Name: 細胞の電気融合を蛍光顕微鏡で可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: 学ぶ細胞電気融合の効率的な手法を、マウスメラノーマ細胞を用いた蛍光顕微鏡による可視化と定量化で。細胞融合効率の評価に有用なプロトコルです。

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この作品は、スロベニアの研究機関（プロジェクトJ2 - 9764とプログラムP2 - 0249）によってサポートされていました。このビデオでは、&quot;エレクトロポレーションベースの技術と治療&quot;リュブリャナ、スロベニアの大学で電気工学の学部が主催する科学的なワークショップや大学院のコースのための補助教材を表します。

I.はセルトラッカーCMFDAとCMRAで細胞をロードする<ol><li>実験は、マウスのメラノーマ細胞株（B16 - F1）の事前に準備された細胞について実施した。細胞は、投与16、0.15 mg / mlのL -グルタミン、10％ウシ胎児血清を含むDMEM培地（ダルベッコ改変イーグル培地）で70〜80％コンフルエントになる2つの分離25cm 2の培養フラスコ（TPP、ZDA）で栽培されています/ mlのゲンタマイシン（Sigma - Aldrich社、ドイツからのすべて）、200単位/ ml crystacillin（Pliva、クロアチア）、および37℃、5％CO 2でインキュベート℃の</li><li>オリジナルの染料の50μgのために（Sigma - Aldrich社、ドイツ）のDMSO（グリーンCMFDA用とオレンジCMRAため、それぞれ）10.76μlを、9μlを添加して細胞のトラッカー（インビトロジェン社、米国）の2つの10 mMのストック溶液を準備するインビトロジェンのバイアル。ストック溶液は、℃で数ヶ月間で4冷蔵庫で保存することができます。 DMSOの結晶が溶解するまで実験を開始する前に、ソリューションのウォームアップを行います。 </li><li>重炭酸フリークレブス- Hepes緩衝液（130 mMのNaCl、4.7 mMの塩化カリウム、1.2 mMのMgSO 4を 、1.2 mMのKH 2 PO 4、29.6 mMのD -グルコース、1.3 mMのCaCl 2を 、10mMのHEPES、pH7.4）を準備する。 2つの15エッペンドルフチュー​​ブに別々に重炭酸フリークレブス- Hepes緩衝液3mlに各ストック溶液2.1μL（それぞれ10 mMのCMFDAまたはCMRAを、）ミックス。これは約7μMCMFDAを（またはCMRA）を含む"ローディングソリューション"を得られます。 </li><li>重炭酸フリークレブス- HEPES緩衝液で細胞を2回リンスし、フラスコにソリューションを読み込んで挿入。 37℃5％CO 2で30分間細胞をインキュベート℃にこの最初のインキュベーションの試薬は、細胞膜を自由に通過する時には、いったん細胞の中に、試薬は、細胞非透過性の蛍光反応生成物に変換されます。 </li><li> 37で最初のインキュベーションの後、リンス、5％CO 2でさらに2時間培養培地で細胞をインキュベート℃に</li><li>両方のフラスコに細胞をトリプシン処理（CMFDAとCMRA搭載）および50 ml遠心チューブに比1:1（TPP、ZDA）で一緒に赤と緑のセルを混在させること。 DMEM培地で希釈することによりまたは遠心分離による濃縮により、5 × 10 6細胞/ mlに細胞濃度を調整します。 24マルチウェルプレート（TPP、ZDA）の各ウェルに細胞懸濁液の20μlのドロップを置きます。 ℃で20分間、ややもの表面に付着し、細胞の接触を確立できるように37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートする。 </li></ol> II。電気融合<ol><li> isoosomolarリン酸カリウム緩衝液（10mMのKH 2 PO 4、10mMのK 2 HPO 4、1mMのMgCl 2を 、250mMスクロース）とhypoosmolarリン酸カリウムバッファー（10 mM KH 2 PO 4、10mMのK 2 HPO 4、1mMのMgCl 2を 、75 mMスクロース）の準備。 </li><li> 、顕微鏡ステージ上に細胞をマルチウェルを配置ウェルの下部に位置電極を、パルス発生器に接続します。 </li><li> isoosomolarリン酸カリウム緩衝液1mlで細胞を洗浄。細胞の腫脹を誘発するためにhypoosmolarリン酸カリウム緩衝液350μlを添加します。バッファは、電極をカバーする必要があります。 </li><li>電気パルスを適用する前に2分間hypoosmolarバッファーで細胞を残す。この時間の間にインテリアや細胞の外側との間の浸透圧の不均衡に起因する細胞内への水分の流入は、細胞容積の増加を引き起こす。細胞は彼らの最大のボリュームに近づく際には、電気パルスが調節容量の減少を開始する前に、適用する必要があります。 </li><li>最適な電気融合を実現し、細胞の生存を維持するために、電気パルスの最適なパラメータを使用する必要があります。これらは、[1]を使用する細胞株に依存する。この実験では、8の矩形パルス（1 Hzで100μsの間の持続時間と各）の列車は、エレクトロポレーションのデバイスを（このケースCliniporator、ジェーア、イタリア）を使用して、各サンプルに適用されます。パルスは、よく制御を除いて、各ウェルに電極間に約1200 V / cmの電場を作る、0.8mmの直径とそれらの間に5 mmの距離で二つの平行な白金/イリジウムワイヤー電極に配信されます。 </li><li>パルスの配達後10分間静細胞を残す。蛍光および位相差顕微鏡による核融合の利回りを決定します。 </li></ol> III。画像取り込みと融合の収量の決定<ol><li>細胞は、目的（x20）をと冷却CCDカメラ（VisiCam 1280、Visitron、ドイツ）を装備した蛍光顕微鏡を（我々の場合ツァイスAxioVert 200、ツァイス、ドイツ）を用いて観察される。画像は、MetaMorph 7.1.1（Molecular Devices社、米国）に買収されていますが、他の同じような買収のソフトウェアを使用することもできます。 CMFDAは548 nmで492 nmの単色光分光器（ポリクロームIV、Visitron、ドイツ）とCMRAで興奮している。 CMFDAとCMRAの蛍光は（D605/55m、Cの2つの発光535 nmの中心フィルター、つ（HQ535/30m、CMFDA用）と510nmで他の中心を使用して取得されるMRA、クロマ、米国）の両方。ダイクロイックミラー（Q515LP）を使用すると、チャンネルのクロストークを防止。 </li><li>各ウェルに5つのランダムに選択されたフィールドには3つのイメージを（位相コントラスト、赤色および緑色蛍光）を取得。各画像の三つ組から3チャンネルの画像を作成します。そのようなイメージでは蛍光を発する細胞質は細胞膜と一緒に見ることができます。融合細胞は、このように容易に決定することができます[図1]。 </li><li>各3チャンネルの画像で細胞（赤、緑、二重に蛍光）の3種類すべてをカウントします。各画像のすべてのセルの数を二重に蛍光細胞の数を割ることによって二重に蛍光細胞の割合を決定する。核融合の利回りは、融合細胞の半分から2を乗じて二重に蛍光細胞が（同じ色のヒューズの際の細胞）が検出されていないのパーセンテージとして定義されています。 </li></ol>代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1991/1991fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1電気融合後のB16F1細胞の3チャネルの顕微鏡像：。位相コントラスト、CMRA蛍光（548 nmで励起）とCMFDA蛍光（492 nmで励起）、客観的な倍率20倍

