Name: 実験的転移アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-24T17:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学ぶ実験的転移アッセイで、免疫不全マウスの尾静脈注射を用いてヒトがん細胞の転移能を評価する方法です。肺転移の定量化と培養により、がん治療戦略の開発に有用な知見を得られます。

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このプロトコルは、検査の結果、博士リチャードハインズ（MIT）の研究室で最初に最適化されていました。資金調達はNYSTEMアイデア賞（LXへ）とルースL.キルシュシュタイン国立リサーチサービス賞（LXへの）によって提供されます。

1。サンプル準備<ol><li>成長因子やFBS（例えば、MC - 1細胞​​を10％FBS含有DMEM）で、その特定のメディアで〜70％コンフルエントに細胞を成長させる。プレートから培地を吸引除去し、穏やかに1 × PBS（塩化ナトリウム8gの/ L、塩化カリウム0.2 g / Lの、1.15のNa 2 HPOのG / L 4 · 7H 2 O、KH 2 POを0.2g / Lで数回洗浄4、pHは7.3）。 </li><li>吸引PBSとヴェルセンの0.05％トリプシン（フェノールレッドおよび1 × PBS、pH7.2中EDTA - Naは0.2 g / Lの0.014グラム/ L）2 mLを加える。静かにプレートから細胞の剥離を容易にするためにプレートを揺らし。顕微鏡下で細胞を観察。それは、通常、切断するセル2-5分かかります。 </li><li>トリプシン活性をクエンチし、50mLのファルコンチューブに細胞を収集するメディアを含むFBS（または大豆トリプシン阻害剤）の十分なボリュームを追加します。血球計を用いて細胞を数える。きれいな血球計算盤の上に細胞懸濁液の10μLをロード。 mL当たりの細胞数は、10 4を掛けた5つの正方形のそれぞれの＃セルの平均値に等しくなります。 </li><li> 3分間ベンチトップ遠心機で1000 RPM（または〜200 × g）で細胞を遠心分離します。 </li><li>慎重に細胞ペレットを乱すことなくメディアを削除します。 〜5 × 10 6細胞/ mlの最終濃度に到達するためのハンクス平衡緩衝液（HBSS）の適切な量で細胞を再懸濁します。 </li><li>ファルコン70μmのセルストレーナーを介してフィルタ細胞は大きな細胞凝集体を除外する。ラベル付け5mLのファルコンの培養チューブオーバーフィルター上に直接ピペットの先端を置きます。迅速に培養チューブにフィルターを介してサスペンションを取り出します。 </li><li>血球計を使用して、再度セルをカウントし、2.5 × 10 6 / mlの最終濃度に希釈する。氷上で細胞を維持する。 </li><li>細胞の生存率を決定する。トリパンブルーで一部の細胞を混合し、血球計算盤を用いて全細胞を介してデッド（青）細胞の割合を測定する。細胞の生存率は、注入前≥90％以上にする必要があります。 </li></ol> 2。静脈注射<ol><li>手袋を変更します。ゆっくりと免疫不全マウス（ヌード、NOD - SCID、またはNSG、ジャクソンの研究所）の尾をつかんで制止する人の後ろに小さな開口部から突き出てスリットとその尾に対して、その後ろで、マウスの制止する人にそれを引く。 </li><li>リングは、マウスの口をキャッチした後、ゆっくりスリットに沿って内側のリングをスライドさせて所定の位置にロックします。マウスは、自由に動くことができないようにする必要がありますが、呼吸の正常な速度を持つ必要があります。 </li><li>主要な尾静脈を見つける。四主要な血管は、マウスの尾部に存在しています。尾の背側と腹側の側面上の血管は動脈です。静脈は尾の側面にあります。 </li><li> 1mLの注射器に準備した細胞の200以上μLを描く。 30 G1 / 2インチの針を取り付け、存在する可能性のある気泡を押し出す。シリンジ内の細胞の最終的な容積は200μL（すなわち、合計で5 × 10 5細胞）でなければなりません。 </li><li>尾静脈に細胞を注入する。 <ol class="lalpha"><li>尾の先端から開始、第一審は失敗した場合、尾部のより近位の領域は、第2のtryを使用することができる。 </li><li> 70％エタノールで尾を拭きます。まっすぐ尾を引いて。親指と尾の先端を押さえ、人差し指で注入するためのポイントをサポートしています。 </li><li>静脈に針を挿入し、細胞を注入する。針と注射器は注射時の静脈に平行な、そうでなければ針が血管壁を通って突くと、隣接する尾の組織に細胞を注入することを確認してください。 </li><li>注射後に針を撤回。注入が正常に行った場合、血液が注射部位から多量のはずです。凝固促進し、循環に静脈内の任意の残留サンプルをプッシュするように尾を上を触診する注射部位での紙タオルや綿棒のきれいな部分を押してください。 </li><li>制止する人からマウスを解放し、ケージに戻す。実験ノートに（例えば、どのように多くの試験では、細胞を注入するために取り、どの程度の細胞を注入した）注入プロセスを記録します。 </li><li>として試料調製のセクションで説明されている注射後の細胞の生存率、、ステップ9を決定します。このステップでは、細胞が注入プロセスを通して生き続けるという安心感を提供します。注入実験の終了時に、細胞の生存率は低下するが、80％以上でなければなりません。 </li><li> （省略可能）残りの細胞をスピンダウンし、PBSで1回ペレットを洗う。今後の分析（例えば、遺伝子発現やノックダウンを確認するためにウエスタンブロット）を-80℃でペレットを凍結する。 </li></ol></li><li>通常、1つまたは2カ月後、マウスを解剖され、転移の場所がひどく決定されます。それは細胞が彼らの後に遭遇する最初の毛細血管床を含んでいるので、肺は、転移のプライマリサイトです。循環を入力してください。 </li><li> PBSで洗浄後、肺（または転移を含む他の組織）の各葉は、解剖顕微鏡（図1）で観察される。肺の両側に検出可能な転移の数がカウントされ、すべての4つの葉で肺転移の番号は、肺転移の合計数として加算されます。肺はホルマリン一晩で修正される場合は、1肺転移がより容易に検出されています、転移は隣接する暗褐色の肺組織とは対照的に白っぽい斑点としてapppearなりますので。 </li></ol> 3。肺転移からの細胞培養<ol><li>肺転移は、注入されたマウスから分離されています。それぞれが別々に培養する必要があります。 </li><li>それぞれの転移は、70μmのセルストレーナーで針のキャップ（無菌）の終わりまでに刻まれている。 </li><li>培地と培養皿でフィルタを通過回収した細胞のいくつかのMLSとセルストレーナーを洗浄します。 </li><li>煩わされることなく、少なくとも4日間、37℃で細胞をインキュベートする。 </li><li> PBSでシャーレに血液や組織の破片を洗い流す。 </li><li>新鮮な培地を追加。初めに、癌細胞と線維芽細胞の両方は、プレート上に成長するが、徐々に、線維芽細胞が死に絶えるだろうと癌細胞に置き換えられます。がん細胞は、任意の薬剤耐性遺伝子を運ぶ場合は、対応する抗生物質で細胞を選択する。 </li><li>由来細胞の純度は、ヒト特異的蛋白質に対する抗体を用いた免疫染色によって評価される。我々は、抗ヒトビメンチン抗体（NCL - VIM - V9、Novocastra）を使用します。我々が由来する細胞は、さらに薬剤の選択がない場合には、ヒト細胞の99％以上、典型的に含まれています。新たに由来する細胞は、上述したように、それらの転移能力をテストするための免疫不全マウスに再注入することができます。 </li></ol> 4。代表的な結果<ol><li>非常に少数の肺転移が不完全に転移性癌細胞株から来る間、このアッセイの終わりには、高転移性癌細胞株は、通常、多くの肺転移（図1）を生じさせる1。 </li><li>このメソッドを使用して派生した細胞は通常、彼らは再びこのアッセイを使用してテストしている親の行、より多くの転移を生じさせる。1-3 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1942/1942fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> がん細胞の尾静脈注射後のマウスの肺の図1。代表画像。転移性ヒトメラノーマ細胞株、SM細胞、4の5 × 10 5は、免疫不全マウスの尾静脈に注射した。 2ヵ月後、肺を単離し、そして転移は通常の肺組織に分散発見された。

