Name: ゼブラフィッシュにおけるGal4のを用いた遺伝子トラップ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュにおけるGal4-VP16を用いた遺伝子トラップ法。GFPとRFPを使ったスクリーニングで発現検出感度を高め、発生生物学における遺伝子機能解析のための変異体魚を効率的に作出する手法です。

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我々は技術支援のために、原稿の重要な読書のためのライアンギル博士ジェニファーEmtageに感謝し、試薬のためのゼブラフィッシュのケアと博士はスティーブン·C. Ekkerさん（メイヨークリニック、Rochster、ミネソタ州）を支援する。私たちの仕事は、科学技術のテンプル大学と米国立衛生研究所（R01-HD061749）によって支えられてきた。

1。遺伝子トラップのマイクロインジェクションにより、F0世代の製造。 ABとチュービンゲン株は貧しい生存していながら、ロングフィン（TLF）が最も寛容であること - 我々は、異なる遺伝的背景の胚はペット店頭野生型およびチュービンゲンで、この手順に異なる許容範囲を表示することを発見した。 <ol><li>トランスポゾンDNAの調製。 GBT-B1を準備します（pDB783、Balciuniene ら準備中）の標準をQIAprepミニプレップキット（キアゲン27106）を使用してプラスミドDNA。それ以外のミニプレップDNAは、トランスポザーゼmRNAの分解を導く、RNアーゼAによって汚染され、（プレップ手順において任意である）PB洗浄工程を含むことが必須である。注射の前に、10 ngの/μlにRNaseフリー水（Ambion社AM9937）でDNAを希釈する。 </li><li>トランスポザーゼmRNAの準備。をXbaIを使用してpT3TS/Tol2（pDB600）13を直線化し、mMessage機T3を使って線状化DNAを転写in vitro転写キット内 （アンビオンAM1348）。我々はRiboLock RNase阻害剤（ThermoFisherファーメンタスEO0381）の0.5μLを添加することにより、in vitro転写反応を変更しました。 DNase処理工程の後、のMinEluteをRNeasyキット（Qiagen 74204）を用いてmRNAを精製する。アガロースゲル電気泳動によるインビトロ転写されたmRNAの品質を評価する。 -80℃で2μlのアリコートとして40 ngの/μL、および格納するためにRNaseフリー水でmRNAを薄める</li><li>マイクロインジェクションミックスの調製。注射の前に、トランスポザーゼmRNAの2μlの分量まで希釈トランスポゾンDNAの8を添加する。 </li><li>マイクロインジェクション。卵黄/割球インタフェースを目指し、標準的なマイクロインジェクション技術を使用して1セルゼブラフィッシュ胚の卵黄にDNA / RNA混合物の3 NLを注入する。 1細胞期の注入を確実にするために、胚を20分毎に収集する。我々の経験では、熟練した人は簡単に1〜1.5時間で千胚を注入することができます。 </li><li>注入後、左側の5μLを実行品質管理のための1％アガロースゲル上で注射液の上に、トランスポザーゼmRNAが分解されていないことを保証する。 </li><li>注入された胚のケア。午後遅く、未受精および異常胚を削除し、100ミリメートルペトリ皿当たり60から80に胚を配布します。異常で死んだ胚を1日後受精（DPF）、2 DPFと3 DPFで除去される。 </li><li> GFP発現についてスクリーニングする。 3 DPF（ 図3）でのGFP蛍光のための明白な欠陥のない画面の胚。スクリーニングは、（我々は5X Fluar目的とツァイスAxioImagerを使用）を装備した蛍光実体顕微鏡で（我々はニコンSMZ1500を使用）、または正立顕微鏡のいずれかで行うことができます。低GFPの発現は、RNaseのコンタミ（ 図3A）に失敗した注射またはトランスポザーゼRNAの分解のいずれかを示しています。 （Fを比較する複数の組織において、または特定の組織の細胞が高い割合でGFP発現を有するいずれかの明るい胚の約30％を選択図3B及び3C）は igures。