移行のヒトTリンパ球の単離、培養および解析インビトロ

Tリンパ球の移動は、リンパ器官へのホーミング、血管系からの出、および末梢組織への侵入中に発生します。このプロセスには、T細胞表面と他の細胞との接着相互作用が含まれます。この現象を調べるために、in vitroでヒトTリンパ球を単離し、培養し、接着タンパク質でコーティングした組織培養プレート上に配置します。

ICAMとケモカインSDFの1つです。その後、Tリンパ球の遊走の画像を取得して分析できます。こんにちは、私はクレイグ・ルフォートと、ロチェスター大学のワクチン生物学・免疫学センターのミンス・キム

今日は、ヒトの10代のリンパ球の単離と培養の手順、in vitroでの移動の分析を紹介します。私たちの研究室では、このアッセイを使用して、インテグリンの役割とT細胞の遊走を研究しています。T細胞の主要なインテグリンは、リンパ球機能関連抗原1またはLFAです。

LFA oneの特定の配位子は、ICAM oneなどのicasです。さらに、T細胞の遊走が方向性シグナルを提供するとともにインテグリンを活性化するためには、kinシグナルが必要です。私たちのアッセイでは、ヒトICAM1とCX CL12またはSDF1をT細胞遊走の基質として使用します。

それでは始めましょう。健康なドナーから人間の血液を採取した後、血液を室温まで冷まします。これには約30分かかります。

血液が冷えたら、室温で3ミリリットルのピペットで、密度勾配培地を8ミリリットルの丸底ポリスチレンチューブに多形します。次に、その上に3ミリリットルの全血をそっと加えます。混ざらないようにすることが重要です。

チューブを遠心分離機に入れ、500 Gで45分間回転させます。遠心分離後の室温では、末梢血単核細胞またはP BMCが他の血液成分から分離されています。PBMC レイヤーは、上から 1 番目の曇りバンドとして表示されます。

無菌条件下で、透明な黄色の上相を慎重に取り外して廃棄します。次に、P 1000マイクロピペットを使用して、PBMC層を新しい円錐管に移します。PBMCをPBS遠心分離セルで500 Gで5分間2回洗浄します。

毎回、上清は洗うたびにやや曇ります。10%FBS、1%ペニシリンストレプトマイシン、および1ミリリットルあたり1マイクログラムを含む20ミリリットルのRPMI 1640培地に細胞を再懸濁します。PHAの存在下でのフィトヘマグルチニンまたはPHAインキュベーションは、Tリンパ球の活性化と拡大を誘導します。

ピペットを使用して、pbmcをT 75培養フラスコに移します。次に、摂氏37度と5%の二酸化炭素を1〜24時間インキュベートしました。このステップにより、フラスコ表面に付着する単球を、懸濁液に残ったリンパ球から分離することができます。

インキュベーション後、主にリンパ球を含むすべての培地を慎重に取り出し、15ミリリットルの円錐管に移します。500 Gで5分間遠心分離します。リースはRPMI 1640の細胞ペレットであり、FBS、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびPHAを摂氏37度でインキュベートしたRPMI 1640の25ミリリットルを含む新しいT 75フレーズに細胞を移します。

成長の24時間後、15〜20ミリリットルの新鮮な培地を追加し、より大きなT 1 75フラスコに移す必要があるかもしれません。3日間または2日間インキュベートを続けます。PBMCの最初のインキュベーションが3日後に一晩であった場合は、ピペットを使用して、懸濁リンパ球を含む培地を取り出し、500Gの50ミリリットルの円錐管遠心分離機に5分間移します。

リースは細胞ペレットであり、細胞を25ミリリットルのRPMI 1640を含む新しいT75に移しました。FBSでは、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびヒトIL 2またはIL 15を使用して、細胞をインキュベーターに入れます。T 75フラスコを開始する場合は、培養物を拡張してT 1 75フラスコに移す必要があります。

1〜2日後、合計4〜7日間リンパ球を成長させます。移行アッセイの前日、底の0.17ミリメートルのガラス皿にPBS中のプロテインAまたはGを1ミリリットルあたり20マイクログラムでコーティングし、翌日4°Cで一晩インキュベートします。PBSで皿を広範囲に洗い、次にICAM one FCとPBS溶液中のヒトSD F1を皿に加えます。

室温で4時間インキュベートし、分子を固定化します。ヘモサイトメーターを使用して培養細胞の密度を決定します。次いで、リンパ球をPBSで2回洗浄し、インキュベーション後にDグルコースを含有するL15培地1ミリリットルに再懸濁し、コーティング皿をICAMで洗浄し、FCおよびSDFでPBSで広範囲に洗浄し、1ミリリットルの培地中のTリンパ球を皿に移し、1皿あたり約2〜5回10〜5倍の5番目の細胞を皿に転写して、遊走解析に適した細胞密度を達成する必要がある。

細胞遊走の画像を取得するには、37°Cの加熱チャンバーなどの温度制御された環境にある顕微鏡ステージにディッシュを置きます。イメージ設定メニューでNIS elementsソフトウェアを開きます。ライブ イメージングと画像キャプチャの両方のモードとして 2 x 2 ビニングを選択します。

アプリケーションメニューに移動し、選択、定義、実行、実験します。画像間の時間の長さと合計時間を選択します。画像キャプチャシーケンスの場合は、実行ボタンを押して、取得後に画像取得を開始します。

速度、パス長、変位などの移行パラメータは、Image J Auto Quantやvelocなどのソフトウェアパッケージを使用して定量化できます。クモの巣プロットを生成するには、各セルと時間点のXY座標を収集し、各セルの共通の開始点を原点とするグラフに投影します。ここに示したTリンパ球をICAMおよびSDF oneに培養し、10秒ごとに30分間イメージングしました。

この動画は、各細胞のXYT座標を用いて、Tリンパ球が毎分約15ミクロンの速度でランダムに遊走する様子を示しています。15個の細胞をランダムに選択し、共通の開始点を原点としてプロットしました。クモの巣プロットを比較すると、異なる実験条件間の移動の違いをすばやく視覚的に描写できます。

制御条件下でのTリンパ球の遊走のプロットを左に、抗LFA 1つのリガンドブロッキング抗体の存在下でのTリンパ球の遊走のプロットを右に示します。これらのデータは、Tリンパ球がインテグリンLFA oneを利用してICAM one基質上を移動することを示しています。この手順で、培養ヒトTリンパ球を使用した遊走アッセイの方法を示しました。

1つのコーティングディッシュに適切な数の細胞を追加することで、細胞の追跡と遊走の分析が簡素化されることを覚えておくことが重要です。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。