機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

この手順の全体的な目的は、天然の構造、機能的相互作用、および翻訳後修飾を維持しながら酵母タンパク質を抽出することです。まず、目的タンパク質の発現を誘導するために細胞を培養します。次に、回収した酵母細胞を適切なバッファー中でホモジナイズし、タンパク質を抽出します。

次に、アフィニティーレジンを用いて、清澄化した全細胞抽出液から目的タンパク質を精製します。手順の最終ステップは、さらなる解析またはダウンストリームアプリケーションのために、アフィニティーレジンから精製タンパク質を溶出させることです。最終的に、ウェスタンブロット解析に基づいたタンパク質の精製、修飾、および相互作用を示す結果を得ることができます。

手順の実演は、過去数年間にわたり私の研究室で学部研究員として活動したウィリアム・アンド・メアリー大学卒業生のEva's Kyが行います。既存の他の手法と比較したビーズビーズ法の主な利点は、タンパク質の機能的相互作用や翻訳後修飾を維持する条件下で、多数のサンプルを迅速に処理および溶解できることです。まず、ガラクトース誘導性の6xHisタグ付き目的タンパク質をコードするプラスミドを、gal陽性酵母株に形質転換します。形質転換体を、2% sucroseを含むSD uracilなどの適切な選択培地5 mLに接種し、30 °Cで回転させながら一晩培養します。翌日、一晩培養した培養液を2% sucroseを含む選択培地で希釈し、600 nmにおける光学密度（OD₆₀₀）が0.3になるように最終容量を33 mLに調整します。その後、30 °C、150 RPMの振盪インキュベーターで培養します。

培養液のOD 600が0.8から1.5に達したとき、6% galactoseを含む3XYEPを17mL添加して目的タンパク質の発現を誘導し、最終濃度を2% galactoseを含む1XYEPとして、振とうインキュベーターにて30°Cでさらに5〜6時間培養します。誘導後の培養液のOD 600を測定した後、約150〜200 OD 600ユニット分の細胞を、4°C、5,000 RPMで5分間遠心分離します。次いで、1mLの氷冷1XPBS（1x プロテアーゼ阻害剤カクテル含有）を用いて細胞ペレットを再懸濁し、2mLスクリューキャップチューブに移して、4°C、15,000 RPMで1分間遠心分離します。上清をデカントした後、細胞ペレットを液体窒素で急速凍結し、凍結細胞ペレットとします。

酸洗浄済みガラスビーズを 200 µL、氷冷した溶解バッファーを 500 µL 加えます。チューブは常に氷上で保持してください。先端を切断したピペットチップを使用し、4 °C で短時間、吸い上げと吐き出しを繰り返します。

細胞が入ったチューブをビーズミルバランスロックにセットし、製造元の指示に従って5.5 meters per secondで20秒間運転します。その後、チューブを砕氷の上に1分間置きます。この操作を計6回繰り返し、抽出したタンパク質を回収するため、4 °Cにて15,000 RPMで15分間遠心分離します。

次に、ウェスタンブロッティング用の全細胞抽出液（WCE）サンプルを調製します。OD 600が2ユニットに相当する細胞量に対し、800 µLの20%トリクロロ酢酸（TCA）を加え、ボルテックスミキサーで混合します。清澄化したWCEサンプルを精製するために、50～100 µLのアフィニティーレジンを新しいマイクロ遠心チューブに移します。1 mLの洗浄バッファーを加え、レジンが再懸濁されるまで上下に反転させて洗浄および平衡化を行います。4°C、5,000 RPMで1分間遠心分離した後、上清を吸引除去します。アフィニティー精製によりタンパク質を結合させるため、洗浄済みビーズに100～200 µLの清澄化ライセートを加え、ライシスバッファーを用いて全量を1 mLにします。

4°Cで2〜5時間、緩慢に攪拌しながらインキュベートします。残りの透明なWCEを分注し、液体窒素で急速冷凍して-80°Cで保存します。その間、WCEウェスタンブロット用のサンプルとして、ライセート溶液を氷上でインキュベートします。4°C、15,000 RPMで2分30秒間遠心分離した後、ペレットを保持するように注意しながら上清をデカンテーションし、ペレットに800 µLの2% TCAを加えてチューブをボルテックスし、再び2分30秒間の遠心分離を繰り返します。