千胚の注入から、我々は通常、最大100発生的に正常な、高GFP発現胚を持っている。 </li><li>標準ゼブラフィッシュ飼育手順を使用して、選択したF0胚を上げる。これは、飼育用に選択注入した胚の20〜30％は成人期まで生存すると予想するのが妥当である。 </li></ol> 2。 UASのメンテナンス：mRFPをテスターライン。 GFP：レンズ固有γCryでマークをmRFPライン：我々は14xUASを生成した。 UASは、DNAメチル化を介してサイレンシングを受けるので、在庫を伝播するサイレン低レベルの魚を選択することが重要である。 <ol><li>個々のUAS設定する：私達の最も信頼性の高いのGal4遺伝子トラップ系統の1と嵌合するためのmRFPをホモ接合体を、NSF tpl6（Balciunieneら準備中。）。 </li><li>翌日、UASを転送：胚が収集されている間、個々の静的なタンクに胚を与えたmRFPを魚と清掃。 </li><li> 1 DPFと3 DPFのGFPおよびRFPの蛍光の画面の胚。 </li><li> UASの次の世代を確立するために、高をmRFP式で胚を与えた交雑魚：mRFPを行。 </li></ol> 3。 F0魚のスクリーニング。 <ol><li>をmRFPの魚（ 図4）：ホモ接合UASで、個々のF0を渡ります。我々は通常、野生型またはヒョウの色素沈着パターンで線に私達のGBTsを注入し、私たちのホモ接合UAS：mRFPをラインは真鍮のバックグラウンドである。したがってGBTを注入し、F0の魚は、UASから容易に区別することができるmRFPを魚、スクリーニングされるF0が男性か女性だけでなく、記録の間違いに起因する潜在的なエラーおよび/または性別を決定したかどうかを記録する必要がありませんそれぞれの魚。非常に限られた経験を持つ担当者が、私たちの学部学生など、そのための設定と、魚の交配を分解することができます。このアプローチは、2つの異なる遺伝的背景であるという欠点を有している潜在的に機能表現型の喪失の解釈を複雑にし、使用されている。 </li><li>そのタンクにmRFPと魚：翌日、 真鍮の UASを返す。胚を収集し、スクリーニングしている間（我々はハーゲンエキソテラFaunarium小を使用していますが、どんな小さなタンクは、この目的のために使用することができます）は、個々の静的なタンクに胚を与えたF0の魚を置きます。 </li><li>清潔で転送が0日目の午後に新しいペトリ皿（&lt;皿につき100）に胚を収集した。 </li><li> GFPおよびRFPの蛍光1 DPFで、2 DPFおよび3 DPFの画面の胚。 GFPおよびRFP外両方に陽性胚を引き出します（複数のパターンがクラッチで観察されている場合）、GFP / RFP発現パターンによってそれらをソートし、F1世代を確立するためにそれらを上げる。 </li><li> （50〜100の胚の総数のうち）のみ負の胚を生成し、F0の魚を安楽死させる。 </li><li>陽性の第二のバッチを取得するために、もう一度、GFP / RFP陽性子孫を生成し、F0の魚を渡ります。 </li></ol> 4。F1魚のスクリーニング。 F1の魚は、F2ファミリーを確立するために、遺伝子トラップ発現パターンを文書化し、5 &#39;RACEおよびインバースPCRによる遺伝子トラップ座の分子同定のための胚のバッチを凍結するためにスクリーニングされる。 <ol><li>をmRFPの魚（ 図4）：ホモ接合UAS個々のF1魚を渡ります。 </li><li>次の日、胚を収集し、スクリーニングしている間、個々の静的なタンクに胚を与え、F1の魚を置く。 </li><li> GFPおよびRFPの蛍光1 DPFで、2 DPFおよび3 DPFの画面の胚。 GFPおよびRFP 24の両方に陽性の別々と写真胚。 </li><li> 5 DPFで、20 GFP / RFP陽性とインバースPCRおよび5 &#39;RACE 9,10による挿入的変異した遺伝子を同定するための20のGFP / RFP陰性胚のバッチを凍結する。 F2世代を確立するために、残りのGFP / RFP陽性胚を上げる。 </li></ol>

