Name: 移行のヒトTリンパ球の単離、培養および解析インビトロ /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 学ぶヒトTリンパ球の単離・培養とインビトロ移行解析法。ICAM-1やSDF-1を用いた接着タンパク質コーティングと顕微鏡イメージングにより、免疫細胞の動態とLFA-1インテグリン機能を詳細に研究できます。

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このプロジェクトは、健康補助HL087088（MK）とHL18208（MK）の国立研究所によってサポートされていました。

1。ヒトTリンパ球の分離<ol><li>健康なドナーからのヒトの血液を入手してください。血液は、次のステップに進む前に室温（〜30分）に冷却してください。 </li><li> 8 mLの丸底ポリスチレンチューブに室温多形密度勾配媒体のピペット3mLの。ゆっくりと多形のメディアの上に全血3 mLを加える。 2種類の試薬の混合を避けることが重要です。 </li><li>室温で45分間、500 × gでチューブを遠心する。 </li><li>遠心分離に続いて、末梢血単核細胞（PBMC）は一番上のセルの層に他の血液成分から分離している。 PBMC層は、最初の曇りバンドとして、トップダウンから、表示されます。 </li><li>慎重にPBMC層上に血の透明な黄色の上相を、削除し、15 mlまたは50 mlコニカルチューブにPBMC層を転送するためにP1000マイクロピペットを使用してください。 </li><li> 5分ごとに時間を500 × gで細胞を遠心分離し、PBSで2回PBMCを洗ってください。上清は、各洗浄後やや曇っ​​たようになります。 </li></ol> 2。ヒトTリンパ球の培養<ol><li>ピペットを用いて、10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、及び1μg/ mlのフィトヘムアグルチニン（PHA）を含む20mLのRPMI 1640培地でT - 75培養フラスコにPBMCを転送する。 </li><li> 37 ° C、5％は少なくとも1時間、および最大24時間CO 2。このステップでは、フラスコの表面に付着なる単球は、懸濁液に残っているリンパ球から分離することができます。短いインキュベーション（1時間）は、このステップで使用されている場合は、手順2.1で指定されているPHAで補うことなく、10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地を使用することは可能です。 </li><li>慎重に、フラスコからメディアのすべてを削除する50 mLコニカルチューブにそれを追加し、5分間500 × gで遠心。 </li><li>現在は主にリンパ球を含む細胞ペレットを、再懸濁し、そして10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、及び1μg/ mlのPHAを含む25mLのRPMI 1640培地を含む新たなT - 75フラスコに細胞を移す。 </li><li> 3日間（PBMCの最初のインキュベーションが一夜だった場合2日間）を37℃でインキュベートする。成長の24時間後、それは新鮮な培地の15〜20 mLを加え、より大きなT - 175フラスコに転送する必要があるかもしれません。 </li><li> 3日後、フラスコ、50 mLコニカルチューブに移すからメディアおよび一時停止中のリンパ球を除去するためにピペットを使用してください。 5分間、500 × gで遠心する。 </li><li>新しいT - 75または25mLの（T - 75）または50 ml（T - 175）10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、および20 ngのRPMI 1640を含むT - 175フラスコに細胞ペレットおよび転送細胞を再懸濁します/ mLのヒトIL - 2またはIL - 15。 </li><li> 4-7日のためにリンパ球が成長する。 T - 75フラスコで始まる場合、文化は1〜2日後に拡大し、T - 175フラスコに転送する必要があるでしょう。 </li></ol> （3） 体外リンパ球遊走アッセイで <ol><li>遊走アッセイの前に1日、コートで20μg/ mLのタンパク質一晩4 PBSでまたはGとグラスボトム0.17ミリメートルディッシュ℃の</li><li> PBSで皿を洗う。 </li><li>ディッシュにPBS溶液にこれらの試薬を加え、室温で4時間インキュベートすることにより、人間のICAM-1/Fc（10μg/ mLの）と、ヒトSDF - 1（2μg/ ml）を固定化する。 </li><li>第一血球計を使用してT - 175フラスコで培養中の細胞密度を決定することによって、Tリンパ球を準備します。約2〜5 × 10 5細胞遊走の分析のために適切な細胞密度を達成するために皿ごとに使用する必要があります。 </li><li> PBSで2回、Tリンパ球を洗浄し1 mg / mLのD -グルコースを含む1 mLのL - 15培地に再懸濁します。 </li><li>広範囲にPBSでICAM-1/FcとSDF - 1を塗布した皿を洗う。 </li><li>皿に1 mLのメディアにおけるTリンパ球を移し、37でそれらをメンテナンス℃に</li></ol> 4。 NISの要素ソフトウェアを用いた動画像のキャプチャ<ol><li> NISの要素のソフトウェアを開きます。 </li><li>カメラの設定メニューでは、ライブイメージングと画像キャプチャの両方のモードとして、"2x2ビニング"を選択してください。 </li><li>アプリケーションメニューに移動し、実行定義/実験を選択してください。 </li><li>画像と画像のキャプチャシーケンスの長さの合計との間の時間の長さを選択してください。 </li><li>画像の集録を開始するには"Run"ボタンを押してください。 </li><li>細胞を追跡し、移行パラメータ（速度、パスの長さ、変位等）ImageJを、AutoQuantまたはVolocity（図1）を含むいくつかのソフトウェアパッケージ、のいずれかを使用して定量することができる。 </li><li>各セルとタイムポイントを収集する（図2）と、原点での各セルに共通の出発点（図3）をもつグラフ上に投影されるために生成するには"クモの巣のプロットを、"XY座標。 </li></ol> 5。代表的な結果 IL - 2またはIL - 15、Tリンパ球のいずれかの存在下での培養の6日目として正のCD3の染色だけでなく、肯定的なCD4および/またはCD8染色によって決定される細胞の&gt; 98％を、占める。 IL - 2の場合、我々は83％のCD4 +細胞を、15％CD8 +と&lt;1％のCD4 + CD8 +細胞を発見した。 IL - 15の場合、我々は88％のCD4 +細胞を、11％CD8 +と&lt;1％のCD4 + CD8 +細胞を発見した。 ICAM-1/SDF-1基板上でのTリンパ球の移行時に、細胞は1時間の期間にわたって持続することができる約15μm​​/分の速度を示した。抗LFA - 1リガンド阻害抗体は、深刻な移行を阻害するとして。ICAM-1/SDF-1でTリンパ球遊走には、LFA - 1媒介接着に依存しています<img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 Tリンパ球の移行の細胞追跡。Tリンパ球全血から分離し、6日間IL - 2またはIL - 15の存在下で培養を10μg/ mLのICAM - 1を塗布したガラス底皿に付着して移行させたと濃度2μg/ mLのSDF - 1。画像は、30分間10秒ごとに撮像した。細胞は、それぞれの画像で同定し、Volocityソフトウェアを使用して時間をかけて追跡した。この映画は、〜15μm/分の速度でTリンパ球のランダムな移行を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2017/2017_Kim_Movie1.mov">ビデオを見るにはここをクリック。</a> Tリンパ球の移行の動画1。細胞のトラッキング。全血と6日間IL - 2またはIL - 15の存在下で培養から分離されたTリンパ球は、10μg/ mLのICAM - 1および2μg/ mLのSDF - 1を塗布したガラス底皿に付着して移行させた。画像は、30分間10秒ごとに撮像した。細胞は、それぞれの画像で同定し、Volocityソフトウェアを使用して時間をかけて追跡した。この映画は、〜15μm/分の速度でTリンパ球のランダムな移行を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2時空間セルの位置。各セルのXY座標がVolocityソフトウェアを使用して、各時点が得られた。 <img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。"スパイダーウェブのプロット。"各セルのXYTの座標を使用して、15セルがランダムに選択し、原点を共通の出発点でプロットした。クモの巣プロットを比較すると、異なる実験条件間移行の違いを簡単に視覚的描写を与える。制御条件の下でTリンパ球遊走（左パネル）および抗LFA - 1リガンド阻害抗体（右パネル）の存在下でプロット。