上清を注意深くデカンテーションした後、100 µLのTCAサンプルバッファーを加え、ボルテックスしてペレットを溶解させ、サンプルをインキュベートします。100 °Cのヒートブロックで2～5分間加熱し、溶解しにくいペレットの残渣を完全に溶解させるためにもう一度処理を行い、使用時まで-80 °Cで保存します。ライセートビーズサンプルをインキュベートした後、5,000 RPM、4 °Cで1分間遠心分離し、洗浄バッファーを用いてレジンを5回洗浄してタンパク質を溶出させます。

溶出バッファー150 µLを樹脂に加え、4 °Cで5分間インキュベートします。5,000 RPM、4 °Cで1分間遠心分離し、上清を新しいチューブに回収します。最後に、ウェスタンブロット用のサンプルを調製するため、25 µLの2x SDSサンプルバッファーに2 µLのBMEを加え、25 µLの抽出タンパク質サンプルに混合します。

この図に示されているように、酵母細胞から広範囲のタンパク質を再現性良く抽出することができます。幅広い分子量にわたって個別のバンドが観察されることは、タンパク質抽出物の品質が高いことを示しています。抽出物の品質は、特定のエピトープタグ付きタンパク質のウェスタンブロッティングによって確認できます。

ガラクトースにより過剰発現させたV fiveタグ付きSumoリガーゼの代表的な結果を示します。このタンパク質は約120 kilodaltonsで泳動されます。一般に、部分的に分解されたタンパク質は期待される分子量より低い位置に複数の断片として現れますが、ここではフルレングスのタンパク質のみが観察されています。さらに、特定のタンパク質において高分子量側にバンドが現れる場合は、翻訳後修飾を示唆している可能性があります。

例えば、ここでは乳糖で過剰発現させたsumo関連S1Δ440およびフルレングスのSIS1を確認できます。このウェスタンブロットで示されているように、内因性に発現したS1上でも修飾が維持され得ることが分かります。この図は、核に濃縮された2つのタンパク質であるSLX5およびCS1Δ440が、我々のwsから正常に精製されたことを示しています。

注目すべき点として、6xHisタグ付きタンパク質は、ネイティブ条件および変性条件の両方においてW'Sからアフィニティー精製することが可能です。対照的に、SLX 5G STおよびCS one delta four 40 haは6xHisエピトープを欠いていますが、ネイティブ条件では依然として金属アフィニティーレジンと塩濃度依存的に相互作用します。このことから、CIS one、およびそれよりは程度が低いもののSLX fiveが、その金属配位リングドメインを介して金属アフィニティーレジンに結合できると考えられます。

我々の知る限り、この特定の現象はまだ報告されていませんが、コレラ毒素Bサブユニットが、その天然のヒスチジン残基によって媒介される形式でNi-NTAアフィニティーレジンに結合するという類似の状況が記述されています。この観察結果は、WCER中のタンパク質が、少なくとも部分的には、タンパク質機能の研究に適した天然の状態に折りたたまれていることを示唆しています。全細胞抽出物においてタンパク質複合体が完全な状態で維持されていることを示すことは重要です。

代表的なデータから、CS one delta four 40、SLX five、およびローディングコントロールとして機能する細胞質タンパク質であるP GK oneがWS cis oneに存在することが明らかになった。Delta four 40は、金属アフィニティ樹脂に結合する固有の能力に基づき、これらの抽出液から精製された。さらに、酵母細胞でSLX fiveとSIS oneを共発現させたところ、EITにおけるSLX fiveのレベルが上昇し、SLX fiveがSIS oneと相互作用している可能性が示唆された。

このビデオを視聴することで、天然条件（ネイティブ条件）下で酵母タンパク質を抽出、精製、および可視化するために、酵母細胞をどのように培養し、処理するかについて十分な理解が得られます。