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</ol>

これらの著者は、開示することは何もありません。

ここで説明する遺伝子トラップベクターおよび方法は、既にいくつかの独立した研究室で使用されている。我々の経験では、プロセス内の2つの重要なステップがあります。最初の重要なステップは、注入されたF0胚における遺伝子トラップ高い集積率を達成することである。この段階での失敗は、多くの場合、注入試薬のRNaseのコンタミ、特にミニプレップDNAに起因することができます。これは、遺伝子トラップ実験のために1細胞期の胚を注入することも非常に重要である。我々の経験では、Tol2の媒介遺伝子導入することで、後の1細胞期よりまたは低品質のDNAを用いた注射場合でも、トランスジェニック系統を得ることが、非常に効率的である。遺伝子トラップ突然変異誘発を行う際に、ベクトル統合のごく一部は、効果的な遺伝子トラップイベントが発生するので標準以下の注射は、はるかに問題がある。第二の重要なステップは、我々のUASに交配することによって、遺伝子トラップ事象を確認することである。mRFPを行。をmRFP発現の欠如があるほとんどの場合、エンハンサートラップ事象を示す。しかし、時にはmRFPと発現の欠如は、14X、UASのサイレンシングを示すことがあります。 NSF tpl6と交配時に高いRFP発現を有する個人を使用して次の世代に伝播することにより、非サイレンシング状態にmRFPをライン：それは、UASを維持することが重要である。 私たちは、遺伝子トラップベクターおよびプロトコルにいくつかの改善を行うことを予見することができます。最初は、遺伝子トラップ構築物でより少ない反復UASを使用することである。なお、5×UASは、細胞培養実験において完全な活性を達成するのに十分である、より少ない反復UAS配列はメチル化およびサイレンシング6,25を受けにくいことが示されている。また、国際的なマウス遺伝子トラップコンソーシアムによって使用され、最近ではゼブラフィッシュ2,26,27に適合ベクターと同様に、完全に条件付き突然変異誘発のための遺伝子トラップベクターを設計することが可能であってもよい。別の改善は、異なるTを使用することですmRFPをレポーターライン： 美容 28、UASを生成するためのスリーピング例えばransposonシステム。これはincrossingによって直接F0sのレポーターラインとスクリーニングにTol2のベースの遺伝子トラップの注入を可能にする。さらに、これは、機能表現型の喪失の解釈がより簡単にすること、二つの異なる遺伝的背景の使用を排除するであろう。でも、これらの改善で、ここで紹介する一般的なのGal4遺伝子トラッププロトコルは、まだ完全に適用可能であろう。

