用いた機能クローニング

本手順の全体的な目的は、受容能を持つ外胚葉において反応を誘導できる遺伝子産物を同定することに適した、アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞およびアニマルキャップ系を実証することです。この手法は、誘導反応を引き起こすためにどのような遺伝子が必要かという、発生生物学分野における重要な疑問への回答に寄与します。本手法の主な利点は、発現系としてXenopus卵母細胞を用いることで、標的組織に作用する誘導因子、あるいは誘導因子のさらに上流で作用する遺伝子を産生し、同定できる点にあります。

解剖および組み換えのステップはステージに強く依存し、洗練された技術を要するため、本手法を視覚的に提示することは非常に有用です。麻酔をかけたメスのカエルの卵巣組織を採取した後、組織を1片あたり約10〜20個の卵母細胞を含む小さな断片にちぎります。これらの断片を、まず新鮮なOR2溶液に、次に2.0 mg/mLのcollagenase Aを含むOR2溶液に移します。続いて、組織を含む混合液をシェーカーで1時間、緩やかに攪拌します。

次に、断片を新しいコラゲナーゼ溶液に移し、さらに1時間攪拌します。この処理の終了時に、凝集が解消された卵母細胞が観察されるはずです。続いて、卵母細胞を完全OR2で10回洗浄し、その後、OCMと略記される卵母細胞培養培地で2回洗浄します。

その後、卵母細胞を新鮮なOCMに移し、解剖顕微鏡下で視覚的に検査します。より小さく未成熟な卵母細胞を除去することで、ステージ6のものを分離します。次に、卵母細胞をOCMを含むアガロースコートしたペトリ皿に入れ、注入まで18〜20 °Cで保持します。

マイクロインジェクションの準備として、ガラスキャピラリーチューブをニードルプラーにセットして延伸させ、その後、ガラスの先端を折り取って直径約20 µmのニードルを作成します。複合顕微鏡を用い、校正済みの接眼ミクロメーターでニードルの先端を測定します。次に、35 × 10 mmのペトリ皿の底にクレイを均一な層になるように押し付けます。

次に、小さなプローブのようなツールを使用して、この層に平行な溝を作成します。粘土を敷いたディッシュに、1x修正Barth塩類溶液（MBS）で調製した3%Ficollを約2 milliliters満たします。その後、広口ピペットを用いて卵母細胞をそこへ移します。

その後のマイクロインジェクション中に固定されるよう、卵母細胞を溝に配置します。マイクロインジェクターを用いて、あらかじめ調製したmRNAプールを約2 µL針に充填し、注入中に卵母細胞の細胞質が針内に吸引されるのを防ぐため、わずかな正圧がかかるようバランスを調整します。その後、各卵母細胞の赤道領域に20 nLのRNAを注入します。

その後、卵母細胞をFicoll MBSに1時間静置し、慎重に1x MBSへ移します。続いて、卵母細胞を20°Cで8〜24時間インキュベートします。アニマルキャップアッセイを開始するために、3/4x normal amphibian medium（略称：NAM溶液）、精密ピンセット、ヘアループ、事前に注入済みの卵母細胞、およびステージ11〜11.5のゼノパス胚を用意します。

次に、ガラスカバースリップを約1 mm × 2 mmのサイズの破片に砕き、端が研磨され丸くなるまで炎にかざします。続いて、前述の方法に従い、ディッシュの中に粘土を単層に押し付けます。そして、小型のプローブを用いて、このコーティングの中にカップ状の個別の圧痕を作成します。

ディッシュに約2 mLの3/4x NAMを満たします。そこに注射済みの卵細胞を移し、それぞれの卵細胞が1つの窪みの中で固定されるように配置します。胚を準備するために、それらを3/4x NAM溶液の入ったディッシュに移します。

外胚葉の齢を確認するためのステージングコントロールとして使用する原腸胚を一部選び、同じ溶液が入った別のディッシュに移動させます。そして、このプレートを脇に置いておきます。動物極キャップアッセイに使用する胚については、2組の微小ピンセットを用いて卵黄膜を除去します。

その後、原胃胚を卵母細胞が入った粘土敷きのディッシュに移します。まず、2組の精密ピンセットを用いて、赤道域の組織を避けるように注意しながら、胚から動物極キャップを切り出します。第1の方法を用いて組み換え体を作成するには、あらかじめくぼみに配置した卵母細胞の動物極半球に、動物極キャップの内面が接触するように配置します。

この工程を、注入した複数の卵母細胞に対して繰り返します。これらの組み換え体を固定させるため、それぞれの卵母細胞の上に湾曲したガラスカバースリップの破片を置き、動物極が平らになり、カバースリップが粘土に接触するまで下方に圧力をかけます。2番目の方法で組み換え体を生成するには、動物極キャップと卵母細胞を粘土の個別の空の窪みに一緒に配置します。

そして、アニマルキャップの内側が卵細胞に向くようにしてください。次に、粘土の小さな断片を用いて、2つの組織を固定します。どちらの方法においても、複数の組換え体が作成できたら、それらと別途用意した対照胚を20 °Cで培養してください。

コントロール胚が目的のステージに達したら、組換え胚からカバーガラスを取り外し、ピンセットとヘアループを用いて動物極外胚葉を分離します。続いて、外胚葉断片とコントロール胚の両方をMEMFAで1時間固定します。その後、それらをエタノールに移し、この組織を-20°Cで保存します。

ここでは、段階的に少なくなったクローンまたはコロニーに対応するmRNAプールを卵母細胞のセットに注入し、動物極キャップとともに培養しました。続いて、初期神経板段階から嚢胞形成にかけて presumptive lens ectoderm（レンズ原基外胚葉）で通常観察され、ここではレンズ誘導能を評価するために使用したマーカーであるfoxe3を発現している動物極キャップの数を、各セットで測定しました。この手法により、評価した動物極キャップの179個中50個（28%）でレンズ誘導反応を引き起こすことができる核因子コード遺伝子ldb1が同定されました。

ここに示すin situハイブリダイゼーション像において、もおよそステージ11からステージ23までldb1注入卵母細胞と共に培養した動物極外胚葉（animal caps）に、矢印で示されるfoxe3シグナルが認められました。対照的に、未注入の卵母細胞上に配置したコントロールの動物極外胚葉では、foxe3の発現は見られませんでした。これらの動物極外胚葉から切片を作成したところ、内側および外側の外胚葉層の両方でfoxe3の発現が観察されました。

内層での発現は水晶体反応の特徴です。あるいは、両方の層でシグナルが検出される場合は、嗅盤などの他の構造を示しています。この手順に従った後、免疫組織化学、in situ ハイブリダイゼーション、または蛍光レポーター遺伝子の直接検出などの手法を用いて、動物極外胚葉における誘導反応を評価することができます。