<ol><li>Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+in+an+animal+melanoma+model+correlate+with+aggressiveness+of+human+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases.</a> Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).</li>
<li>Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+metastasis+reveals+an+essential+role+for+RhoC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC.</a> Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).</li>
<li>Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR56%2C+an+atypical+G+protein-coupled+receptor%2C+binds+tissue+transglutaminase%2C+TG2%2C+and+inhibits+melanoma+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).</li>
<li>Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+melanoma+line+heterogeneous+with+respect+to+metastatic+capacity+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice.</a> J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).</li>
<li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).</li>
</ol>

転移は、がん患者における死亡の主要な原因である。彼らの主要な遺伝子座、循環への参入（管内）、循環（血管外漏出）から、これらの終了、および遠隔臓器の生存と成長から癌細胞の剥離：これは、4つの主要な手順が含まれます。人間の転移はゆっくりとしたプロセスとみなされ、多くの場合、待ち時間の年後に明示​​される。タイムリーにその進行を勉強するために、上記の比較的迅速な実験的なアッセイは、免疫不全マウスに設立されました。4設立以来、それは別の転移能力を持つ細胞を分離するために効果的に使用されている、アップまたはダウンレギュレート中にある遺伝子を同定転移1,2,5、および転移の間にこれらの遺伝子の因果役割をテストする3。 このアッセイで最も挑戦的なステップは、尾静脈に細胞を注入することです。それは注入するスキルを習得する実践を取ります。ベテランの研究者のために、成功した注入を達成する前にいくつかの試験は非常に一般的です。マウスの尾の静脈は右それらの中間の非常に薄いと、挿入針です簡単ではありません。簡単にランプを使用して尾をウォームア...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10313-021</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>6838-04</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7896-04</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7100-12</td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na</td><td>EMD Millipore</td><td>4010</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン 2.5%</td><td>Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Ultrapure</td><td>200-CSGP</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falconチューブ</td><td>VWR international</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70&amp;mu;m セルストレイナー</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>5ml Falcon培養チューブ</td><td>VWR international</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>血球計数器</td><td>Hausser Scientific</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>329650</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;frac12; ゲージ針</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>マウス固定具</td><td>Plas Labs Inc.</td><td>551-BSRR</td><td></td></tr><tr><td>外科用はさみ</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-902</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心機</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>75003491</td><td></td></tr></tbody></table>

実験的転移アッセイ

Experimental Metastasis Assay

転移は、がん患者における死亡の主要な原因である。転移のメカニズムを理解するために、実験的転移アッセイは、免疫​​不全マウスを用いて設立されました。この記事では、サンプル調製、静脈内注射、および肺転移から培養細胞を含むこの検定に関わる手順を、群を区別。簡単に言えば、ヒト癌細胞の予め決められた数を調製した<em&gt; in vitroで</em&gt;とは直接彼らの尾静脈を介して免疫不全マウスの循環に注入。細胞の数が少ない循環の乱後も存続し、肺などの臓器、の転移として成長する。注入されたマウスは、一定期間後に解剖されています。転移の組織分布は、解剖顕微鏡下で決定されます。特定の組織への転移の数がカウントされ、それが直接注入された癌細胞の転移能と相関する。生じた転移を単離し、培養する<em&gt; in vitroで</em&gt;のような免疫不全マウスに再び注入すると、しばしば親系統よりも強化された転移性の能力を示す細胞株、。これらの転移性の高いデリバティブ取引は、転移性の進行を調節する遺伝子や分子経路を同定するために有用なツールとなる。

この記事では、ヒト癌細胞株の転移能を決定するために使用される実験的転移アッセイの手順を説明します。

転移はがん患者における主要な死因です。転移のメカニズムを解明するため、実験的転移アッセイが確立されました...