挿入変異誘発は、マウスおよび植物のような多細胞生物、細菌および酵母などの単細胞生物からの種々のモデル系において遺伝子機能を解剖する強力なアプローチであることが証明された。任意の外来性DNA（ウイルス、トランスポゾンまたはプラスミド）は、エクソン又はプロモーターなどの遺伝子の必須要素を遮断することによって、変異原として働くことができる。エクソンは、典型的な脊椎動物のゲノムのわずか1〜3％含み、以来、このような単純なアプローチの効果的な目標は、大規模で複雑なゲノムにおいて非常に小さい。ゼブラフィッシュ11,12におけるレトロウイルス挿入変異の大成功によって例示されるような小さい有効目標サイズは、非常に高いベクトル積分率によって克服することができる。対照的に、イントロンは、脊椎動物ゲノムの約20-30％を含む。ゼブラフィッシュでは、効果的にイントロンにNULLまたは統合時に重度の低形質変異を導入するトランスポゾン挿入変異ベクトルはtransposoを壊す「遺伝子と命名されましたNS」（GBTs）8月10日 。効率的な遺伝子トラップの統合のために、彼らは最小限のトランスポゾン13,14を使用しています。GBTsの変異原性は、魚由来のスプライス受容および転写終結/ポリアデニル化配列に依存しています。GBT変異原性に責任の要素が隣接しているCreリコンビナーゼによる切除のための直接のloxP部位にあるため、CreをmRNAの注入は、いくつかのトランスポゾン配列が組み込み遺伝子座9,10のままであっても、GBT誘発される変異の効率的な復帰につながる。 最近発表されたGBTベクトルは、2つの潜在的な欠点につながる、遺伝子トラップレポーター9,10としてmRFPを使用してください。まず、直接蛍光レポーター融合タンパク質によって検出される十分に高いレベルで発現されるゼブラフィッシュ遺伝子のどの部分知られていない。第二に、遺伝子の小さなサブセットのみが、基本的な機能を有することが期待される。これは、ゼブラフィッシュdevelopmeに必要な唯一1,400-2,400の遺伝子があると推定されているNT 15,16。ほとんどの遺伝子トラップ変異体は、明白な表現型を表示するために、したがって、限られた有用性を有するであろうと予想されていない。これら2限界を克服するために、我々は、一次遺伝子トラップレポーターとしてのGal4-VP16で使用するGBT-R15 9,10を変更した（Balciuniene ら準備中）。 GBT-R15での8月レスmRFPを持つように、翻訳開始部位は、Gal4の-VP16から削除されました。遺伝子トラップ事象の直接検出のために、私たちのベクトルは14倍のGal4、UAS 17,18の制御下にEGFPレポーターが含まれています。 いくつかの追加機能は、当社の二連遺伝子トラップベクター中に操作されています。 UAS：のeGFPカセットを直接FRT部位（ 図1の灰色の山形）に隣接している。 eGFP蛍光でマークされていない遺伝子トラップ突然変異を残したeGFPカセット：のFlpリコンビナーゼmRNAの注入は、UASの切除につながる。その後、GFP蛍光によって特定の組織又は発生事象をマークするトランスジェニック系統で使用することができる。他のように、GBTsは、全遺伝子トラップカセットを直接loxP部位（ 図1の開いた五角形）が隣接している。これは容易に特定の遺伝子トラップの統合の間に因果関係の証明を確立した（ 図2）の表現型を観察し、Creリコンビナーゼの発現による遺伝子トラップイベントは、可逆的になります。最後に、遺伝子トラップカセットを反転し、I-SceIメガヌクレアーゼ部位（ 図1の黒三角）が隣接している。 ショウジョウバエでは、トランスポゾンの統合は、多くの場合、P要素の不正確な切除により失（欠陥）に変換されます。トランスポゾンの切除（またはそのような美しさは、piggyBacまたはAC / DSは眠るよう脊椎動物に積極的に他のトランスポゾン）が失につながる可能という証拠はない。したがって、我々はI-SceIではゼブラフィッシュにおいて欠失を誘導することができるという証拠がないにもかかわらず、欠失を誘導するための潜在的な代用法としてI-SceI制限酵素部位を含んだ。なお、一方のI-SceIメガメガヌクレアーゼはI-SceIメガヌクレアーゼによるDNAの切断は、酵母および哺乳動物細胞中で19-22、エラープローン非相同末端接合を含むDNA修復機構を研究するために使用され、ゼブラフィッシュ遺伝子導入を容易にするために使用することができる。 私たちの遺伝子トラップベクターの組込みは、二つの異なるメカニズムによってeGFP発現につながることができます。最初は、真の遺伝子トラップ·イベント（ 図1C）である：ベクター遺伝子（挿入的変異遺伝子のIMG）に統合され、内因性のIMG転写産物とのGal4-VP16の5 &#39;との間の融合転写物にされ、翻訳されているIMGとのGal4-VP16によってコードされるタンパク質のN末端を含む融合タンパク質。この融合タンパク質は、14倍UASに結合し、eGFPの転写を活性化する。第二に、あまり望ましくないイベントがエンハンサートラップ（ 図1D）である：eGFPの前にある最小プロモーターは、ABにおけるEGFPの生成をもたらす、組み込み部位の近くにエンハンサーの制御に該当するのGal4-VP16生産のSENCE。見積りでは、EGFP発現事象の30〜50％がエンハンサートラップによるもので50〜70％が遺伝子トラップ23によるものである（Balciuniene ら準備中）。をmRFPトランスジェニック系統（ 図1B）、レンズ固有のγCryでマーク便宜上：（。Balciunieneら準備中）のGFPのイベントのこれら2つのクラスを区別するために、我々は14xUASをした。遺伝子トラップ事象はGFPおよびRFP（ 図2のCとDを比較）の共発現によって確認される。 私たちのパイロットの画面では、トランスポゾンDNAとトランスポザーゼmRNAの混合物を注射された270のF0魚をスクリーニングした後、40以上の遺伝子トラップイベントを回復した。 NSFとFLR：私たちの遺伝子トラップ統合の二つは、以前に発表され、化学的に誘発された変異体との遺伝子に発生している。私たちの挿入変異体NSF tpl6とFLR tpl24の表現型は、表面的な表現型と区別できない対応する化学的に誘発突然変異体のS。我々はまた、遺伝子トラップイベントは、このようにヌル対立遺伝子の確率が高く、遺伝子の5 &#39;末端付近のイントロンに向かって付勢表示されていることを指摘した。私たちは、遺伝子トラップラインのすべてにおいて、UASサイレンシング（斑入り）ある程度の観察を行うと、いくつかの遺伝子座は、明らかに他より斑入りの影響を受けやすい。我々は簡単に一人でGFPの発現について選択することによって、少なくとも5世代にわたって私たちの遺伝子トラップラインのすべてを伝播することができたように、UASのサイレンシングは、遺伝子トラップ系統の増殖のために重要な問題であるとは考えていない。

