脂質Bicelle法を用いた膜タンパク質のハイスループット結晶化

このビデオでは、Lipic B細胞を使用して精製された膜タンパク質のハイスループット結晶化試験を設定する方法を示します。まず、脂質と界面活性剤を混合してB細胞を調製し、精製した膜タンパク質をB細胞混合物に取り込み、ナノリットルロボット目視検査を用いて結晶化試験を行います。標準的な光学顕微鏡を使用すると、結晶の存在が明らかになります。

形成されたタンパク質結晶は、データ収集と構造化された決定のために抽出および凍結することができます。この技術の主な利点は、B細胞のユニークな位相挙動により、研究室で利用可能な標準的な機器とロボット工学を結晶化に利用できることです。セットアップB細胞は非常に簡単な手法で、ターゲットの膜タンパク質を洗剤my細胞から取り出し、それをリピック培地に入れることができます。

これにより、まったく新しい一連の条件をスクリーニングできます。これは非常に簡単な方法であり、多くの膜タンパク質で成功裏に使用されているため、試してみない理由はありません。B細胞ベースの結晶化の最初のステップは、脂質アンフィ混合物を形成するB細胞の調製です。

このプロセスにはかなりの労力が必要であり、最も時間がかかります。完了するまでに数時間かかる場合がありますのでご注意ください。B細胞は、さまざまな脂質アンフィの組み合わせで、広範囲の濃度で形成できます。

推奨される開始点については、添付の書面によるプロトコルの表1を参照して、2.8対1モルの比率で1ミリリットルの35%DMPCカプソ混合物を準備することから始めます。これを行うには、チューブに0.26グラムのDMPCと0.09グラムのチャポを量ります。脱イオン水を使用して容量を最大1.0ミリリットルにしてください。

次に、混合物を水浴で摂氏約40度に温め、その後ゲル状になるまで温めます。チューブを氷の上に置きます。サンプルは再び滑らかになるはずです。

その後、再び数分間ボルテックスし、脂質が完全に溶解するまで、加温、冷却、ボルテックスのステップを繰り返し続けます。サイクルを重ねると、完了時の冷却時に混合物が曇る可能性があることに注意してください。混合物は室温以上で透明なゲルになり、細胞による氷上の粘性液体を摂氏マイナス20度に置いて長期保存することができます。

次に、精製されたタンパク質をB細胞培地に取り込む。これは簡単なプロセスであり、ビデオの次のセクションに示されている結晶化と同じ日に実行する必要があります。DMPCカプソB細胞混合物を室温で解凍し、相が透明なゲルに変化するまで加熱します。

混合物を氷の上に置いて液化し、次に短時間ボルテックスして均一なB細胞相を再確立します。この時点から、B細胞混合物と精製タンパク質を氷上に保ちます。これにより、B細胞は液相に保たれ、ピペッティングが容易になります。

次に、精製された界面活性剤可溶化タンパク質にB細胞混合物を1〜4の比率で、体積対体積で加える。その後、溶液が透明で均質になるまで、ゆっくりと上下にピペットで動かします。気泡が現れた場合は、一時的に、卓上遠心分離機で回転させます。

混合物を氷上で少なくとも30分間インキュベートして、タンパク質の細胞への完全な取り込みを促進します。細胞混合物によるタンパク質の結晶化試験の準備が整いました。蚊の結晶化ロボットを使用して結晶化試験をデモンストレーションします。

冷やして、96ウェルVの底板を氷の上に置いて。タンパク質を細胞混合物ごとにプレートにピペットで入れ、溶液の粘度が最小になるようにします。最終ステップまで、細胞混合物によるタンパク質を氷上に保ちます。

ここで使用するロボットには5つのプラットフォームがあります。リザーバーが入ったマイクロプレートをプラットフォーム3に置き、液滴を分注する結晶化蓋をプラットフォーム5に置きます。次に、細胞プレートによってタンパク質を分注位置に最も近いプラットフォーム4に配置します。

これにより、細胞混合物によるタンパク質がロボットによって最後にピックアップされ、すぐに放出されることが保証されます。ソフトウェアを使用して実行を開始すると、ロボットはリザーバー溶液をピックアップし、続いてタンパク質を細胞混合物でピックアップし、それらを滴として蓋に分配し、分配中の加熱と粘度の増加を防ぎます。実行が完了したらすぐに、リザーバーとタンパク質を細胞混合物で混合するように蚊をプログラムしないでください。

バイセルタンパク質プレートを装置から取り外し、氷の上に置きます。装置から蓋を取り外し、液滴が反転するようにリザーバー溶液を含むプレートに置きます。プレートを摂氏20度でインキュベートします。

他の温度も結晶形成と最適化のためにテストされる可能性があることに注意してください。温度が高くなるとラメラ相が誘導され、タンパク質が層状にあらかじめ組織化されるという利点があります。摂氏4度から20度までの温度をスクリーニングできます。

摂氏4度未満の温度では、脂質が1日目、3日目、およびその後毎週、長期間にわたって沈殿する可能性があり、標準的な光学顕微鏡を使用して結晶の外観と成長を評価します。ここに示されているのは、アサルトのみの状態で観察された針状結晶の明視野画像とUV画像です。結晶から蛍光は検出されず、この画像では偽陽性であることを示しています。

メチルプロパンジオールを沈殿剤として用いたときに形成された棒状の結晶。結晶は毎週蛍光を発し、タンパク質結晶である可能性があることを示していますが、X線回折を使用して非プロ粘性であることがわかりました。ここに示されているのは、試験を設定してから約4週間後に観察された結晶です。

紫外線下での強い蛍光は、それがタンパク質結晶であることを確認します。このビデオで見た通りです。B細胞が利用可能になると、精製されたタンパク質と直接混合することができ、この時点から結晶化は標準的な界面活性剤ベースのプロトコルとほぼ同じように進行します。

もう1つの明確な利点は、最適化の目的でB細胞に特定の脂質をドープできることです。この技術には本当に多くの汎用性があり、非常に簡単に使用できるため、すべての膜タンパク質結晶化プロジェクトで試してみる必要があります。