細胞の電気融合を蛍光顕微鏡で可視化
July 1st, 2010
このビデオでは、細胞の効率的な電気融合を示しています in vitroでエレクトロポレーションおよび蛍光顕微鏡による融合細胞の可視化のその後の検出を使用して変更密着法による。
エレクトロフュージョンでは、短い高電圧電気パルスを近接した状態で細胞に印加します。このビデオでは、修正Adherence.Methodによるin vitroでの細胞の電気融合を実演します。実験は、マウス黒色腫細胞、BF1で行われました。
実験を行うには、次の手順に従います。2つの別々の培養フラスコで細胞を80%コンフルエンスまで増殖させます。これとは別に、各ストック溶液を2.1マイクロリットル追加します。
遠心分離管内のクレブスヘスバッファーにそれぞれ10ミリモルのC-M-F-D-AまたはCMRAを3ミリリットル。Krebs Hessバッファーで細胞を2回すすぎ、ローディング溶液をフラスコに挿入します。ローディング溶液には、それぞれ約7マイクロモルのC-M-F-D-AまたはCMRAが含まれています。
制御された雰囲気で細胞を30分間インキュベートします。この最初のインキュベーション中に、領域は細胞膜を自由に通過してサイトゾルに入り、そこで膜IMP透過反応生成物に変換されます。この最初のインキュベーションの後、細胞をすすぎ、次に培養液でさらに2時間インキュベートします。
細胞は、取得ソフトウェアで冷却されたCCDカメラを備えた蛍光顕微鏡を使用して観察されます。励起波長を548ナノメートルに設定し、C-M-F-D-Aをロードした細胞に対してCMRAをロードした細胞の適切なバンドパスフィルター脅威蛍光画像を選択します。励起波長を492ナノメートルに設定し、緑色蛍光画像トリプシンアイ用のバンドパスフィルターを選択し、両方のフラスコ内の細胞をカウントし、赤と緑の細胞を1対1の比率で混合し、細胞濃度を1ミリリットルあたり500万個の細胞に調整します。
各ウェルの中央に20マイクロリットルの細胞懸濁液を滴下します。24マルチウェルプレートで、制御された雰囲気で細胞を20分間インキュベートし、細胞が単層でウェルの表面にわずかに付着し、細胞間の細胞接触を確立する。細胞を載せたマルチウェルを顕微鏡ステージに置きます。
電極をウェルの底に配置し、パルス発生器に接続します 最適な電気融合を達成し、細胞の生存率を維持するためには、電気パルスの適切なパラメータを使用する必要があります。これらのパラメータは細胞株によって異なり、予備実験で決定する必要があります。培養培地を取り出し、細胞の腫脹を誘発するために、350マイクロリットルのハイポスミラーリン酸カリウム緩衝液で1ミリリットルのISO omuリン酸カリウム緩衝液で細胞を洗浄します。
細胞を高浸透緩衝液に2分間放置してから、電気パルスを印加します。電気パルスは、細胞が最大体積に近づいたときに印加する必要があります。それは彼らが規制量を開始する前です。
私たちの実験で減少します。1ヘルツで100マイクロ秒の持続時間を持つ8つの矩形パルスの列が適用されました。パルスデリバリー後。
10分後、10分間細胞を邪魔しないで放置します。フェイスコントラストと蛍光顕微鏡による拡散収率の決定。Eは、ランダムに選択された5つの視野で、顔のコントラスト、赤と緑の蛍光の3つの画像を取得します。
それぞれで、よく画像Jソフトウェアで各画像トリプレットから3つのチャンネル画像を作成し、画像の視覚品質を向上させるために、画像の視覚品質を向上させるためのステップは、元の画像に適用することができます、背景、減算、およびデフォルトのパラメータセットでコントラストの強化。最後に、3つのチャンネル画像は、RGBからグレーの画像Jプラグインを使用して構成されます。このような画像では、休息している細胞質が細胞膜と一緒に見ることができます。
したがって、3チャンネルの画像カウントで、赤、緑、および二重蛍光性の3種類の細胞すべてを容易に決定できる細胞はほとんどありません。二重蛍光細胞の割合を決定するには、二重蛍光細胞の数を各画像内のすべての細胞の数で割ることによります。融合収率は、二重蛍光細胞の割合に2を掛けた値として定義されます。
同じ色のセルを表示すると、ビューセルの半分が検出されないためです。
概要
このビデオは、修正された接着法と電気穿孔を組み合わせた方法を用いて、in vitro で細胞の効率的な電気融合を実証しています。このプロセスには、蛍光顕微鏡を用いた融合細胞の検出が含まれています。
主要な研究構成要素
科学の領域
- 細胞融合技術
- 電気穿孔法
- 蛍光顕微鏡応用
背景
- 電気融合は、細胞融合を促進するために電気パルスを適用する技術です。
- この方法は、ハイブリッド細胞の生成効率を高めることができます。
- 蛍光顕微鏡は融合細胞の視覚化を可能にします。
- 細胞融合の理解は様々な生物学的応用に不可欠です。
研究の目的
- 細胞の電気融合の信頼性の高い方法を実証すること。
- 細胞融合の効率を視覚化し定量化すること。
- 他の研究室で再現可能なプロトコルを提供すること。
使用した方法
- マウスメラノーマ細胞を培養し、融合の準備を行いました。
- 融合前に細胞を標識するために蛍光染料を使用しました。
- 細胞融合を誘導するために電気パルスを適用しました。
- 融合結果を分析するために蛍光顕微鏡を使用しました。
主要な結果
- 蛍光によって示されたように、細胞の成功的な融合が達成されました。
- 融合収率を決定するために、二重蛍光細胞の割合を計算しました。
- 細胞生存率を維持しながら、細胞融合に最適な電気パルスパラメータを特定しました。
- 画像処理技術を通じて、画像の視覚的品質を向上させました。
結論
- 修正された接着法は、細胞の電気融合に効果的です。
- 蛍光顕微鏡は融合効率を評価するための貴重なツールです。