<ol><li>Čemazar, M., Jarm, T., Miklavčič, D., Maček-Lebar, A., Ihan, A., Kopitar, N. A., Serša, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+electric-field+intensity+on+electropermeabilization+and+electrosensitivity+of+various+tumor-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Electro.+Magnetobiol%22%5BJournal%5D)">Effect of electric-field intensity on electropermeabilization and electrosensitivity of various tumor-cell lines in vitro.</a> Electro. Magnetobiol. 17, 263-272 (1998).</li>
<li>Trontelj, K., Reberšek, M., Kandušer, M., čurin šerbec, V., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+bulk+cell+electrofusion+in+vitro+for+production+of+human-mouse+heterohybridoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse heterohybridoma cells.</a> Bioelectrochemistry. 74, 124-129 (2008).</li>
<li>Rols, M. -P., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+electrically+induced+permeabilization+and+fusion+of+Chinese+hamster+ovary+cells+by+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of electrically induced permeabilization and fusion of Chinese hamster ovary cells by osmotic pressure.</a> Biochemistry. 29, 4561-4567 (1990).</li>
<li>Neil, G., Zimmermann, U. Electrofusion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeil%2C+G+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 220, 174-196 Forthcoming.</li>
<li>Abidor, I. G., Li, L. -H., Hui, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+cell+pellets%3A+II.+Osmotic+properties%2C+electroporation%2C+and+related+phenomena%3A+Membrane+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Studies of cell pellets: II. Osmotic properties, electroporation, and related phenomena: Membrane interactions.</a> Biophysical journal. 67, 427-435 (1994).</li>
<li>Jaroszeski, M. J., Gilbert, R., Fallon, P. G., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+facilitated+cell-cell+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mechanically facilitated cell-cell electrofusion.</a> Biophys J. 67 (4), 1574-1581 (1994).</li>
<li>Ramos, C., Bonefant, D., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+hybridization+by+electrofusion+on+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell hybridization by electrofusion on filters.</a> Analytical biochemistry. 302, 213-219 (2002).</li>
<li>Cao, Y., Yang, J., Yin, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+high-throughput+cell+electrofusion+in+a+microelectrode-array+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Study of high-throughput cell electrofusion in a microelectrode-array chip.</a> Microfluid Nanofluid. 5, 669-675 (2008).</li>
<li>Ušaj, M., Trontelj, M., Kandušer, M., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+size+dynamics+and+viability+of+cells+exposed+to+hypotonic+treatment+and+electroporation+for+electrofusion+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Radiol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cell size dynamics and viability of cells exposed to hypotonic treatment and electroporation for electrofusion optimization.</a> Radiol. Oncol. 43, 108-119 (2009).</li>
<li>Teissié, J., Ramos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+electric+field+pulse+induced+long-lived+permeabilization+and+fusogenicity+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Correlation between electric field pulse induced long-lived permeabilization and fusogenicity in cell membranes.</a> Biophys. J. 74, 1889-1898 (1998).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