<table><tbody><tr><td>Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>オプションのPB洗浄ステップは必須です</td></tr><tr><td>XbaI制限酵素</td><td>ThermoFisher</td><td>ER0681</td><td></td></tr><tr><td>mMessage Machine T3</td><td>Ambion</td><td>AM1348</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>フェノール抽出で置き換えることができます降水。LiClは使用しないでください!</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>アンビオン</td><td>AM9937</td> 非<td>DEPC処理された</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス製マイクロインジェクション針用頭蓋骨</td><td>ワールド精密機器</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>校正用微小頭蓋</td><td>ドラモンドサイエンティフィック</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>マイクロローダーチップ</td><td>エッペンドルフ</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>ニードルプーラー *</td><td>サッターインスツルメンツ</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクション用実体顕微鏡 * </td><td>ニコン</td><td>SMZ1500</td><td>私たちはまた、Wild 5MとオリンパスSZ61を透過光スタンド</td></tr><tr><td>ピコインジェクター</td>と組み合わせて使用します *<td>ハーバードインスツルメンツ</td><td>Pli-90</td> 私たちはまた、GFP/RFP蛍光を備えた<td>Pli-100</td></tr><tr><td>スクリーニング顕微鏡を使用しています *</td><td>ツァイ</td>ス<td>ツァイスAxioImager</td><td>5X Fluar対物レンズは十分な作動距離を持っています</td></tr><tr><td>GFP/RFP蛍光を用いたスクリーニング顕微鏡 *</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* 当研究室でうまく使用しているからこそ、この装置をご提案いたします。各カテゴリでは、複数のメーカーからいくつかの比較可能なオプションが利用可能です。</td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュにおけるgal4のを用いた遺伝子トラップ

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

大型クラッチサイズと光学的に透明な胚の外部開発は、ゼブラフィッシュの突然変異した遺伝子の発現をタグ付けする蛍光レポーターを用いたin vivo挿入変異誘発のための例外的な脊椎動物のモデルシステムを作る。いくつかの研究室は記者1-7として蛍光タンパク質、Gal4の-とのlexAベースの転写活性化因子を使用して、ゼブラフィッシュでエンハンサーと遺伝子トラップベクターを構築し、テストしている。 （まれにヌル対立遺伝子を生じなかった遺伝子に例えば統合）次善ジェンシー（ 例えばエンハンサーおよび遺伝子トラップ事象を区別する能力の欠如）と低変異原性：これらのベクターは、2つの潜在的な欠点を持っていた。遺伝子ブレイキングトランスポゾン（GBTs）は、これらの欠点8月10日に対処するために開発された。遺伝子トラップイベントの直接検出のための二次レポーターとしてのeGFP：我々は、一次遺伝子トラップレポーターを追加しましたUASとしてのGal4-VP16で使用するために、最初のGBTベクトルの1、GBT-R15を変更した。 A主な遺伝子トラップレポーターとしてのGal4-VP16のpplicationは2つの主な利点を提供します。まず、低い発現レベルで発現する遺伝子の感度を増加させる。第二に、それは非常に特定の組織における他の導入遺伝子の発現を指示するためのGal4ドライバとして遺伝子トラップ系統を使用するために研究者を可能にする。これは、遺伝子トラップ統合が明白な表現型をもたらさないことがあり、非必須または冗長機能を持つ遺伝子のために特に適切である。一次遺伝子トラップレポーターとしてのGal4-VP16を使用することの欠点は、得られたGal4-VP16融合タンパク質が核に入ることができそうにないと活性化するように、N-末端シグナル配列を有するタンパク質をコードする遺伝子は、トラッピングに適していないということである転写。重要なのは、Gal4の-VP16の使用は、核タンパク質のために事前に選択されません：私たちは、核、細胞質と細胞質膜に機能するタンパク質をコードする遺伝子に遺伝子トラップ突然変異を回復した。

