機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

この手順の全体的な目標は、ネイティブの構造、機能相互作用、および翻訳後修飾を維持しながら、酵母タンパク質を抽出することです。これは、最初に細胞を増殖させて目的のタンパク質の発現を誘導することによって達成されます。次に、採取した酵母細胞を適切な緩衝液でホモジナイズしてタンパク質を抽出します。

次に、清澄化された全細胞抽出物から目的のタンパク質を、樹脂の親和性を用いて精製します。手順の最終ステップは、精製されたタンパク質をアフィニティー樹脂から逃れて、さらなる分析または下流のアプリケーションを行うことです。最終的には、ウェスタンブロット分析に基づいて、タンパク質精製の修飾と相互作用を示す結果を得ることができます。

この手順を実演するのは、ウィリアム・アンド・メアリー大学の卒業生で、ここ数年は私の研究室で学部生の研究者として過ごしたEva's Kyです。ビーズビーズが他の既存の方法よりも優れている主な利点は、タンパク質機能相互作用と翻訳後修飾を保持する条件下で、複数のサンプルを迅速に処理および溶解できることです。ガラクトース誘導性6をコードするプラスミドとギャル陽性酵母株の形質転換細胞を開始するには、彼の選択のタグ付きタンパク質は、SDウラシルなどの適切な選択培地の5ミリリットルで形質転換体を接種し、2%のスクロースを含み、30°Cで一晩インキュベートし、翌日回転して、2%スクロースを含む選択培地で一晩の培養を33ミリリットルの最終容量に希釈し、600で光学密度になるようにしますナノメートルは0.3を測定し、摂氏30度と150RPMで振とうインキュベーターで成長します。

培養物が0.8〜1.5のOD 600に達したら、6%ガラクトースを含む3つのXYEPを17ミリリットル加えて、摂氏30度の振とうインキュベーターに2%ガラクトースを含む1つのXYEPを最終濃度として加え、さらに5〜6時間、所望のタンパク質の発現を誘導します。誘導培養遠心分離機の約150〜200 OD 600単位の細胞を5分間、摂氏4度で000 RPMで測定した後、1ミリリットルの氷冷1 XPBSと1×プロテアーゼ阻害剤カクテルを使用して細胞の口蓋を再懸濁し、それを2ミリリットルのスクリューキャップチューブに移し、15で1分間細胞を遠心分離します。 000 RPMと摂氏4度。上清をデカントした後、細胞ペレットを液体窒素で凍結して凍結した細胞ペレットにします。

200マイクロリットルの酸洗浄ガラスビーズと500マイクロリットルの氷冷溶解バッファーを追加します。チューブを常に氷の上に置いておきます。端がカットオフされたピペットチップを使用して、摂氏4度で短時間ピペットで上下させます。

セルのチューブをビーズミルバランスロックに入れ、製造元の指示に従って、毎秒5.5メートルで20秒間機械を運転します。次に、チューブをぬかるんだ氷の上に1分間置きます。抽出されたタンパク質をクリアするために合計6回繰り返し、摂氏4度で15, 000RPMで15分間遠心分離します。

次に、ウェスタンブロット用の全細胞抽出物またはWCEのサンプルを調製し、20%トリクロロ酢酸またはTCAボルテックスの800マイクロリットルに細胞の2つのOD 600単位に対応するWCEを混合する。50〜100マイクロリットルのアフィニティ樹脂で透明なWCEのサンプルを新しいマイクロ遠心分離チューブに精製するには、1ミリリットルの洗浄バッファーを追加してレジンを洗浄および平衡化し、レジンが再懸濁されるまで上部を下部に反転させます。5, 000 RPMおよび4 °Cで1分間回転させた後、上清を吸引して、洗浄されたビーズに100〜200マイクロリットルの透明な溶解物でアフィニティー精製のためのタンパク質を結合させ、溶解緩衝液を使用して総容量を1ミリリットルにします。

