ゼブラフィッシュにおけるGal4のを用いた遺伝子トラップ

この手順の全体的な目的は、GAL4およびVP16を主要なジーントラップリポーターとするベクター上の遺伝子破壊トランスポゾンを用いて、変異魚を作製することです。これは、まずジーントラップベクターとTol2トランスポザーをゼブラフィッシュ胚に共注入することで達成されます。注入された胚は受精後3日目にGFP蛍光によりスクリーニングされ、最も輝度の高い胚の上位約30%を選択してF0プールを確立します。

次に、ジーントラップイベントの生殖細胞系列への伝達をスクリーニングするため、F0個体をU-A-S-M-R-F-Pテスター系統と交配させます。最終ステップとして、F1個体を戻し交配させてF2世代を確立し、インバースPCRおよび5' RACEによるジーントラップイベントの分子生物学的特性解析のための胚を調製します。最終的に、スクリーニングしたF0個体の約10分の1が、ジーントラップ子孫を生じさせると考えられます。

タンパク質コード遺伝子の開始領域に組み込まれた際に変異を導入しないように設計されたGene breaking transposon（GBT）を開発しました。当研究室のGBTベクターでは、主要なジーントラップレポーターとしてG4P16を使用しています。この改変により、低発現遺伝子に対する感度が向上し、ジーントラップ変異体をオーバーアボイド表現型なしに、他のトランスジェンの組織特異的発現のためのG4ドライバーとして利用することが可能になりました。

本手法の主なボトルネックは、F0世代の魚の生殖細胞において十分に高い割合でジーントラップ統合を実現することにあると考えられます。本デモンストレーションでは、DNA調製、マイクロインジェクション、およびF0スクリーニングといういくつかの重要なステップについて説明します。GBTB1ジーントラップベクターは、主要なジーントラップレポーターとしてGAL4-VP16を使用しています。

遺伝子トラップ統合には、末端にMinimal tall two transposeを配置して使用します。遺伝子トラップイベントは、14 X GAL four UASの制御下にあるEGFPレポーターによって直接検出されます。遺伝子トラップカセット全体は、ダイレクトロックPサイトによって挟まれています。

これにより、特定のジーントラップ挿入と観察された表現型との間の因果関係を証明するために、Creリコンビナーゼを発現させることでジーントラップイベントを可逆的にすることが可能です。さらに、U-A-S-E-G-F-PカセットはダイレクトFRTサイトによって挟まれています。flipリコンビナーゼmRNAを注入すると、U-A-S-E-G-F-Pカセットが切り出され、ジーントラップ変異がEGFP蛍光で標識されなくなります。これにより、マイクロインジェクション前にGFP蛍光で特定の組織や発生イベントを標識しているトランスジェニック系統での利用が可能になります。

DNAトランスポゾンおよびトランスポザーmRNAを調製します。GBTBシングルジーントラップベクターDNAを調製します。標準的なミニプレップキットを使用し、メーカーのプロトコルに従って調製しますが、DNA調製時にはPB洗浄ステップを必ず含めてください。

そうしないと、ミニプレップDNAにRNAが混入し、トランスポゼースmRNAの分解を招く恐れがあります。DNAをRNAフリーの水で10 nanograms per microliterに希釈します。2種類のトランスポゼースmRNAを調製するため、まずXboIを用いてpT3TS-T2を直線化します。次に、1箇所の変更を加えたM message mMachine T3 in vitro transcription kitを使用して、直線化DNAを転写します。

DNA処理ステップの後、0.5 µLのRibLock RNA inhibitorを添加します。標準的なキットを用いてmRNAを精製し、アガロースゲル電気泳動によりin vitro転写mRNAの品質を評価します。mRNAをRNase-free waterで40 ng/µLに希釈し、2 µLずつ分注して-80 °Cで保存します。マイクロインジェクションの直前に、2 µL分注したtransposase mRNAに、希釈したtransposase DNA 8 µLを加えて注入液を調製します。

標準的なマイクロインジェクション法を用い、卵黄と細胞質（yolk blastomere）の境界を標的にして、3 nanolitersのDNA/RNA混合液をゼブラフィッシュ受精卵1個の卵黄に注入します。注入後、品質管理として、注入後に残った注入液5 microlitersを1%アガロースゲルで電気泳動し、トランスポゼースmRNAが分解されていないことを確認します。注入から約6〜8時間後、未受精卵および死細胞を除去し、100 millimeterのペトリ皿1枚につき60〜80個の胚を分配します。受精後1日目、2日目、および3日目に、異常胚および死胚を除去します。受精後3日目には、蛍光装置付き実体顕微鏡または正立顕微鏡を用いて観察を行います。

胚をスクリーニングし、異常のある胚を除去します。明らかな欠陥のない残りの胚をスクリーニングしてください。GFP蛍光について、最も輝度の高いF zero胚を選択し、当研究室の標準的なゼブラフィッシュ飼育手順に従って育成します。

GBTは通常、野生型またはレオパード型の色素パターンを持つ系統に注入されます。飼育に選別された注入胚の20%から30%が成体まで生存することが期待されます。GBTB one gene trapベクターの組み込みは、2つの異なるメカニズムによってEGFPの発現を誘導します。