<ol><li>Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+integrin+VLA-4+localizes+to+the+lamellipodia+and+mediates+t+cell+migration+on+VCAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1.</a> J Immunol. 183, 359-369 (2009).</li>
<li>Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmuscle+myosin+heavy+chain+IIA+mediates+integrin+LFA-1+de-adhesion+during+T+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration.</a> The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).</li>
<li>Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+integrins+and+their+ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+research%22%5BJournal%5D)">Leukocyte integrins and their ligand interactions.</a> Immunologic research. , (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

この実験では、一次ヒトTリンパ球の運動性を分析するためにシンプルなシステムについて詳しく説明します。vitroでの遊走のアッセイでは多くの分子と種々の細胞型の運動に関与するシグナル伝達経路の役割を解明するために使用されている。我々のプロトコルから独自の実験を設計するとき心に留めておくべきいくつかの重要なコントロールが含まれます：1）、ウシ血清アルブミン（BSA）またはポリ- Lリジン（PLL）などの非接着または非インテグリン接着基質のコーティングを、それぞれ、2 ）インテグリン特異的にそのような我々のプロトコルで説明されているSDF - 1などの刺激シグナル、なし抗体のインテグリン特異性を決定するために、治療、および3）共同コーティングをブロック。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH300070.03</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>1-Step Polymorphs</td><td>Accurate Chemical &amp;amp; Scientific Corporation</td><td>AN221725</td><td></td></tr><tr><td>PHA</td><td>Remel, Thermo Fisher Scientific</td><td>R30852801</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトIL-2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>202-IL</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトIL-15</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>247-IL</td><td></td></tr><tr><td>プロテインG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19459</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトICAM-1/Fc</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>720-IC</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトSDF-1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>350-NS</td><td></td></tr></tbody></table>