成功した注射では、胚の少なくとも80％がGFP蛍光のある程度（ 図3）を表示する遺伝子トラップDNA / Tol2トランスポゾンのトランスポザーゼmRNAの混合物を注射した。明るいGFP-陽性胚（ 図3C）は、F0·プールを確立するために選択された場合、約10でスクリーニングしF0フィッシュ遺伝子トラップ子孫を生じるであろう。遺伝子トラップイベントが回収されるF0の魚の中では、ほとんどが、いくつかの非発現トランスポゾン統合に加えて、単一の遺伝子トラップイベントを送信する。しかし、我々は、単一のF0個体に由来する4遺伝子トラップ行まで確立しています。遺伝子トラップ系統におけるGFP / RFP発現パターンは、（嗅球内など）非常に組織の特定にかなりのユビキタスの範囲にある。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" /> 図1。 T彼は、含有GAL4二連遺伝子トラップベクターGBT-B1とその応用。 A. Gal4の含有遺伝子トラップベクターの構成要素：Tol2の5 &#39;とTol2 3&#39;は、最小限のトランスポゾンは、13を終了し、CSA、コイβ-アクチンスプライスアクセプター8; ^のGal4-VP16、8月レスのGal4-VP16; ZP（ GBT-R15 9,10からA）、ゼブラフィッシュβ-アクチン3 &#39;UTRおよびポリ（A）要素。 eGFP発現カセット17,18：14XUAS、SV40のeGFPおよびpの（A）は、UASの成分である。矢印は、UASの活性化を示しています。のGal4-VP16によるEGFPを遺伝子トラップによって生成B.ザ·14XUAS：GFPカセット：mRFPを導入遺伝子は、レンズ固有のγCryでマーク。矢印は、UASの活性化を示しています。 トランスでのGal4-VP16によってMRFP C.遺伝子トラップイベントを。。青いボックスはエクソンです。スプライシングは、破線で示されている。D.エンハンサートラップイベント。エンハンサー（ブラウンボックス）に近いベクトルの統合は、（このエンハンサーの制御下に茶色の矢印を最小限にeGFPプロモーターを置くことができる）。これは、eGFPの組織特異的発現をもたらすであろう、しかしのGal4-VP16が行われないので、mRFPを発現が活性化されないであろう。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" /> 図2。 Creリコンビナーゼを用いて、遺伝子トラップ事象の復帰。遺伝子トラップ突然変異（A）とのCre-復帰遺伝子トラップ対立遺伝子（B）は、B.図... C、D. GFP（C）の同時発現およびNSF tpl6遺伝子の神経系におけるRFP（D）トラップライン。NSF tpl6胚へのCre RNAのE、F·インジェクションは、GFP（E）およびRFP（F）式の損失につながる。期待どおり、レンズ内のGFP発現の減少は存在しないことに注意してください。 図3。 GBT-B1（pDB783）遺伝子トラップを注入した胚。 。A.胚はpGBT-B1（pDB783）体内で単独の表示はほとんどGFP蛍光を注射されたB、C胚はpGBT-B1とTol2トランスポゼースmRNAを注入：子育てのために選択された胚（B）と高発現体のランダムなグループを（C）。 <img alt="図4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" /> 図4。のGal4遺伝子トラップ系統の確立のための実験概要。だけでは緑色の遺伝子トラップまたはエンハンサートラップイベントのモザイク現象を示している曇りの重複赤/緑の構造は、GFPおよびRFPの共発現を示している。

このプロトコルは、ゼブラフィッシュにおける二次レポーターとして、第一次報告およびGFP / RFPとしてのGal4-VP16を用いた遺伝子トラップ挿入変異誘発方法が記載されている。 GFPおよびRFPを共発現が約1 10人に高発現F0魚の歩留まり遺伝子トラップ子孫。スクリーニング手順は、容易に挿入突然変異画面を行なう研究室のサイズに適合するようにスケーリングすることができる。