突然変異または4°Cでのロッキングで2〜5時間インキュベートします。液体窒素を使用して、残りの透明なWCEの凍結アリコートをスナップし、ライセートビート溶液が氷上でWCEウェスタンブロットサンプルをインキュベートしている間、さらに使用するまで摂氏マイナス80度で保存します。摂氏4度で15、000 RPMで2分半回転した後、ペレットを保持するように注意して上澄みをデカントし、ペレットに2%TCAの800マイクロリットルを追加し、2分半の回転を繰り返す前にチューブを渦巻

上清を慎重にデカントした後、100マイクロリットルのTCAサンプルバッファーとボルテックスを加えてペレットを溶解してから、サンプルをインキュベートします。摂氏100度のヒートブロックで2〜5分間、ペレットの残りを完全に溶解するのに2回目の時間がかかり、使用する準備ができるまで摂氏マイナス80度で溶解して保存するのが難しい場合があります。ライセートビーズサンプルをインキュベートしたら、5, 000 RPMおよび摂氏4度で1分間回転した後、洗浄バッファーを使用して樹脂を5回洗浄し、タンパク質を溶出します。

150マイクロリットルの溶出バッファーを樹脂液に4°Cで5分間添加します。5, 000 RPMおよび4°Cで1分間回転し、新しい管で上清を貯める。最後に、25マイクロリットルの2 x ドカル硫酸リチウムサンプルバッファーと2マイクロリットルのBMEから25マイクロリットルのUDタンパク質サンプルでウェスタンブロット用のサンプルを調製します。

この図に示すように、酵母細胞からは広範囲のタンパク質を再現性よく抽出することができます。さまざまな分子量にわたる離散的なバンドは、高品質のタンパク質抽出物を示しています。抽出物の品質は、特定のエピトープタグ付きタンパク質のウェスタンブロッティングによって確認できます。

これは、ガラクトース過発現V5タグ付きSumo Ligaseの代表的な結果であり、約120キロダルトンで移動するものです。一般に、部分的に分解されたタンパク質は、予想される重量より複数のフラグメントとして実行されますが、ここでは完全長タンパク質のみが観察されます。さらに、特定のタンパク質の高分子量添加は、翻訳後修飾を示している可能性があります。

例えば、ここでは、Sワン、デルタ40、フルレングスSIS1と相撲関係のラクトースオーバー発現を見ることができます。このウェスタンブロットで示されているように、修飾は内因的に発現したS染色体でも保存することができます。この図は、2つの核富化タンパク質SLX fiveとCS one delta four 40が私たちのwsからうまく精製されたことを示しています。

特に、6つのhissタグ付きタンパク質は、未変性条件と変性条件の両方でW'Sからアフィニティー精製できます。対照的に、SLX 5G STとCS one delta four 40 haは6ヒスエピトープを欠いていますが、ネイティブ条件下では、金属アフィニティ樹脂と非常に敏感な方法で相互作用します。CIS 1およびSLX 5は、程度は低いが、それらの金属配位リングドメインを介して金属親和性樹脂に結合できることを提案する。

私たちの知る限り、この特定の現象はまだ報告されていませんが、胆汁毒素Bサブユニットが天然のヒスタミン残基によって媒介される方法でニコラ親和性樹脂に結合する同様の状況が報告されています。この観察結果は、WCERのタンパク質が、少なくとも部分的に、タンパク質機能の研究のためにネイティブに折り畳まれていることを示唆しています。タンパク質複合体が全細胞抽出物中に無傷で残っていることを示すことが重要です。

代表的なデータから、WS cis oneにはCS one、delta four、40 SLX five、および負荷制御として機能する細胞質タンパク質であるP GK oneが存在することが明らかになりました。Delta four 40は、金属親和性樹脂に結合する固有の能力に基づいて、これらの抽出物から精製されました。また、SLX fiveとSIS oneを酵母細胞で共発現させると、EIT中のSLX fiveのレベルが上昇し、SLX fiveがSIS細胞と相互作用する可能性が高まった。

このビデオを見れば、ネイティブ条件下で酵母タンパク質を抽出、精製、視覚化するために、酵母細胞を増殖および処理する方法を十分に理解できるはずです。