- このプロトコルは研究において様々な細胞タイプに適応できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Cell electrofusion visualized by fluorescence microscopy provides a non-viral, non-chemical platform for generating hybrid cells, supporting early-stage biopharma research. Quantitative visualization of fusion events enables robust assessment of cell manipulation techniques, directly impacting target validation and assay development. This approach strengthens predictive confidence in cell-based workflows and informs risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell fusion mechanisms relevant to therapeutic hypothesis testing.
- Supports functional validation of cell manipulation strategies for hybrid cell generation.
- Facilitates biological de-risking by quantifying fusion efficiency and specificity.
- Provides measurable outputs for portfolio triage and target confidence.
Screening & Assay Development
- Establishes validated cell systems for downstream screening of fusion-dependent phenotypes.
- Delivers standardized, reproducible quantification of fusion yield via dual fluorescence.
- Enables assay scalability and platform reuse for compound evaluation targeting cell fusion processes.
- Supports reliable benchmarking of fusion protocols across cell types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational workflows by enabling generation of hybrid cells for preclinical modeling.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of cell-based therapies.
- Reduces mechanistic ambiguity in cell manipulation strategies for therapeutic development.
- Supports risk-adjusted advancement of cell fusion-based therapeutic concepts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust cell fusion quantification and visualization, supporting both early validation and translational research.
- Discovery Biology: Quantitative fusion yield measurement supports hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Dual fluorescence readouts enable reproducible assay development and benchmarking.
- Analytics: Image-based quantification provides objective, comparable outputs for condition assessment.
- Translational Research: Hybrid cell generation supports preclinical modeling and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable across cell types and research programs, enhancing platform value.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell fusion workflows.
- Operational Value: Standardizes fusion quantification and supports reproducibility across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescence microscopy, and image analysis.
- Needs access to pulse generators, fluorescence microscopes, and image processing software.
- Demands cross-team standardization of labeling, imaging, and quantification protocols.
- Adaptation across cell lines may require optimization of pulse parameters and labeling conditions.
- Fusion efficiency and viability are cell line-dependent and must be empirically determined.