本実験の全体的な目的は、尾静脈注入によりヒトがん細胞の転移能を検証することです。まず、免疫不全マウスへの注入に向けて細胞を調製します。その後、細胞を免疫不全マウスに注入し、1〜2ヶ月後に肺転移を誘導させます。マウスを解剖し、肺転移の定量および培養を行います。この種のアッセイの結果は、特定の種類のがん細胞の転移の程度を示します。こんにちは、ロチェスター大学生物医学遺伝学科のDr.LEの研究室のSonali Mohantyです。本日は、実験的転移アッセイを行う手順について解説します。当研究室では、がんの転移を研究するためにこの手法を用いています。それでは始めていきましょう。細胞のコンフルエンシーが約70%に達した状態で開始します。プレートから培地を吸引し、1xPBSで穏やかに1回洗浄します。次に、0.05% Trypsinを2 mL加え、反転させます。プレートを穏やかに揺らし、細胞の剥離を促進させます。顕微鏡下で細胞が剥離する様子を観察します。トリプシンの活性を停止させるために、FBSを含む培地を十分な量加えます。その後、50 milliliterチューブに移します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントします。濃度が決定したら、細胞ペレットを乱さないように注意しながら、約200 ×gで3分間遠心分離します。培地を慎重に取り除き、最終濃度が約5 × 10⁶ cells/mLになるよう、適切な量のハンクス平衡塩溶液（HBSS）を加えて再懸濁します。次に、Falcon社の70 µmセルストレーナーでろ過します。大きな細胞凝集塊を除去するため、5 mL培養チューブの上に置いたフィルターにピペットのチップを直接当てます。懸濁液をフィルターを通してチューブ内へ迅速に排出してください。トリパンブルーを用いて再度細胞数をカウントし、生存率を判定します。注入前の生存率は90%以上である必要があります。その後、最終濃度が2.5 × 10⁶ cells/mLになるように希釈します。氷上で保持します。免疫不全マウスの尾をそっと掴み、背中がスリットに接するようにしてマウス拘束器に入れ、尾が背面にある小さな開口部から出るようにします。リングをスリットに沿ってゆっくりと内側にスライドさせます。リングがマウスの口に固定されたら、そのままロックします。マウスが自由に動けないようにしますが、呼吸速度は正常である必要があります。次に、尾静脈の主要な部位を確認します。マウスの尾には4本の主要な血管が存在します。動脈は尾の背面および腹側に位置しています。静脈は外側に位置しています。準備した細胞を1 mLシリンジに200 µL以上吸い取ります。30Gのハーフニードルを取り付け、気泡を押し出します。シリンジ内の最終容量を200 µLにします。尾の遠位端に注射する準備をします。これにより、1回目の試行に失敗した場合、2回目の試行に尾のより近位の領域を使用することができます。注射部位を70%ethanolで拭いた後、尾を真っ直ぐに引っ張ります。親指でチップを持ち、人差し指で注入部位を支えます。針を静脈に刺入し、細胞を注入します。注入中は、針とシリンジが静脈と平行であることを確認してください。そうしないと、針が血管壁を突き抜け、細胞が隣接する尾組織に注入されてしまいます。手技が成功した場合は、針を抜いてください。注入部位から血液が浸出しているはずです。清潔な脱脂綿で軽く押さえてフロス操作を容易にし、尾を上方に向かって触診して、残ったサンプルを循環系に押し出します。マウスを拘束具から放し、ケージに戻します。注射の試行回数と注入した細胞数をラボノートに記録します。注入後の細胞生存率を測定します。前述の通り、このステップは注入プロセス全体を通じて細胞が生きていられることを確認するためのものです。注入実験の終了時に細胞生存率は低下しますが、80%以上を維持している必要があります。オプションのステップとして、残った細胞を遠心分離し、ペレットをPBSで1回洗浄してください。その後、ウェスタンブロッティングなどの今後の解析のために、ペレットを-80 °Cで凍結保存します。ノックダウンによる遺伝子発現を確認するため、1〜2か月後にマウスを解剖し、転移部位を特定します。まず、安楽死させたマウスを解剖台に置くことから始めてください。マウスにエタノールを十分にスプレーします。胸郭を切開して肺と心臓を露出させます。その後、それらを慎重に摘出し、PBSに入れます。肺は、細胞が最初に到達する毛細血管床を有しているため、転移の主要な部位となります。細胞が血流に入った後、心臓を取り除き、肺をPBSで洗浄して、解剖顕微鏡下で肺の各葉を観察します。肺の両側で検出可能な転移数を数え、その後、4つの肺葉すべての転移数を合計して、肺転移の総数を決定します。次に、ハサミを用いて個々の肺転移巣を切り出し、分離します。それぞれの転移巣を70 µmのセルストレーナーに移し、滅菌したニードルキャップの先端を用いて細かく砕きます。セルストレーナーを数 mLの培地で洗浄し、フィルターを通過した細胞を回収します。培養皿を用い、各皿に1つの転移巣からの細胞を分注します。細胞を37 °Cで少なくとも4日間、刺激を与えずにインキュベートします。当初はがん細胞と線維芽細胞の両方がプレート上で増殖しますが、徐々に線維芽細胞が死滅し、がん細胞に置き換わります。がん細胞が薬剤耐性遺伝子を保持している場合は、対応する抗生物質を用いて細胞を選択します。3日後、PBSで皿上の血液や組織の残渣を洗浄し、新鮮な培地を加えます。誘導された細胞の純度は、ヒト特異的タンパク質に対する抗体を用いた免疫染色によって評価します。ここでは、薬剤選択を行わない場合でも、抗ヒト抗体を使用します。細胞の99%以上がヒト由来である必要があります。新たに誘導された細胞を免疫不全マウスに再び注入し、本アッセイの最後に転移能を試験することができます。一般的に、転移能の高いがん細胞株は多くの肺転移を引き起こしますが、転移能の低いがん細胞株からの肺転移はごくわずかです。これらの画像は、ヒトメラノーマ細胞株を注入してから2ヶ月後の肺転移を示しています。3 7 5 sm。この方法を用いて誘導された細胞は、通常、親株と比較して試験時に多くの転移を引き起こします。以上の通り、このアッセイを用いて、実験的転移アッセイを実施する手順について説明しました。この手順を行う際は、細胞を尾静脈に注入し、周囲の組織や尾の組織に注入しないようにすることが非常に重要です。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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