移行のヒトtリンパ球の単離、培養および解析インビトロ</em

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Tリンパ球の遊走は、他の細胞や細胞外マトリックスタンパク質と発現するリガンドと細胞表面のインテグリンの接着剤の相互作用を伴います。低親和性状態からセル最先端で高親和性状態へのインテグリンの正確な時空間的活性化は、Tリンパ球遊走に重要です。<sup&gt; 1</sup&gt;。同様に、セルの後縁の撤回は、または腹肢、永続的なインテグリン依存性のTリンパ球の運動性を維持する上で必要なステップです。<sup&gt; 2</sup&gt;。白血球の過度の募集と遊走を阻害する手段として、自己免疫や炎症性疾患のターゲットのインテグリンへの多くの治療的アプローチ<sup&gt; 3</sup&gt;。ヒトTリンパ球遊走を調節する分子事象を研究するために、我々が利用してきた<em&gt; in vitroで</emTリンパ球が血管から募集中遭遇する環境を模倣した二次元の基板上に細胞の移動を分析する&gt;システム。 Tリンパ球は、最初の人間のドナーから単離され、その後刺激し、7〜10日間培養されています。アッセイ中に、Tリンパ球は、細胞間接着分子-1（ICAM - 1）、インテグリンLFA - 1のリガンド、および間質細胞由来因子-1（SDF - 1）でコーティングされた基板上に付着して移行することが許可されています。我々のデータは、Tリンパ球が〜15μm/分の回遊速度を示すことを示している。 Tリンパ球遊走は、インテグリンの阻害によって抑制することができる<sup&gt; 1</sup&gt;または細胞移動を調節する細胞性アクトミオシンの機械の阻害剤による<sup&gt; 2</sup&gt;。

Tリンパ球遊走には、リンパ器官、血管系から出口へのホーミング中に発生し、末梢組織に入る。ここで、我々は、Tリンパ球の遊走を分析するために使用できるプロトコルを記述する<em&gt; in vitroで</em&gt;。