ゼブラフィッシュにおけるGal4のを用いた遺伝子トラップ

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

この手順の全体的な目的は、GAL4およびVP16を主要なジーントラップリポーターとするベクター上の遺伝子破壊トランスポゾンを用いて、変異魚を作製することです。これは、まずジーントラップベクターとTol2トランスポザーをゼブラフィッシュ胚に共注入することで達成されます。注入された胚は受精後3日目にGFP蛍光によりスクリーニングされ、最も輝度の高い胚の上位約30%を選択してF0プールを確立します。次に、ジーントラップイベントの生殖細胞系列への伝達をスクリーニングするため、F0個体をU-A-S-M-R-F-Pテスター系統と交配させます。最終ステップとして、F1個体を戻し交配させてF2世代を確立し、インバースPCRおよび5' RACEによるジーントラップイベントの分子生物学的特性解析のための胚を調製します。最終的に、スクリーニングしたF0個体の約10分の1が、ジーントラップ子孫を生じさせると考えられます。タンパク質コード遺伝子の開始領域に組み込まれた際に変異を導入しないように設計されたGene breaking transposon（GBT）を開発しました。当研究室のGBTベクターでは、主要なジーントラップレポーターとしてG4P16を使用しています。この改変により、低発現遺伝子に対する感度が向上し、ジーントラップ変異体をオーバーアボイド表現型なしに、他のトランスジェンの組織特異的発現のためのG4ドライバーとして利用することが可能になりました。本手法の主なボトルネックは、F0世代の魚の生殖細胞において十分に高い割合でジーントラップ統合を実現することにあると考えられます。本デモンストレーションでは、DNA調製、マイクロインジェクション、およびF0スクリーニングといういくつかの重要なステップについて説明します。GBTB1ジーントラップベクターは、主要なジーントラップレポーターとしてGAL4-VP16を使用しています。遺伝子トラップ統合には、末端にMinimal tall two transposeを配置して使用します。遺伝子トラップイベントは、14 X GAL four UASの制御下にあるEGFPレポーターによって直接検出されます。遺伝子トラップカセット全体は、ダイレクトロックPサイトによって挟まれています。これにより、特定のジーントラップ挿入と観察された表現型との間の因果関係を証明するために、Creリコンビナーゼを発現させることでジーントラップイベントを可逆的にすることが可能です。さらに、U-A-S-E-G-F-PカセットはダイレクトFRTサイトによって挟まれています。flipリコンビナーゼmRNAを注入すると、U-A-S-E-G-F-Pカセットが切り出され、ジーントラップ変異がEGFP蛍光で標識されなくなります。これにより、マイクロインジェクション前にGFP蛍光で特定の組織や発生イベントを標識しているトランスジェニック系統での利用が可能になります。DNAトランスポゾンおよびトランスポザーmRNAを調製します。GBTBシングルジーントラップベクターDNAを調製します。標準的なミニプレップキットを使用し、メーカーのプロトコルに従って調製しますが、DNA調製時にはPB洗浄ステップを必ず含めてください。そうしないと、ミニプレップDNAにRNAが混入し、トランスポゼースmRNAの分解を招く恐れがあります。DNAをRNAフリーの水で10 nanograms per microliterに希釈します。2種類のトランスポゼースmRNAを調製するため、まずXboIを用いてpT3TS-T2を直線化します。次に、1箇所の変更を加えたM message mMachine T3 in vitro transcription kitを使用して、直線化DNAを転写します。DNA処理ステップの後、0.5 µLのRibLock RNA inhibitorを添加します。標準的なキットを用いてmRNAを精製し、アガロースゲル電気泳動によりin vitro転写mRNAの品質を評価します。mRNAをRNase-free waterで40 ng/µLに希釈し、2 µLずつ分注して-80 °Cで保存します。マイクロインジェクションの直前に、2 µL分注したtransposase mRNAに、希釈したtransposase DNA 8 µLを加えて注入液を調製します。標準的なマイクロインジェクション法を用い、卵黄と細胞質（yolk blastomere）の境界を標的にして、3 nanolitersのDNA/RNA混合液をゼブラフィッシュ受精卵1個の卵黄に注入します。注入後、品質管理として、注入後に残った注入液5 microlitersを1%アガロースゲルで電気泳動し、トランスポゼースmRNAが分解されていないことを確認します。注入から約6〜8時間後、未受精卵および死細胞を除去し、100 millimeterのペトリ皿1枚につき60〜80個の胚を分配します。受精後1日目、2日目、および3日目に、異常胚および死胚を除去します。受精後3日目には、蛍光装置付き実体顕微鏡または正立顕微鏡を用いて観察を行います。胚をスクリーニングし、異常のある胚を除去します。明らかな欠陥のない残りの胚をスクリーニングしてください。GFP蛍光について、最も輝度の高いF zero胚を選択し、当研究室の標準的なゼブラフィッシュ飼育手順に従って育成します。