非特異的に、例えば、外部電界によっては、融合する細胞膜の能力は、生物学、バイオテクノロジー、医学研究のために重要です。このような非特異的な融合は、例えばモノクローナル抗体のような非常に貴重なハイブリッド細胞とその製品の生産を可能にし、[2]核融合の基本的メカニズムに関する情報を提供します。それが適切に異なる種類の細胞に調整できるので、電気融合は、潜在的に非常に効果的な方法です。密接な物理的接触で細胞を高電圧の電気パルスによって彼らの融合状態（核融合を起こしやすい）に持って来られるときに電気融合が達成されます。電気融合の効率は、電気融合過程の二つの部分に影響を与えるさまざまなパラメータに依存します。電気融合過程の最初の部分は、細胞間の緊密な物理的な接触の成果であり、これは別の方法で得られる[3-8]。密着法（コンフルエンスまで増殖する細胞）が原因で細胞間の大きなゾーンで自発的に確立されたセルの連絡先に効率的に使用できますが、それは多くの原子核で非常に大規模な融合細胞を生成します。我々は生き残るために可能性が高いと増殖する小さな細胞が（2〜5核をもつ）、、得られる改変遵守方法を、（図1）を使用している。細胞間の接触は、また実験[9]で使用される浸透圧処理により、細胞の浸透圧膨張の恩恵を受ける。電気融合プロセスの後半では、細胞膜の融合状態を達成することである。融合状態は、膜のelectropermeabilized状態（細胞が非特異的に、通常はそのままに膜を通過できない分子に透過処理したもの）とよく相関し、電気パルス（振幅、長さ、数と周波数）の同じパラメータによって支配される[10] 。最適なエレクトロポレーションに必要な電気的パラメータの値が[1]と電気融合が異なるセル間で異なると細胞の大きさとその生物学的特性に依存する。電気的パラメータは、このように融合を得るために、融合パートナーとして使用されるさまざまな細胞株に最適化する必要があります。

<table><tbody><tr><td>CMRA</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>C34551</td><td>細胞質蛍光色素</td></tr><tr><td>CMFDA</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td>細胞質蛍光色素</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM </td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>クリスタシリン</td><td>試薬</td><td>Pliva</td><td>625110</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>試薬</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>A124873 927</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4248</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>試薬</td><td>Fluka</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>試薬</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>A154336 908</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>電気パルス発生装置</td><td>器具</td><td>IGEA</td><td></td><td>Cliniporator VITAE</td></tr><tr><td>マルチウェルプレート</td><td>器具</td><td>Techno Plastic Products</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 遠心チューブ</td><td>器具</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 遠心チューブ</td><td>器具</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 培養フラスコ</td><td>器具</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>電極</td><td>器具</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td>Pt/Ir</td></tr></tbody></table>

細胞の電気融合を蛍光顕微鏡で可視化

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

細胞の電気融合は、ヒト​​の治療のためのハイブリッド細胞を調製するために使用することができる安全な、非ウイルス性および非化学的な方法です。電気融合は密着している細胞に短い高電圧の電気パルスのアプリケーションが含まれます。短期、高電圧の電気パルスのアプリケーションは、細胞の形質膜の不安定化を引き起こす。不安定化膜は、異なる分子のため、より透過性とは、近接する不安定化膜との融合にもなりやすいです。電気融合は、このように非常に異なる細胞の非特異的な融合を実現する便利な方法です。<em&gt; in vitroで</em&gt;。電場による不安定核、細胞膜を、得るために、それらの脂質二重層とその結果としてその細胞質のマージできるように密着している必要があります。このビデオでは、我々は細胞の効率的な電気融合を示しています<em&gt; in vitroで</em&gt;修正された接着法による。この方法では、細胞がウェルの表面にわずかに接続を許可されているので、その媒体を交換できるようになり、細胞はまだ彼らの球状の形状を保持。融合可視化は、異なる蛍光細胞トラッカーの色素を持つ細胞の細胞質のプレラベリングによって評価され、細胞の半分がオレンジ色CMRAと緑CMFDAで残りの半分で標識されています。核融合の利回りは、2つを掛けたすべてのセルの数で割った二重に蛍光細胞の数として決定されます。

