エンハンサー配列を評価するためのモザイクのゼブラフィッシュのトランスジェネシス

こんにちは、ペンシルベニア大学細胞発生生物学部のシャノン・フィッシャー研究室のエリカ・クギです。同じくフィッシャー研究所のクリス・ウェーバーです。そして、私はシャノン・フィッシャーです。

今日は、ゼブラフィッシュのトランスジェネシスを使用してエンハンサー要素の機能を解析する手順をご紹介します。この手順を使用して、骨格発生に重要な遺伝子の転写制御を研究します。それでは始めましょう。

候補遺伝子を囲む非コード配列を同定するために、uc SCゲノムブラウザのトラックとしてアクセス可能なアルゴリズムfast consを使用します。私たちは主に骨格発生中に発現する遺伝子に注目していますが、同じアプローチで初期発生時に発現する遺伝子を研究することもできます。ここに示す例では、保存された配列を特定しました。

ヒトバンパー遺伝子の周囲の区間において、隣接する遺伝子までの全区間を調べ、非コード配列の約上位5%に対応する低サイズ特異的logスコアカットオフを決定します。配列を選択した後、プライマー3を使用してプライマーを設計し、ヒトゲノムから各配列を増幅し、保存された領域と両側の30以上の塩基対を増幅するためにDNAプライマーを選択する必要があります。ヒトゲノムDNAを使用して高品質のポリメラーゼで目的領域を増幅し、標準的な実験室の分子生物学手順を使用して、増幅された製品を発現ベクターにクローニングします。

このプロトコルで使用されるベクトルは、PG wc FOS GFPA ゲートウェイです。目的地ベクトル。ベクトル作成後、転置するように指示されました。

トランスポジションに必要な酵素は、実験注入の前に、まずAmbionのMメッセージMマシンキットとPGB 600プラスミドを使用してin vitroで転写されます。転位の各バッチの有効性をテストするには、マウスソックスなどの既知のエンハンサーを注入します。10エンハンサー。

注射の準備をするには、マイクロインジェクションに使用する針を外径1.2mmのフィラメントキャピラリーガラスからSutter P 97マイクロピペットプーラーで引き出します。鋭いテーパーを備えた強力な先端を生成するプログラムを使用して、きれいなカミソリの刃とマイクロメータースライドで無傷のコリオンを貫通します。実体顕微鏡で先端を手で外径約15マイクロメートルまで折ります。

針は蓋付きの保持皿に1日保存できます。ゼブラフィッシュの個体数を、マイクロインジェクションを行う前日に標準条件下で14時間の光で、定期的に明るく暗いサイクルで維持します。小さな繁殖タンクで時限交配のために魚を準備します。

マイクロインジェクションの朝、光サイクルが始まった直後の朝に、タンクごとに3匹のメスまたは2匹のオスを平行に並べます。卵生産のためのきれいなシステム処理水でオスとメスを組み合わせます。魚を頻繁にチェックし、生産から数分以内に卵を集めて、よく同期したバッチを取得します。

ラテックス電球が取り付けられたワイドボア5インチと4分の1インチのガラスパストピペットで午前中を通して新鮮な魚のグループを組み合わせ続けることにより、卵の生産を2〜3時間維持します。収集した胚を60×15mmのペトリ皿に選別し、部分的に胚培地を50個の胚のグループに充填します。各皿の蓋に集めた時間をマークします。

収集された胚の各クラッチについて、卵のコレクションの間にunin注入された制御のために50個の胚の皿を保存します。以下の成分をマイクロフージチューブに混ぜて新鮮な注入液を調製し、氷上に保存します。注射針を保持皿に置き、1.5〜2マイクロリットルの注射液で満たします。

各針の広い端に500ナノリットルの滴をピペッティングします。液体は毛細管現象によって先端に引き寄せられます。各注射液に少なくとも2本の針を準備します。

充填された針を空気圧ピコポンプまたは同様の圧力インジェクターのハンドヘルドニードルホルダーにロードします。製造元の指示に従って窒素タンクに構成および接続されています。マイクロメータスライド上で鉱物油に排出される液滴の直径を測定することにより、注入量を較正します(通常は120ミリ秒の注入時間)。

20PSの圧力で、実体顕微鏡を6倍から10倍の倍率で約1ナノリットルの液滴を出すことができます。一対の細い鉗子で胚を所定の位置に保持し、1細胞または初期の2細胞段階で胚の卵黄にコリオンを介して安定した圧力で注射針を押し込み、針先を割球のすぐ下の卵黄に配置し、約1リットルの注射液を排出し、注射が完了した後に200個以上の胚を注入する各コンストラクトごとに針を引き抜きます。未受精卵、損傷した胚、失敗した注射、または冒涜者にフェノールレッドを含まない胚を取り除いて、胚を選別します。

その後、胚と胚培地を摂氏28.5度で適切な観察時間までインキュベートします。次に、ゼブラフィッシュの胚におけるGFP発現の組織特異的パターンを生成するエンハンサー要素の代表的な結果をいくつか紹介します。骨や軟骨に発現する遺伝子を研究しています。

これは、受精後3日目に頭蓋顔面軟骨の発現を調節するアカン遺伝子の上流にあるエンハンサー要素の一例です。今回は骨細胞での発現を調節するバンパー遺伝子から取り出したもう1つのエンハンサーをご紹介します。私たちが同定した多くのエンハンサーのうち5日間で、遺伝子に対する位置と発現の調節との間にはほとんど相関関係が見られませんでした。

テストする配列を選択する際には、エンハンサーが遺伝子の上流または下流、またはこの胚に見られるようにイントロンの1つに数百キロベース存在する可能性があることを覚えておくことが重要です。配列のかなりの部分は、組織特異的な発現を調節していないようです。これらはしばしば蛍光をほとんど示さないか、異所性発現の2つの一般的な部位である表皮と骨格筋にいくつかの散在する細胞を持っている可能性があります。

配列保存を通じて潜在的なエンハンサー要素を特定し、ゼブラフィッシュのモザイクトランスジェネシスを通じてその機能をテストする方法を示しました。この手順を行うときは、注射用のDNAとRNAの品質を調べることが重要です。また、特に販売の小さなグループでのみ発現を期待している場合は、注入されたすべての胚を注意深く調べるようにしてください。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。