ゼブラフィッシュにおけるGal4のを用いた遺伝子トラップ

この手順の全体的な目標は、GAL 4、VP 16を主要な遺伝子トラップレポーターとしてベクター上の遺伝子破壊転置を使用して突然変異魚を作製することです。これは、最初に遺伝子トラップベクターと背の高い2つの転位をゼブラフィッシュの胚に同時注入することによって達成されます。注入された胚は、受精後3日目にGFP蛍光についてスクリーニングされ、最も明るい胚の約30%が選択されてFゼロプールが確立されます。

次に、F ゼロ魚を U-A-S-M-R-F-P テスター ラインに交配して、遺伝子トラップ イベントの生殖細胞系伝達をスクリーニングします。最後のステップは、F1を凌駕してFの2世代を確立し、インバースPCRとファイブプライムレースによる遺伝子トラップイベントの分子特性評価のための胚を生成することです。最終的には、スクリーニングされたFゼロ魚の約10匹に1匹が遺伝子トラップの子孫を産むはずです。

遺伝子破壊トランスポは、タンパク質をコードする遺伝子の入口に組み入れたときに突然変異を生じさせないように設計されています。当社のGBTベクターは、主要な遺伝子トラップレポーターとしてG 4 P 16を使用しています。この修飾により、低レベルで発現する遺伝子に対する感度が向上し、他の導入遺伝子の組織特異的発現のG4ドライバーとして、表現型を過度に回避することなく遺伝子トラップ変異体を使用することが可能になります。

私たちの方法の主なボトルネックは、F ゼロ魚の生殖系列で十分に高い遺伝子トラップ統合を達成することにあると考えています。このデモンストレーションでは、DNA調製、MICROINJECTION、Fゼロスクリーニングなど、いくつかの重要なステップについて説明します。GBTB one gene trap vectorは、主要な遺伝子トラップレポーターとしてGAL four VP 16を使用します。

端部に最小の高さの2つの転置は、遺伝子トラップの統合に使用されます。遺伝子トラップイベントは、14 X GAL four UASの制御下にあるEGFPレポーターによって直接検出されます。遺伝子トラップカセット全体には、直接ロックP部位が隣接しています。

これにより、特定の遺伝子トラップの統合と観察された表現型との間の因果関係の証明を確立するために、クリーコームの発現により遺伝子トラップイベントを可逆的にすることができます。さらに、U-A-S-E-G-F-Pカセットの側面には、直接FRTサイトがあります。フリップコームmRNAの注入は、U-A-S-E-G-F-Pカセットの切除につながり、遺伝子トラップ変異はEGFP蛍光によってマークされないままになり、マイクロインジェクションの前にGFP蛍光によって特定の組織または発生イベントをマークするトランスジェニックラインでの使用が可能になります。

DNAへの転位を調製し、mRNAを転置します。GBTB one gene trap vector DNAを調製します。標準的なミニ調製キットを使用し、メーカーのプロトコルに従って、DNAを調製する際にPB洗浄ステップを含めることが不可欠です。

さもなければ、mini準備DNAはRNAsによって汚染され、転位 Mr.NA の分解につながる、RNAの自由な水のDNAをマイクロリットルあたり10ナノグラムに薄める。背の高い2つの転置mRNAを調製するには、まずxbo oneを使用してPTを3つTSTを2つ直鎖化します。次に、MメッセージマシンT three in vitro transcription kitを用いて、1つの修飾を施したLinearized DNAを転写します。

DNAの処理ステップ後に0.5マイクロリットルのリブロックRNA阻害剤を添加し、標準キットを使用してmRNAを精製し、アグロスゲル電気泳動によりin vitro転写mRNAの品質を評価します。RNA遊離水中のmRNAを1マイクロリットルあたり40ナノグラムに希釈し、マイクロインジェクションの直前に2マイクロリットルのアリコートとして摂氏マイナス80度で保存します。2マイクロリットルのトランスポーズmRNAのアリコートに、希釈したDNA上のトランスポーズ8マイクロリットルを添加して、インジェクションミックスを調製します。

標準的なマイクロインジェクション技術を使用して、1細胞ゼブラフィッシュ胚の卵黄に3ナノリットルのD-N-A-R-N-A混合物を注入します 卵黄冒涜界面を目指して、注射後、1%アロスゲルに残りの注入溶液5マイクロリットルを1%arosゲルに流して、注入後約6〜8時間でmRNAが転位して分解されていないことを確認します。未受精胚や死んだ胚を取り出し、100ミリメートルのペトリ皿あたり60〜80個に胚を分配します。異常胚や死んだ胚は、受精後1日、受精後2日、受精後3日、受精後3日、受精後3日で、蛍光を装着した実体顕微鏡または正立顕微鏡で摘出します。

胚をスクリーニングし、異常な胚を切除します。残りの胚を明らかな欠陥なくスクリーニングします。GFP蛍光の場合、最も明るいFゼロ胚を選択し、この研究室で標準的なゼブラゼブラフィッシュの飼育手順を使用して育てます。

GBTは通常、野生型またはヒョウの色素沈着パターンを持つラインに注入されます。飼育用に選択された注入された胚の20〜30%が成人期まで生存すると予想するのが妥当です。GBTBの1つの遺伝子トラップベクターを統合すると、2つの異なるメカニズムでEGFPの発現につながる可能性があります。

