リコンビナーゼ媒介カセット交換を用いて、マウス胚性幹細胞における構造と機能の研究

この構造機能法の全体的な目標は、ナイーブまたは分化したマウス胚性幹細胞におけるさまざまなタンパク質ドメインの役割、または疾患に関連する突然変異を分子レベルで分析することです。この方法は、タンパク質のさまざまな残基またはドメインが、特定の細胞状況でその機能にどのように寄与するかを明らかにするのに役立ちます。この技術の主な利点は、ノックアウト胚性幹細胞(ES細胞)のゲノムに対するレスキューコンストラクトの非常に効率的な標的化と、さまざまな細胞タイプにおけるそれらの役割の調査を可能にすることです。

そのために、高効率な3つの技術を組み合わせます。これらには、改良されたマウス胚性幹細胞の単離、組換えベースのターゲティング因子アセンブリ、および組換えを介したカセット交換(RMC)によるES細胞のターゲティングが含まれます。いくつかの手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるJinke D'Hontです。

組換え媒介カセット交換(RMCE)は、ベクターとゲノム遺伝子座との間のDNA断片の交換を可能にします。RMCEは、交差反応せず、ゲノム遺伝子座に埋め込まれたヘテロ特異的な組換え部位を利用します。同じヘテロ特異的部位に隣接するDNA断片を含むドナープラスミドの存在下では、リコンビナーゼは、二重同時転座により、このDNA断片をRMCE適合ゲノム遺伝子座に挿入します。

正しい組換えによってのみ、Rosa 26ドッキング部位に閉じ込められたプロモーターレスネオマイシン耐性遺伝子は、入ってくる標的ベクターのPGKプロモーターを介して回復し、薬剤耐性を示します。このネオマイシン耐性トラップシステムは、非常に高いターゲティング効率をもたらし、多くの場合100%近くになります胚盤胞分離の前日、0.1%ゼラチンを12枚のよく培養されたプレートに加えます。そして、それらを摂氏37度で5分間インキュベートします。

ゼラチン溶液を吸引します。次に、P2マウス胚性線維芽細胞(MEF)のバイアルの4分の1をMEF培地に播種し、12ウェルプレートで分けます。MEFの12ウェルプレートを2ミリリットルのMEF培地で摂氏37度でインキュベー

そして、細胞をコンフルエントな単層に成長させます。次に、マイトマイシン種子のミリリットルあたり10マイクログラムをウェルに追加します。そして、培養物を摂氏37度で3時間インキュベートし、細胞を不活性化します。

テキストプロトコルに従ってRosa 26遺伝子座にRMCEカセットを含むヘテロ接合型ノックアウトマウスを選抜した後、RMCE適合ヘテロ接合型ノックアウトマウスをヘテロ接合型ノックアウトマウスと交配して交配します。翌朝、物語の根元で女性を持ち上げて交尾プラグをチェックし、膣口に白っぽい腫瘤がないか調べます。プラグが見づらい場合は、角度のあるプローブを使用して、外陰部の唇をわずかに広げてから、プラグを差し込んだ女性を男性から分離します。

性交後3.5日、またはDPCで胚盤胞を採取すること。妊娠中の女性を安楽死させた後、腹側中央部を切開し、細いハサミと鉗子を使用して子宮と卵管を解剖します。次に、26ゲージの針を45度の角度に曲げ、M2培地を充填した1ミリリットルの注射器に取り付けます。

そして、卵管に最も近い子宮の端に針を挿入します。細い鉗子を使用して針を所定の位置に保持し、プランジャーを押して子宮から10センチの皿の蓋に胚盤胞を洗い流します。フラッシングが成功すると、子宮が腫れます。

マウスピペットを使用して、M2培地の滴にすべての胚を採取し、M2培地の滴で胚を2回洗浄します。胚を洗浄した直後に、PBSを使用して、マイトマイシンC不活化細胞を2回洗浄します。次に、マウスピペットを使用して、各胚盤胞をマイトマイシンC処理MEFの別々のウェルにプレートし、SRES細胞培地に多能性または2Iを補充します。

培養物を摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートします。SREF細胞培地は2〜3日ごとにリフレッシュしてください。各胚盤胞を実体顕微鏡で4倍の倍率で観察し、MEF層への孵化と剥離を確認します。

10〜12日間の培養後、実体顕微鏡下で、使い捨てチップ付きのP10ピペットを使用して、個々のiciumの成長物を採取します。各成長物を、PBSのウェルあたり30マイクロリットルを含むV字型の96ウェルプレートの約10マイクロリットルの中型からV字型の96ウェルプレートに移します。マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに50マイクロリットルの0.25%トリプシンを加えます。

そして、プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%で3分間インキュベートします。インキュベート済みのFPS含有ES細胞培地100μLを添加し、ピペッティングを10〜15回行ってiciumの増殖物を単一細胞に解離します。次に、解離した細胞をマイトマイシン-C処理した96ウェルMEFプレートに移します。