GBTは通常、野生型またはレオパード型の色素パターンを持つ系統に注入されます。飼育に選別された注入胚の20%から30%が成体まで生存することが期待されます。GBTB one gene trapベクターの組み込みは、2つの異なるメカニズムによってEGFPの発現を誘導します。1つ目は、真のジーントラップイベントです。ベクターが遺伝子に組み込まれると、その内因性遺伝子転写物の5'末端とGAL4-VP16との間の融合転写物が形成され、タンパク質のN末端と、挿入された変異遺伝子およびGAL4-VP16を含む融合タンパク質へと翻訳されます。この融合タンパク質が14×UASに結合し、EGFPの転写を活性化させます。2番目の望ましくない事象はエンハンサートラップです。EGFPの前方にある最小プロモーターが、組み込み部位近傍のエンハンサーの制御下に置かれることで、GAL4やVP16が存在しなくてもEGFPが産生されます。これら2つの事象を区別するために、レンズ特異的なγ-クリスタリンGFPで標識された14X UAS-mRFPトランスジェニック系統が作製されました。ジーントラップ事象は、GBT注入魚とホモ接合型U-A-S-M-R-F-P魚を交配させ、GFPとRFPの共発現をスクリーニングすることで検証します。この共発現は、GAL4-VP16が生成され、トランスにU-A-S-M-R-F-Pを活性化させた場合にのみ可能となります。F0世代の魚のスクリーニング手順を開始するには、個々のF0魚をホモ接合型U-A-S-M-R-F-P魚と交配させます。GBT注入魚は野生型またはレオパード型の色素パターンを持ち、ホモ接合型U-A-S-M-R-F-P系統はブラス型の背景を持つため、F0魚をU-A-S-M-R-F-P魚から容易に区別でき、スクリーニング対象となるF0魚がオスかメスかを記録する必要がなくなり、また各魚の性の判定や記録時のミスによる潜在的なエラーを排除できます。翌日、真鍮色のU-A-S-M-R-F-P魚をタンクに戻します。胚を提供したF0魚は個別の静置タンクに入れ、胚を回収してスクリーニング用に洗浄し、0日目の午後に回収した胚を新しいペトリ皿に移します。受精後1日目および3日目に、胚のGFPおよびRFP蛍光をスクリーニングします。GFPおよびRFPの両方で陽性となった胚を回収し、GFPおよびRFPの発現パターンに基づいてソートします。1つのクラッチ内で複数のパターンが観察された場合は、それらを育成してF1世代を確立させます。なお、GFP陽性かつRFP陰性の3D PF胚は、エンハンサートラップ事象を示すため、回収しません。GFP-RFP陽性の次世代個体を生じさせたF0世代の魚を再度交配させ、2回目の陽性個体群を得ます。F1世代の魚をスクリーニングしてF2ファミリーを確立し、ジーントラップの発現パターンを記録するとともに、ジーントラップ遺伝子座の分子同定のために胚のバッチを凍結保存します。まず、翌日に個々のF1世代の魚をホモ接合体のUAS-mRFP魚と交配させます。胚を産み出したF1世代の魚を個別の静置水槽に移し、受精後1日でスクリーニング用に胚を回収します。RFPのラベル表示がまだ現れていない可能性があるため、受精後3日に胚をスクリーニングしてGFP蛍光陽性胚を選別し、さらにGFPとRFPの両方の蛍光を確認して二重陽性胚を選別します。その後、受精後5日にGFPとRFPの両方に陽性である胚を撮影し、インバースPCRおよび5' RACEによる挿入変異遺伝子の同定のため、GFP-RFP陽性胚20個とGFP-RFP陰性胚20個をバッチごとに凍結します。注入に成功した場合は、残りのGFP-RFP陽性胚を育成してF2世代を確立させます。gene trap DNAとtransposase mRNAの混合液を注入した胚の少なくとも80%に、ある程度のGFP蛍光が認められます。GFPの発現が低い場合は、注入の失敗か、あるいはRNA汚染によるtransposase RNAの分解が考えられます。F0プールを確立するために最も明るいGFP陽性胚を選択した場合、スクリーニングしたF0魚の約10匹に1匹から、gene trapイベントが回収されるF0魚由来のgene trap子代が得られます。ほとんどの場合、いくつかの非発現的なトランスポゾン挿入に加えて、単一のジーントラップイベントが伝播します。ジーントラップカセット全体がダイレクトloxPサイトに挟まれているため、この図において変異遺伝子のエキソンを青いボックスで示したすべてのジーントラップ変異は、Creリコンビナーゼの発現によって可逆的です。これらの画像は、NSFTP6ジーントラップ系統の神経系におけるGFPとRFPの共発現を示しています。NSFTP6胚にCre RNAを注入すると、GFPおよびRFPの発現が消失します。予想通り、レンズにおけるGFPの発現は減少していないことに注意してください。ここで概説した手順の多くは、他のジーントラップスクリーニングや、TOL2およびその他のトランスポゾンを用いた通常のトランスジェニック実験にも適用可能です。ここで概説したジーントラップの手順を用い、週に20から30回のF0戻し交配を行うことで、週に1つのジーントラップが得られるはずです。ただし、この手順は容易にスケールアップすることが可能です。

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生物学

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