このビデオでは、細胞の効率的な電気融合を示しています<em&gt; in vitroで</em&gt;エレクトロポレーションおよび蛍光顕微鏡による融合細胞の可視化のその後の検出を使用して変更密着法による。

細胞電気融合は、ヒトへの治療用ハイブリッド細胞を調製するために利用可能な、安全で非ウイルスかつ非化学的な手法である。電気融合では、...

電気融合は、近接した細胞に短時間の高電圧電気パルスを印加することによって行われます。本ビデオでは、改良された接着法を用いて、in vitroでの細胞電気融合を実演します。実験はマウスメラノーマ細胞株 BF1を用いて行われました。実験では、以下の手順に従ってください。2つの別々の培養フラスコで細胞を80%コンフルエンスまで増殖させます。その後、各ストックソリューションを2.1 µLずつ個別に添加します。10 mMのC-M-F-D-AまたはCMRAを、それぞれ遠心チューブに入れた3 mLのKrebs Hess緩衝液に加えます。細胞をKrebs Hess緩衝液で2回洗浄し、その後、ローディング溶液をフラスコに注入します。ローディング溶液には、それぞれ約7 µMのC-M-F-D-AまたはCMRAが含まれています。制御された雰囲気下で、細胞を30分間インキュベートします。この最初のインキュベーションの間、領域は細胞膜を自由に通過して細胞質に入り、そこで膜透過性のIMP反応生成物へと変換されます。この最初のインキュベーション後、細胞を洗浄し、その後、培地を用いてさらに2時間インキュベートします。冷却CCDカメラを備えた蛍光顕微鏡を用い、撮影ソフトウェアで細胞を観察します。励起波長を548 nanometersに設定し、CMRAを導入した細胞の蛍光画像に適切なバンドパスフィルターを選択します。次に、CFDAを導入した細胞については、励起波長を492 nanometersに設定し、緑色蛍光画像用のバンドパスフィルターを選択します。トリプシン処理した両方のフラスコ内の細胞をカウントし、赤色細胞と緑色細胞を1:1の割合で混合し、細胞濃度を5 million cells per milliliterに調整します。各ウェルの中央に、細胞懸濁液を20 µLずつ滴下します。24ウェルプレートを用い、制御された雰囲気下で細胞を20分間インキュベートし、細胞をウェル表面に単層でわずかに接着させ、細胞同士の接触を形成させます。細胞が入ったマルチウェルプレートを顕微鏡ステージ上に設置します。電極をウェルの底に配置し、パルスジェネレーターに接続します。最適な電気融合を達成し、細胞生存率を維持するためには、適切な電気パルスパラメータを使用する必要があります。これらのパラメータは細胞株によって異なるため、予備実験で決定してください。培地を除去し、細胞を1 mLのISO potassium phosphate bufferで洗浄した後、細胞の膨潤を誘導するために350 µLのhypos Miller potassium phosphate bufferで洗浄します。電気パルスを印加する前に、細胞を高浸透圧緩衝液に2分間浸します。電気パルスは、細胞が最大体積に達した直後、すなわち調節性体積減少が始まる前に印加する必要があります。本実験における減少。1 Hzで持続時間100 µsの矩形パルスを8回連続して印加した。パルス印加後。10分間経過後、さらに10分間、細胞に刺激を与えず静置します。位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡を用いて、拡散効率を判定します。ランダムに選択した5つの視野において、位相差像、赤色蛍光像、および緑色蛍光像の3枚の画像を撮影します。Image Jソフトウェアを用いて、各画像トリプレットから3つのチャンネル画像を生成し、画像の視覚的品質を向上させます。その後、元の画像に対して、デフォルトのパラメータ設定で背景減算およびコントラスト強調などの前処理を適用します。最後に、Image JのRGB to grayプラグインを使用して、3つのチャンネル画像を合成します。得られた画像では、細胞膜とともに静止期の細胞質を確認することができます。このように、3チャネル画像を用いて、赤色、緑色、および二重蛍光の3種類の細胞数を容易に決定できます。各画像における全細胞数で二重蛍光細胞数を除し、二重蛍光細胞の割合を算出します。そして、二重蛍光細胞の割合を2倍した値を融合率と定義します。同じ色の視野の細胞を観察すると、視野内の細胞の半分が検出されないためです。

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