1つ目は、真の遺伝子トラップイベントです。このベクターは、その内在性遺伝子転写産物の5プライムとGAL4との間の融合転写産物を遺伝子に統合し、VP16を作製し、タンパク質の末端を含む融合タンパク質に翻訳し、挿入変異遺伝子とGAL4、VP16で被覆する。この融合タンパク質は14 XUASに結合し、EGFPの転写を活性化します。

2 番目に望ましくないイベントは、エンハンサー トラップです。EGFPの前にある最小のプロモーターは、GAL4、VP16の不在下でEGFPの生産につながる統合サイト近くのエンハンサーの制御下にあります。これら2つのクラスの事象を区別するために、レンズ特異的なガンマ結晶GFPでマークされた14個のX-U-A-S-M-R-F-Pトランスジェニックラインを作製した。

遺伝子トラップイベントは、GBT注入された魚とホモ接合体のU-A-S-M-R-F-P魚と交配し、GFPとRFPの共発現をスクリーニングすることによって検証されます。これは、GAL 4、VP 16が作られ、トランスでU-A-S-M-R-F-Pを活性化して、ホモ接合型のU-A-S-M-M-R-F-P魚とFゼロ魚を交配するFゼロ魚をスクリーニングする手順を開始する場合にのみ可能です。GBTを注入した魚は野生型またはヒョウの色素沈着パターンを持ち、ホモ接合型のU-A-S-M-R-F-Pラインは真鍮の背景にあるため、Fゼロの魚はU-A-S-M-R-F-Pの魚と容易に区別でき、スクリーニングされたFゼロがオスかメスかを記録する必要がなくなり、各魚の性別の記録や性別の判断に誤りから生じる潜在的なエラーも発生しません。翌日に。

真鍮のU-A-S-M-R-F-Pの魚を水槽に戻します。胚を与えたFゼロフィッシュを個々の静的タンクに入れ、胚をスクリーニングするために収集し、クリーンに収集し、ゼロ日目の午後に収集した胚を新しいシャーレに移します。受精後1日および受精後3日で胚のGFPおよびRFP蛍光をスクリーニングします。

GFPとRFPの両方に陽性の胚を引き出し、G-F-P-R-F-P発現パターンでソートします。クラッチに複数のパターンが観察された場合は、それらを上げてF1世代を確立します。GFPに陽性であるがRFPには陽性ではない3D PF胚は、エンハンサートラップイベントを表すため、引き出されないことに注意してください。

G-F-P-R-F-P陽性の子孫を生み出したFゼロ魚を再び交配して、2番目の陽性のバッチを取得します。F1魚は、遺伝子トラップ発現パターンを文書化し、遺伝子トラップ遺伝子座の分子同定のために胚のバッチを凍結するためにF 2ファミリーを確立するためにスクリーニングされます。胚を与えたF1魚を個々の静的タンクに入れ、受精後1日で胚をスクリーニングするために胚を採取します。

RFP標識はまだ出ていない可能性があるため、胚のGFP蛍光をスクリーニングし、受精後3日でGFP陽性胚を引き出し、GFPとRFP蛍光の両方についてスクリーニングし、ダブルポジティブを引き出します。次に、受精後5日目にGFPとRFPの両方に陽性の胚を撮影し、20 G-F-P-R-F-P陽性および20 G-F-P-R-F-P陰性の胚の凍結バッチを使用して、インバースPCRおよびファイブプライムレースによる挿入変異遺伝子の同定を行います。残りのG-F-P-R-F-P陽性胚を育てて、成功した注射でF2世代を確立します。

遺伝子トラップDNAを注入した胚の少なくとも80%は、背の高い2つの転位mRNA混合物がある程度のGFP蛍光を示します。GFP発現が低い場合は、注入に失敗したか、RNAの汚染による転位RNAの分解を示します。最も明るいGFP陽性胚を選択してFゼロプールを確立すると、スクリーニングされたFゼロ魚の約10匹に1匹が、遺伝子トラップイベントが回復したFゼロ魚の中から遺伝子トラップ子孫を産むことになります。

ほとんどは、いくつかの非発現トランスポーズ統合に加えて、単一の遺伝子トラップイベントを伝達します。遺伝子トラップカセット全体が直接ロックP部位に隣接しているため、この図に示されている突然変異遺伝子のエクソンを表す青いボックスで示されている遺伝子トラップ変異は、CREコームの発現によって可逆的です。これらの画像は、NSF TP 6遺伝子トラップラインのN SF TP six胚へのCree RNA注入の神経系におけるGFPとRFPの共発現がGFPおよびRFP発現の喪失につながることを示しています。

レンズ内のGFP発現は思うように減少していないことに注意してください。ここで概説した手順のほとんどは、他の遺伝子トラップスクリーニングだけでなく、TOL 2や他のトランスポゾンを用いた通常のトランスジェネシス実験にも適用できます。ここで概説した遺伝子トラップ手順を使用します。1週間に20〜30回のFゼロアウトクロスを設定すると、1週間に1つの遺伝子トラップが回復するはずです。

ただし、この手順は簡単にスケールアップできます。