1つ目は、真のジーントラップイベントです。ベクターが遺伝子に組み込まれると、その内因性遺伝子転写物の5'末端とGAL4-VP16との間の融合転写物が形成され、タンパク質のN末端と、挿入された変異遺伝子およびGAL4-VP16を含む融合タンパク質へと翻訳されます。この融合タンパク質が14×UASに結合し、EGFPの転写を活性化させます。

2番目の望ましくない事象はエンハンサートラップです。EGFPの前方にある最小プロモーターが、組み込み部位近傍のエンハンサーの制御下に置かれることで、GAL4やVP16が存在しなくてもEGFPが産生されます。これら2つの事象を区別するために、レンズ特異的なγ-クリスタリンGFPで標識された14X UAS-mRFPトランスジェニック系統が作製されました。

ジーントラップ事象は、GBT注入魚とホモ接合型U-A-S-M-R-F-P魚を交配させ、GFPとRFPの共発現をスクリーニングすることで検証します。この共発現は、GAL4-VP16が生成され、トランスにU-A-S-M-R-F-Pを活性化させた場合にのみ可能となります。F0世代の魚のスクリーニング手順を開始するには、個々のF0魚をホモ接合型U-A-S-M-R-F-P魚と交配させます。GBT注入魚は野生型またはレオパード型の色素パターンを持ち、ホモ接合型U-A-S-M-R-F-P系統はブラス型の背景を持つため、F0魚をU-A-S-M-R-F-P魚から容易に区別でき、スクリーニング対象となるF0魚がオスかメスかを記録する必要がなくなり、また各魚の性の判定や記録時のミスによる潜在的なエラーを排除できます。翌日、

真鍮色のU-A-S-M-R-F-P魚をタンクに戻します。胚を提供したF0魚は個別の静置タンクに入れ、胚を回収してスクリーニング用に洗浄し、0日目の午後に回収した胚を新しいペトリ皿に移します。受精後1日目および3日目に、胚のGFPおよびRFP蛍光をスクリーニングします。

GFPおよびRFPの両方で陽性となった胚を回収し、GFPおよびRFPの発現パターンに基づいてソートします。1つのクラッチ内で複数のパターンが観察された場合は、それらを育成してF1世代を確立させます。なお、GFP陽性かつRFP陰性の3D PF胚は、エンハンサートラップ事象を示すため、回収しません。

GFP-RFP陽性の次世代個体を生じさせたF0世代の魚を再度交配させ、2回目の陽性個体群を得ます。F1世代の魚をスクリーニングしてF2ファミリーを確立し、ジーントラップの発現パターンを記録するとともに、ジーントラップ遺伝子座の分子同定のために胚のバッチを凍結保存します。まず、翌日に個々のF1世代の魚をホモ接合体のUAS-mRFP魚と交配させます。胚を産み出したF1世代の魚を個別の静置水槽に移し、受精後1日でスクリーニング用に胚を回収します。

RFPのラベル表示がまだ現れていない可能性があるため、受精後3日に胚をスクリーニングしてGFP蛍光陽性胚を選別し、さらにGFPとRFPの両方の蛍光を確認して二重陽性胚を選別します。その後、受精後5日にGFPとRFPの両方に陽性である胚を撮影し、インバースPCRおよび5' RACEによる挿入変異遺伝子の同定のため、GFP-RFP陽性胚20個とGFP-RFP陰性胚20個をバッチごとに凍結します。注入に成功した場合は、残りのGFP-RFP陽性胚を育成してF2世代を確立させます。

gene trap DNAとtransposase mRNAの混合液を注入した胚の少なくとも80%に、ある程度のGFP蛍光が認められます。GFPの発現が低い場合は、注入の失敗か、あるいはRNA汚染によるtransposase RNAの分解が考えられます。F0プールを確立するために最も明るいGFP陽性胚を選択した場合、スクリーニングしたF0魚の約10匹に1匹から、gene trapイベントが回収されるF0魚由来のgene trap子代が得られます。

ほとんどの場合、いくつかの非発現的なトランスポゾン挿入に加えて、単一のジーントラップイベントが伝播します。ジーントラップカセット全体がダイレクトloxPサイトに挟まれているため、この図において変異遺伝子のエキソンを青いボックスで示したすべてのジーントラップ変異は、Creリコンビナーゼの発現によって可逆的です。これらの画像は、NSFTP6ジーントラップ系統の神経系におけるGFPとRFPの共発現を示しています。NSFTP6胚にCre RNAを注入すると、GFPおよびRFPの発現が消失します。

予想通り、レンズにおけるGFPの発現は減少していないことに注意してください。ここで概説した手順の多くは、他のジーントラップスクリーニングや、TOL2およびその他のトランスポゾンを用いた通常のトランスジェニック実験にも適用可能です。ここで概説したジーントラップの手順を用い、週に20から30回のF0戻し交配を行うことで、週に1つのジーントラップが得られるはずです。

ただし、この手順は容易にスケールアップすることが可能です。