボ</td><td>875238</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep S300 HR カラム</td><td>GE ヘルスケア</td><td>17-1167-01</td><td></td></tr><tr><td>Q-セファロースカラム</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td></td></tr><tr><td>結晶化スクリーン</td><td>Hampton Research, Qiagen, Molecular</td> <td>Dimensions-Gas-tight</td><td></td></tr> <tr><td>syringe (100 ml)</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

βバレル外膜タンパク質の構造決意を目指して - 構築物から結晶へ

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

膜タンパク質は、栄養素の輸送、運動性、シグナル伝達、生存、病原性などの細胞内で重要な機能を果たしていますが、既知の構造の~1%しか構成していません。膜タンパク質には、αヘリカルとβバレルの2種類があります。αヘリックス膜タンパク質はほぼすべての細胞膜に見られますが、βバレル膜タンパク質はミトコンドリア、葉緑体、グラム陰性菌の外膜にしか見つかりません。一般的に膜タンパク質の構造研究における一般的なボトルネックの1つは、分析に十分な純度のサンプルを得ることです。お気に入りのβバレル外膜タンパク質(OMP)の構造を解明することに興味がある人を支援することを期待して、X線結晶構造解析および/またはNMR分光法による構造決定に有用なレベルでターゲットβバレルOMPを生成するための一般的なプロトコルが提示されます。ここでは、ネイティブ発現と封入体への発現、アフィニティータグを使用した精製、および界面活性剤スクリーニング、ビセル、および脂質キュービック相技術を使用した結晶化の両方のためのコンストラクトデザインについて概説します。これらのプロトコルはテストされており、グラム陰性菌のほとんどのOMPで機能することがわかっています。しかし、特にミトコンドリアや葉緑体については、発現や精製に他の方法を必要とする可能性のある標的がいくつかあります。そのため、ここでの方法は、グラム陰性菌由来のOMPを含むほとんどのプロジェクトに適用できるはずですが、精製されたサンプルの発現レベルと量は、ターゲットOMPによって異なります。

YiuRはペスト菌に対する推定上のワクチンの標的であるTonB依存鉄トランスポーターである。これは、本来、マイクロアレイアッセイを用いて同定しました。ここでは、X線結晶学を用いYiuRの構造を決定するために取られたステップは（ 図9）に概説されています。クローニングのため、YiuRのDNA配列（マイナスN末端シグナル配列）PCRは、ゲノムDNAから増幅し、N末端pelBシグナル配列およびTEVプロテアーゼ部位、続いて10×ヒスチジンアフィニティータグを含むベクターにサブクローニングしました。発現のために、YiuR含有プラスミド〜0.5 600 ODするBL21（DE3）コンピテント細胞を、5mlのスターター培養物を成長させるために使用される単一のコロニーを形質転換しました。 TB培地750 mlを含む十二のフラスコは、次に、スターター培養物1mlを接種し、20ºC（220 rpmで振盪しながら）で3日間増殖させました。次いで、細胞を、約150〜200を生成し、回収しましたフラッシ...

βバレル外膜タンパク質(OMP)は、グラム陰性菌、ミトコンドリア、葉緑体の外膜内で多くの機能を果たします。ここでは、X線結晶構造解析またはNMR分光法による構造決定に十分な量のβバレルOMPを生成するためのプロトコルを提示することにより、構造研究における既知のボトルネックを軽減したいと考えています。

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

本手法の全般的な目的は、結晶化および回折が可能な外膜ベータバレルタンパク質をミリグラム量で得ることです。この手法は、ベータバレルタンパク質がどのように細胞膜に挿入されるかなど、膜タンパク質の折り畳みおよび輸送分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、ベータバレルタンパク質に対して堅牢であることです。一般的に、この手法に不慣れな方は、精製、結晶化、および脱回折のための界面活性剤の選択が困難であるため、苦労することがあります。私および研究室の同僚に加え、Susan Buchanan研究室のポストドクターであるJeremy Guerinが手順を実演します。まず、テキストプロトコルに記載されている通り、in vivoでの膜への発現のために、コドン最適化された標的の外膜タンパク質（OMP遺伝子）を含むT7発現ベクターの構築からこの手順を開始してください。プラスミド1 µLをBL21(DE3)化学的コンピテントセル50 µLにピペッティングして加え、ピペッティングで穏やかに混合することで、構築物を発現用細菌株へと変換します。氷上で30分間インキュベートします。インキュベーション後、ウォーターバスを用いて42 °Cで30秒間のヒートパルスを行い、その後再び氷上に1分間置きます。あらかじめ温めておいたSOC培地を1 mL加え、ベンチトップシェーカーインキュベーターを用いて37 °C、1000 RPMで1時間振盪培養する。培養後、細胞 100 µLを適切な抗生物質を含むLBアガープレートに播種し、プレートを逆さまにして37 °Cで一晩インキュベートする。次に、単一のコロニーを抗生物質含有LB培地 5 mLに接種し、小規模な発現試験を行う。5〜10個のコロニーについて同様の操作を繰り返す。37°Cで振盪培養し、600 nmにおける吸光度（OD600）が約0.6になるまで育成する。各培養チューブに1 M IPTGを5 µL添加して標的OMPの発現を誘導し、さらに1〜2時間育成させる。すべてのコロニーの発現レベルを比較するために、マイクロ遠心分離機を用いて、各培養液 1 mLを15,000 ×gで1分間遠心分離します。上清を除去し、細胞を200 µLの1X SDS-PAGEローディングバッファーに再懸濁します。100 °Cで5分間加熱し、その後、再び15,000 ×gで5分間遠心分離します。10%ゲルを用いてSDS-PAGEによりサンプルを分析します。各ウェルに20 µLずつピペッティングし、200 Vの定電圧で35分間電気泳動を行います。最後に、6000 ×gで10分間遠心分離して細胞を回収します。細胞ペースト1gあたり5mLの比率で、溶出バッファーに細胞を再懸濁します。フレンチプレスまたは細胞ホモジナイザーを用いて細胞を溶解させます。その後、溶解した

from-constructs-to-crystals-towards-structure-determination-barrel

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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学ぶ βバレル外膜タンパク質の発現・精製・結晶化手法。T7発現ベクター構築からIMAC精製、ゲル濾過までの標準プロトコルを解説。膜タンパク質構造生物学研究に有用です。

βバレル外膜タンパク質の構造決意を目指して - 構築物から結晶へ

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