ゼブラフィッシュのオプトジェネティクス:幼虫の行動反応を研究するための遺伝子組み換え体性感覚ニューロンの活性化

- ゼブラフィッシュの幼生では、視覚刺激が体性感覚ニューロンを活性化し、逃避反応を引き起こすことがあります。幼虫に見られるこのようなニューロンには、三叉神経ニューロンとRohon-Beardニューロンの2種類があります。これらのニューロンを改変してトランスジェニック光感受性イオンチャネルを発現させることで、その活動を操作することができます。このアプローチはオプトジェネティクスと呼ばれます。

この技術を実行するには、トランスジェニック幼虫を背側を上に向けてアガロースゲルにマウントし、解剖顕微鏡の下に置きます。かみそりの刃を使用して、卵黄と尾の周りからアガロースのくさび形の部分を取り外します。この領域を卵水で満たします。アガロースを幼虫の幹と尾から引き離します。

光ケーブルの先端を、Rohon-Beardニューロンの細胞体が位置する幹の近くに配置します。青色レーザー光のパルスを照射します。ブルーライトにさらされると、ニューロンの膜にあるトランスジェニック光感受性イオンチャネルが開き、イオンが入り込むことができ、逃避応答を誘発する活動電位が引き起こされます。ハイスピードカメラで幼虫の行動を記録します。

プロトコル例では、幼虫をマウントしてRohon-Beardニューロンを活性化し、チャネルロドプシン変異体を発現させ、行動応答を観察します。

- 1.5%の低溶融アガロースを二重蒸留水で作り、固まらないように摂氏42度のヒートブロックで保存します。ガラス製のパスツールピペットを使用して、プレスクリーン幼虫の1つを、青色胚の水ができるだけ少ない1.5%低融点アガロースのチューブに移します。次に、アガロースの滴に入った幼虫を小さなペトリ皿に移します。

解剖顕微鏡で、幼虫の背側を上にして配置します。アガロースが固まったら、細いカミソリの刃を使って幼虫の両側からアガロースを切り取ります。アガロースの周囲を胚の青い水で満たします。

次に、幼虫を傷つけないように注意しながら、卵黄の両側を斜めに2つ切り込みます。その後、アガロースを幼虫の幹と尾から引き離します。

次に、ハイスピードカメラを解剖スコープに取り付け、カメラをコンピューターに接続します。次に、コンピューターとハイスピードカメラの電源を入れます。ビデオイメージングソフトウェアを開き、カメラの設定を調整します。次に、光ケーブル、レーザー、刺激装置を一緒に接続します。次に、刺激装置の電源を入れ、最大5ボルト、パルス持続時間を5ミリ秒に設定します。その後、レーザーをオンにします。

次に、蛍光解剖顕微鏡を使用して、ChEF-tdTomatoが発現するニューロン細胞体の近くに光ケーブルの先端を配置します。青色光のパルスを照射して、感覚ニューロンを活性化します。次に、毎秒500フレームまたは1,000フレームに設定された高速度カメラを使用して応答を記録し、活性化の間に少なくとも1分間隔を空けて実験を繰り返して、慣れないようにします。

幼虫を放すには、鉗子でアガロースをこじ開け、動物を傷つけないように注意してください。次に、それを新鮮な青い胚の水に移します。動物はさらに成長させることができ、この手順は古い段階で繰り返すことができます。また、胚を再マウントして活性化細胞の高解像度共焦点イメージングを行い、その挙動を細胞構造と相関させることもできます。