実験的転移アッセイ

次の実験の全体的な目標は、尾静脈注射によってヒト癌細胞の転移能力をテストすることです。免疫不全マウスでは、細胞を注射用に調製します。その後、免疫不全マウスに細胞を注入すると、1〜2カ月後に肺転移が生じます。

マウスを解剖し、肺転移を定量化して培養します。このタイプのアッセイの結果は、特定の種類のがん細胞の転移の程度を示しています。こんにちは、ロチェスター大学生物医学遺伝学部のLE博士研究室のソナリ・モハンティです。

今日は、実験的転移アッセイを行う手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用してがんの転移を研究しています。それでは始めましょう。

プレートから約70%Coの流暢な吸引培地に増殖した細胞から始めて、1つのXPBSで1回穏やかに洗浄します。次に、0.05%トリプシンインバースを2ミリリットル追加します。プレートを静かに揺らして、細胞の剥離を促進します。

細胞が剥離する様子を顕微鏡で観察します。FBSを含む十分な量のメディアを追加して、アクティビティの旅行をクエンチします。次に、50ミリリットルのチューブに移します。

ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントします。濃度が決定したら、細胞ペレットを乱さずに重力の約200倍で3分間遠心分離します。Resusを慎重に取り出し、適切な量のハンクのバランス緩衝液またはHBSSを懸濁して、1ミリリットルあたり6個の細胞に10の5倍の最終濃度に達します。

次に、Falconの70マイクロメートルセルストレーナーでろ過します。大きな細胞凝集体を除外するには、ピペットの先端をフィルターに直接置き、5ミリリットルの培養チューブの上に置きます。懸濁液をフィルターを通してチューブにすばやく排出します。

生存率を判断するために、トライアンブルーを使用して細胞を再度カウントします。生存率は、注射前に90%以上である必要があります。次に、1ミリリットルあたり6個の細胞の10の2.5倍の最終濃度に希釈します。

氷の上を保ってください。免疫不全マウスの尻尾をそっとつかみ、背中をスリットに当て、尻尾を背中の小さな開口部から突き出してマウスの拘束具に引き込みます。リングをスリットに沿ってゆっくりと内側にスライドさせます。

リングがマウスの口に引っかかったら、所定の位置にロックします。マウスは自由に動くことができないはずですが、通常の呼吸速度を持つべきです。主要な尾静脈を見つけます。

マウスの尾には4つの主要な血管が存在します。動脈は尾の背側と腹側にあります。静脈は側面にあります。

調製した細胞の少なくとも200マイクロリットルを1ミリリットルの注射器に引き込みます。30ゲージのハーフニードルを取り付けて、気泡を押し出します。シリンジの最終容量は200マイクロリットルである必要があります。

尾の遠位端に注入する準備をします。したがって、最初の試行が失敗した場合は、尾のより近位の領域を2回目の試行に使用できます。注入部位を70%エタノールで拭いた後、テールをまっすぐ引っ張ります。

親指で先端を持ち、人差し指で注入するポイントを支えます。針を静脈に挿入し、細胞を注入します。注射中は、針とシリンジが静脈と平行であることを確認してください。

そうしないと、針が血管壁を突き破り、細胞が隣接する尾組織に注入されます。手順が成功した場合は、針を抜いてください。血液は注射部位から灌流する必要があります。

きれいなコットンボールを押してデンタルフロスを容易にし、テールを上に触診して残留サンプルを循環させます。マウスを拘束具から離し、ケージに戻します。注射の試行回数と注入した細胞の数を実験ノートに記録します。

注入後の細胞の生存率を判断します。前回と同様に、このステップにより、注入プロセス全体を通じて細胞が生き続けるという安心感が得られます。注射実験の終了時には、細胞の生存率は低下しますが、80%以上にとどまる必要がありますオプションのステップとして、残りの細胞をスピンダウンし、ペレットをPBSで一度すすぎます。

その後、ペレットをマイナス80°Cで凍結し、ウェスタンブロッティングなどの将来の分析に使用します。ノックダウンで遺伝子発現を確認するため 1〜2か月後、マウスを解剖して転移の位置を特定します。安楽死させたマウスを解剖ステーションに置くことから始めます。

マウスにエタノールをたっぷりとスプレーします。胸郭を切り開いて、肺と心臓を露出させます。次に、それらを慎重に切除し、PBSに入れます。

肺は、細胞が最初に遭遇する毛細血管床を含んでいるため、転移の主要な部位です。それらが循環に入った後、心臓を取り出し、PBSで肺をすすぎ、解剖顕微鏡で肺の各葉を観察します。肺の両側で検出可能な転移の数を数え、次に4つの葉すべての肺転移の数を数えて、肺転移の総数を決定します。

次に、ハサミを使用して切除することにより、個々の肺転移を分離します。各転移を70μmの細胞ストレーナーに移し、滅菌ニードルキャップの端を使用してミンチにします。セルストレーナーを数ミリリットルの培地ですすぎ、フィルターを通過する細胞を収集します。

培養皿では、各皿に1つの転移からの細胞が含まれています。細胞を摂氏37度で少なくとも4日間、邪魔されずにインキュベートします。最初は、がん細胞と線維芽細胞の両方がプレート上で成長しますが、徐々に線維芽細胞は死滅し、がん細胞に置き換わります。

がん細胞が薬剤耐性遺伝子を持っている場合は、対応する抗生物質を持つ細胞を選択します 3日後、血液や組織の破片、PBSで皿の破片を洗い流し、新鮮な培地を追加します。ここでは、ヒト特異的タンパク質に対する抗体による免疫染色により、誘導細胞の純度を評価し、薬剤選択がない場合でも抗ヒトメンティング抗体を使用します。細胞の99%以上がヒトであるべきです。

新たに得られた細胞を免疫不全マウスに再度注入して、このアッセイの最後に転移能力を試験することができます。転移性の高いがん細胞株は、通常、多くの肺転移を引き起こしますが、転移性の低いがん細胞株からの肺転移はほとんどありません。これらの画像は、ヒト黒色腫細胞株の注射から2か月後の肺転移を示しています。

A 3 7 5 smです。この方法を使用して得られた細胞は、通常、テスト時に親系統よりも多くの転移を引き起こします。再びこのアッセイを使用して、実験的転移アッセイを実行する手順を示しました。

この手順を行うときは、細胞が尾静脈に注入され、ITSと尾組織には注入されないことを確認することを覚えておくことが非常に重要です。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。