翌日、SRベースのメディアを交換してください。ES細胞を同様の方法で24ウェルプレートから6ウェルプレートに増殖させます。テキストプロトコルに従ってレスキューされたCDNAベクターを同定した後、100ナノグラムのレスキューCDNAベクター、150ナノグラムの事前に切除されたRMCEDV1ベクター、および2マイクロリットルのリコンビナーゼミックスを使用して、10マイクロリットルのLR反応を準備します。これには、ファージコードインテグラーゼ、エクスキシオナーゼ、および細菌統合宿主因子が含まれています。

反応を摂氏25度で2時間インキュベートします。再結合ベクターを形質転換するには、各混合物の5マイクロリットルを、2ミリリットルのスカート付きスクリューキャップチューブに40マイクロリットルの熱ショック有能な大腸菌に加えます。そして、サンプルを氷上で20分間インキュベートします。

次に、細胞を摂氏37度で5分間インキュベートします。1ミリリットルのLB培地をチューブに加え、細胞を摂氏37度で1時間インキュベートします。アンピシリンを入れた寒天プレートに50マイクロリットルをプレートします。

そして一晩で摂氏37度で成長します。P200チップを使用して5つのコロニーをランダムに選択することにより、正しいターゲティングベクターを持つコロニーを特定します。2〜5ミリリットルのLB培地が入ったガラス試験管にチップを移し、摂氏37度で一晩成長させます。

各コロニーからDNAを抽出した後、0.5〜2マイクログラムのDNAを消化してサンプルを検証し、サンプルを1%アガロースゲルで分離します。RMCE適合ノックアウトES細胞の培養を開始し、FBSベースのES細胞培地でMEFに少なくとも2回継代します。次に、ES細胞をゼラチン化した6ウェルプレート上で分割します。

翌日、1.5ミリリットルのFBSベースのES細胞培地を使用して、約50%のコンフルエントなES細胞をリフレッシュします。レスキュー CDNA を含む 1 マイクログラムの切除済み RMCEDV1 ターゲティングベクターと 1 マイクログラムの FLIPe 発現プラスミドを 250 マイクロリットルの純粋な DMEM 培地に組み合わせます。250マイクロリットルの純粋なDMEM培地に7マイクロリットルのリポフェクチンベースのトランスベクション試薬を添加します。

そして、溶液を室温で5分間インキュベートします。DNA溶液とリポフェクチン溶液を組み合わせます。そして、混合物を室温で20分間インキュベートします。

次に、トランスベクション混合物をリフレッシュしたES細胞にピペットで移動させ、静かに渦巻きます。トランスベクションの1日後、チューブからすべてのES細胞を10cmの培養皿に分割し、DR4 MEFSのコンフルエント層と10ミリリットルのFPSベースのES細胞培地を充填します。トランスベクションの2日後、G418を培地に添加することにより、正しいFLIP-e媒介カセット交換でES細胞クローンを選択します。

ここに示されているように、標的とされていないコロニーの大量殺戮は、3〜5日後に見えるはずです。コロニーは7〜10日後に現れるはずです。これらのコロニーを選択してから拡大し、このビデオで前述したようにクローンを確認します。

ES細胞を胚様体(EB)に分化するためには、テキストプロトコルに従ってRosa 26駆動レスキューコンストラクトでノックアウトES細胞を培養した後、非接着性皿にEBを30日間形成させます。EB懸濁液を50ミリリットルのチューブに移すことにより、2〜3日ごとに培地をリフレッシュします。そして、EBを重力によって沈降させます。

上清を取り除き、新しい培地を加え、EB懸濁液をバクテリアグレードの皿に移します。テキストプロトコールに従って、免疫蛍光法とTEM法によりES細胞とEBを解析します。構造関数法を使用して、5つの事前に切除されたRMCEDV1ターゲティングベクターを100%の効率で生成し、これらのレスキューコンストラクトをRMCEを介して標的とし、P120カテニンノックアウトES細胞に97%の効率でCystic EB形態を、さまざまなレスキューコンストラクトをスクリーニングするための表現型の読み取り値として使用できます。

概念実証として、R26駆動のP120カテニンアイソフォーム1Aは、p120カテニンノックアウト表現型を救出しました。P120カテニンのE-カドヘリン非依存性膜固定が細胞性EB形成を可能にするかどうかを検証するために、k-rasメンブレンターゲティングモチーフであるCAAXをP120カテニンのカルボキシ末端に融合させ、RMCEを介してP120カテニンノックアウトES細胞に導入しました。しかしながら、このコンストラクトは、E−カドヘリンの結合および安定化を許さない支配的なネガティブを提供する。

そして結果として、p120カテニンノックアウト表現型を救出しません。上皮間葉転換(EMT)は、ES細胞の分化中にも発生する重要な発生プロセスです。p120カテニンノックアウトES細胞で発現すると、EMT誘導体、ZEB1、ZEB2、またはE-カドヘリンなどのさまざまな上皮マーカー遺伝子を直接抑制できるカタツムリは、嚢胞性EB形成を回復できませんでした。

一度習得すると、RMCE互換ES細胞は1か月以内に単離できます。RMCE適合ターゲティングベクターは1週間以内に生成でき、ES細胞のターゲットレスキューは、適切に実施されれば、この手法を使用して1か月以内に達成できます。このビデオを見れば、RMCEを使用してナイーブまたは分化した胚性幹細胞の構造機能研究を行う方法について十分に理解できるはずです。