βバレル外膜タンパク質の構造決意を目指して - 構築物から結晶へ

本手法の全般的な目的は、結晶化および回折が可能な外膜ベータバレルタンパク質をミリグラム量で得ることです。この手法は、ベータバレルタンパク質がどのように細胞膜に挿入されるかなど、膜タンパク質の折り畳みおよび輸送分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、ベータバレルタンパク質に対して堅牢であることです。

一般的に、この手法に不慣れな方は、精製、結晶化、および脱回折のための界面活性剤の選択が困難であるため、苦労することがあります。私および研究室の同僚に加え、Susan Buchanan研究室のポストドクターであるJeremy Guerinが手順を実演します。まず、テキストプロトコルに記載されている通り、in vivoでの膜への発現のために、コドン最適化された標的の外膜タンパク質（OMP遺伝子）を含むT7発現ベクターの構築からこの手順を開始してください。

プラスミド1 µLをBL21(DE3)化学的コンピテントセル50 µLにピペッティングして加え、ピペッティングで穏やかに混合することで、構築物を発現用細菌株へと変換します。氷上で30分間インキュベートします。インキュベーション後、ウォーターバスを用いて42 °Cで30秒間のヒートパルスを行い、その後再び氷上に1分間置きます。

あらかじめ温めておいたSOC培地を1 mL加え、ベンチトップシェーカーインキュベーターを用いて37 °C、1000 RPMで1時間振盪培養する。培養後、細胞 100 µLを適切な抗生物質を含むLBアガープレートに播種し、プレートを逆さまにして37 °Cで一晩インキュベートする。次に、単一のコロニーを抗生物質含有LB培地 5 mLに接種し、小規模な発現試験を行う。

5〜10個のコロニーについて同様の操作を繰り返す。37°Cで振盪培養し、600 nmにおける吸光度（OD600）が約0.6になるまで育成する。各培養チューブに1 M IPTGを5 µL添加して標的OMPの発現を誘導し、さらに1〜2時間育成させる。

すべてのコロニーの発現レベルを比較するために、マイクロ遠心分離機を用いて、各培養液 1 mLを15,000 ×gで1分間遠心分離します。上清を除去し、細胞を200 µLの1X SDS-PAGEローディングバッファーに再懸濁します。100 °Cで5分間加熱し、その後、再び15,000 ×gで5分間遠心分離します。

10%ゲルを用いてSDS-PAGEによりサンプルを分析します。各ウェルに20 µLずつピペッティングし、200 Vの定電圧で35分間電気泳動を行います。最後に、6000 ×gで10分間遠心分離して細胞を回収します。

細胞ペースト1gあたり5mLの比率で、溶出バッファーに細胞を再懸濁します。フレンチプレスまたは細胞ホモジナイザーを用いて細胞を溶解させます。その後、溶解した細胞を4°Cで15,000 ×g、30分間遠心分離し、未溶解の細胞および細胞残渣を除去します。

上清を清潔なチューブに移し、4°Cで1時間、再び高速遠心分離します。得られたペレットが、目的タンパク質を含む膜画分です。Dounceホモジナイザーを用いて、膜画分を再懸濁します。

まず、膜画分を移し、界面活性剤を含まない2倍濃度の可溶化バッファーを加えます。再懸濁した膜画分をメスシリンダーに移し、最終濃度が1倍の可溶化バッファーになるまで水を加えます。サンプルをビーカーに移し、界面活性剤をゆっくりと加え、最終濃度が臨界ミセル濃度の約10倍になるようにします。

次に、標的タンパク質が膜から抽出される容易さに応じて、4 °Cで0.5〜16時間攪拌します。最後に、可溶化したサンプルを4 °Cで300,000 ×gで1時間遠心分離します。1〜5 mLのIMACカラムを調製するか、プリパックカラムを使用してください。

以降のクロマトグラフィーの手順は4 °Cで実施してください。保存料の痕跡を除去するため、水でフラッシュします。自動精製システムを使用する場合は、メーカーの指示に従ってカラムを設置してください。

イミダゾールを含まないIMACバッファーAを500 mL、1 Mのイミダゾールを含むIMACバッファーBを250 mL調製します。10カラムボリュームのIMACバッファーAを用いて、IMACカラムを平衡化します。タンパク質試料にイミダゾールを加え、最終濃度が25 mMになるように混合します。その後、平衡化したIMACカラムに試料を2 mL/minの流速でロードします。

フロースルーを回収します。次に、緩衝液Bを用い、イミダゾールの濃度を段階的に上げて、カラム体積の5倍量ずつIMACカラムを洗浄します。洗浄液は2 mLずつ分画して回収します。最終濃度250 mMのイミダゾールでカラム体積の5倍量を用いてサンプルを溶出させ、溶出サンプルを2 mLずつ分画して回収します。

280ナノメートルの吸光度に基づいて、フロースルー、洗浄分画、および溶出分画をSDS-PAGE解析を用いて分析します。SDS-PAGE解析によって確認された、標的のβバレルOMPを含む分画を回収し、プールします。次に、プールしたサンプルにTEVプロテアーゼを添加し、4°Cで緩やかに揺らしながら一晩インキュベートして、6Xヒスチジンタグを除去します。

目的のβバレルOMPを切断されたタグおよび未切断のサンプルから分離するため、サンプルプロテアーゼ溶液を再度IMACカラムにロードします。フロースルーには、タグを欠いた切断済みサンプルが含まれます。結晶化の準備として、結晶化に使用する界面活性剤を含むバッファーを用いて、サンプルをゲルろ過カラムにロードします。

1 mLずつ分画して回収し、280 nmでの吸光度に基づいてSDS-PAGE分析を用いて解析します。目的タンパク質を含む分画を合わせ、約10 mg/mLまで濃縮します。サンプルを調製する前に、ゲル装置を組み立てます。

あらかじめ冷却したゲル電気泳動用バッファーを使用するか、低温室でゲルを泳動させてください。0.22 micronの遠心フィルターを用いてサンプルをろ過し、粒子や沈殿物を除去します。その後、サンプルの0.25 microlitersを2本の1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに分注してください。

一方に「boiled」、もう一方に「RT」とラベルを貼ります。次に、各チューブにサンプルバッファーを9.75 µL加え、ピペッティングで混合します。さらに両方のサンプルに2X SDSローディングバッファーを10 µL加え、ピペッティングで静かに混合します。「boiled」サンプルを95 °Cで5分間加熱し、その間「RT」サンプルは室温に置いておきます。

次に、加熱したサンプルを短時間遠心します。続いて、両方のサンプルを20 µLずつ、あらかじめ準備したネイティブゲルにロードします。150 Vの定電圧で60分間電気泳動した後、ゲルを取り出し、染色液に浸して結果を可視化します。

以前に公開されたJoVEの手法を用いて、界面活性剤、バイセル、および脂質立方相による結晶化試行を行う。結晶化ドロップはUV顕微鏡下で観察し、結晶が塩や脂質、界面活性剤ではなく、実際にタンパク質であることを確認する。得られたリード結晶は、自前光源またはシンクロトロンを用いて、回折能があるかどうかのスクリーニングを行う。

良好に回折する結晶のデータ収集後、HKL2000などの処理ソフトウェアを使用してデータを処理します。得られたファイルをPhoenix Suiteなどの構造決定用ソフトウェアスイートに転送し、初期位相決定および構造決定のために分子置換を行います。この方法により、YIURの結晶構造を2.6 Angstromの分解能で決定しました。

この手法を習得し、適切に実施すれば、2週間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、構造研究に向けた細菌外膜タンパク質の発現および精製方法について、十分な理解を深めることができるはずです。