移行のヒトTリンパ球の単離、培養および解析インビトロ</em

Tリンパ球の遊走には、細胞表面のインテグリンと、他の細胞上に発現するリガンドまたは細胞外基質との接着相互作用が関与しています。

Tリンパ球の遊走は、リンパ器官へのホーミング、血管系からの脱出、および末梢組織への進入の際に起こります。このプロセスには、T細胞表面と他の細胞との接着相互作用が関与しています。この現象をin vitroで検討するために、ヒトTリンパ球を単離・培養し、接着タンパク質でコーティングした組織培養プレート上に配置します。ICAM-1およびケモカインSDF-1です。これにより、Tリンパ球の遊走画像を収集し、解析することが可能になります。こんにちは、ロチェスター大学ワクチン生物学・免疫学センターのMinsu Kim研究室のCraig LeFortです。本日は、ヒトTリンパ球の単離および培養と、そのin vitroにおける遊走能の解析手順について解説します。当研究室では、インテグリンの役割とT細胞の遊走を研究するためにこのアッセイを用いています。T細胞における主要なインテグリンは、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）です。LFA-1の特異的リガンドはICAM-1などのICAM分子です。さらに、T細胞の遊走には、方向性のシグナルを提供し、かつインテグリンを活性化させるためのケモカインシグナルが必要です。本アッセイでは、T細胞遊走の基質として、ヒトICAM-1およびCXCL12（SDF-1）を使用します。それでは始めましょう。健康なドナーからヒト血を得た後、血液を室温まで冷却させます。これには約 30 分かかります。血液を冷却した後、室温のポリモルフ密度勾配培地 3 mL を 8 mL の丸底ポリスチレンチューブに静かにピペットで分注します。次に、その上に全血 3 mL を静かに加えます。この際、混ざらないようにすることが重要です。チューブを遠心分離機にセットし、500 Gで45分間遠心分離します。遠心分離後、室温において末梢血単核細胞（PBMC）が他の血液成分から分離されます。PBMC層は、上から1番目の白濁したバンドとして現れます。無菌条件下で、上の透明な黄色い層を慎重に取り除いて廃棄します。次に、P 1000 マイクロピペットを使用して、PBMC層を新しいコニカルチューブに移します。PBSでPBMCを2回洗浄し、細胞を 500 G で5分間遠心分離します。洗浄後、上清は毎回わずかに濁ります。10% FBS、1% ペニシリン・ストレプトマイシン、および 1 µg/mL のフィトヘマグルチニン（PHA）を含む 20 mL の RPMI 1640 培地で細胞を再懸濁します。PHA 存在下でのインキュベーションにより、T リンパ球の活性化と増殖が誘導されます。ピペットを用いてPBMCをT 75培養フラスコに転送します。次に、37 °C、5% CO2条件下で1〜24時間インキュベートします。この工程により、フラスコ表面に接着する単球を、浮遊状態のままとなるリンパ球から分離させることができます。インキュベーション後、主にリンパ球を含む培地をすべて慎重に取り除き、15 mLコニカルチューブに移します。500 Gで5分間遠心分離します。細胞ペレットをRPMI 1640で再懸濁し、FBS、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびPHAを含む25 mLのRPMI 1640が入った新しいT 75フラスコに細胞を移し、37 °Cでインキュベートします。24時間の培養後、15～20 mLの新鮮な培地を添加し、より大きなT 175フラスコに継代させる必要がある場合があります。そのまま2～3日間 incubation を継続してください。PBMCの初回 incubation を一晩行い、その後3日間経過した場合は、ピペットを用いて浮遊リンパ球を含む培地を除去し、50 mLコニカルチューブに移して 500 G で5分間遠心分離します。Reeseは細胞ペレットを回収し、25 millilitersのRPMI 1640にFBS、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびヒトIL-2またはIL-15を添加した新しいT 75フラスコに細胞を移しました。その後、細胞をインキュベーターに入れます。T 75フラスコから開始する場合、培養細胞を拡大し、T 175フラスコに移す必要があります。1〜2日後、リンパ球を合計4〜7日間培養します。遊走アッセイの1日前に、0.17 millimeterのガラスボトムディッシュを20 micrograms per milliliterのプロテインAまたはGを含むPBSでコーティングし、4 degrees Celsiusで一晩インキュベートします。翌日、ディッシュをPBSで十分に洗浄し、ICAM one FCおよびヒトSD F1を含むPBS溶液をディッシュに加えます。分子を固定するため、室温で4時間インキュベートします。ヘモサイトメーターを用いて、培養細胞の密度を測定します。その後、リンパ球をPBSで2回洗浄し、D glucoseを含むL 15培地1 mLに再懸濁させます。インキュベーション後、ICAM-1 FCおよびSDF-1でコーティングしたディッシュをPBSで十分に洗浄し、1 mLの培地に懸濁したTリンパ球をディッシュに移します。遊走解析に適した細胞密度を得るため、1ディッシュあたり約2～5 × 10⁵個の細胞を使用してください。細胞遊走の画像を取得するには、37 °Cの加熱チャンバーなどの温度管理された環境下で、ディッシュを顕微鏡ステージに設置します。画像設定メニューでNIS-elementsソフトウェアを開きます。ライブイメージングと画像キャプチャの両方のモードとして、2×2ビニングを選択します。アプリケーションメニューに移動し、「define」、「run」、「experiment」を選択します。画像撮影の間隔と合計時間を設定してください。画像キャプチャシーケンスについては、「run」ボタンを押して、設定に従い画像取得を開始します。速度、移動距離、変位などの遊走パラメータは、Image J Auto Quantやvelocなどのソフトウェアパッケージを用いて定量化できます。スパイダーウェブプロットを作成するには、各細胞および各タイムポイントのXY座標を収集し、各細胞の共通の開始点を原点とするグラフ上に投影します。ここに示したTリンパ球は、ICAMおよびSDF-1をコーティングしたプレート上で培養され、30分間にわたって10秒ごとに撮影されました。この動画では、各細胞のXYT座標を用いて、Tリンパ球が分速約15 micronsの速度でランダムに遊走する様子を示しています。15個の細胞を無作為に選び、原点を共通の開始点としてプロットしました。スパイダーウェブプロットを比較することで、異なる実験条件間での遊走パターンの違いを視覚的に迅速に把握することができます。左側にはコントロール条件下でのTリンパ球遊走のプロットを、右側には抗LFA-1リガンド遮断抗体存在下でのTリンパ球遊走のプロットを示します。これらのデータは、Tリンパ球がICAM-1基質上を遊走するためにインテグリンLFA-1を利用していることを証明しています。以上で、培養ヒトTリンパ球を用いた遊走アッセイの手順について解説しました。細胞の追跡と遊走の解析を簡便にするため、ICAM-1をコートしたディッシュに適切な数の細胞を添加することが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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