Name: 用いた機能クローニングアフリカツメガエル卵母細胞発現システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 学ぶXenopus卵母細胞とアニマルキャップシステムを用いた機能クローニング法。外胚葉への誘導応答を引き起こす遺伝子産物を同定し、発生生物学における遺伝子機能解析の強力なツールとして活用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作業は、シェパード大学財団からのC.Z.P.への専門能力開発助成金によって支援されました。 著者は、プロトコルに関する有益な議論をしてくれたBrett Zirkle氏とMalia Deshotel氏、そして寛大な支援を提供してくれたCarol Hurney博士に感謝したいと思います。

全ての実験手順は、バージニア州制度動物実験委員会の大学によって承認されました。 注： 図1は、実験手順の概略を示しています。 卵母細胞の調製<ol><li>事前プライムX.卵母細胞の単離の前に妊馬血清性性腺刺激ホルモン（PMSG）の150 Uと女性約1週間をアフリカツメガエル 。 29 G針と1ccの無菌注射器と背側リンパ嚢に1 mlの150 U / mLのPMSGを注入。 </li><li>卵母細胞注入と卵母細胞アニマルキャップアッセイのためのソリューションを準備します。 <ol><li>準備のCa ++ / Mg ++を含まないOR 2（OR2-）：82のNaCl、2.5mMのKClを、1.5mMのの Na 2 HPO 4、50mMのHEPES pHは7.2。 </li><li> OR2-プラス1 mMのCaCl 2および1mM MgCl 2：OR 2 を準備します。 </li><li> 60％リーボビッツL15、0.4 mg / mlのBSA、100μg/ mlのゲンタマイシン、pHが7.8：OCMを準備します。 </li><li>前1X MBS削減する：88のNaCl、1 mMの塩化カリウムを、0.7 mMのCaCl 2を、1mMのMgSO 4を、5 mMのHEPES（pHは7.8）、2.5 mMの炭酸水素ナトリウム3。 </li><li> 1X MBSで3％フィコールを準備します。 </li><li> 110のNaCl、2 mMの塩化カリウム、1mMのカルシウム（NO 3）2、1mMのMgSO 4を、0.1mMのEDTA、1 mMの炭酸水素ナトリウム、2 mMののNa 3 PO 4、pHが7.4：1×NAMを準備します。 </li></ol></li><li>用溶液中カエルを配置することによって、0.1×MBSにおけるエチル3-アミノベンゾエートメタンスルホン酸塩（MS222）（第1 Lの0.1×MBSで希釈し、次いで、10 mlの95％エタノール中に0.3グラムのMS222を溶解）の0.03％溶液中で雌を麻酔10から15分、または応答しなくなるまで。 <ol><li>その麻酔を確認することは、（不完全麻酔下のカエルは、手足を動かしたり身体を裏返し）応答しない保証するために、その背面に麻酔をかけたカエルを回して完了です。 </li></ol></li><li>外科鉗子で卵巣組織を単離し、メスの刃で肌と体壁を通って腹部切開を行うことによって、卵巣断片を単離はさみ。 OR2-に卵巣の断片を置きます。 24ミリメートル湾曲した針に3-0絹縫合糸で体​​壁を閉じて、同じ縫合で別々に皮膚を閉じます。水に1グラム/ Lの水族館塩中の女性の回復を許可します。 </li><li> （ - 20卵母細胞10）個、新鮮なOR2-への転送細かい鉗子を使用して、小さなに卵巣組織を引き裂きます。 </li><li> 、1時間シェーカー上で穏やかに攪拌新鮮なコラゲナーゼに転送し、さらに1時間攪拌することによりOR2-で2.0 mg / mlのコラゲナーゼAのDefolliculate卵巣断片。 </li><li>ウォッシュは、より小さな卵母細胞を捨てるOR2での[Ca ++ / Mg ++をを含む ] 10回、卵母細胞。 </li><li> OCMで卵母細胞を2回洗浄し、新鮮なOCMへの転送。目視検査時に大きさによって第6期の卵母細胞を分離し、未成熟な（小さい）卵母細胞を捨てる：第6期の卵母細胞は、動物半球であっても色素沈着と未成熟卵母細胞よりも大きく、直径が約1.2〜1.4ミリメートルです。 </li><li> 20℃のI - 18に卵母細胞を維持nは注射前にOCM。注：アガロースでコーティングされたペトリ皿を皿に卵母細胞の付着を最小限にするために使用されてもよいです。 </li></ol>図書館転写物の2注入<ol><li> （例えば、神経板ステージ14 10）開発の適切な段階で抽出したRNAを用いた指向性cDNAライブラリー15を準備します。 cDNAライブラリーを購入するか、以下の4つのステップで概要につき市販のキットを使用して1つを構築します。 <ol><li>ポリ（A）+ RNA（材料の表を参照）を濃縮するために製品を使用し、製造業者の指示に従って、約5μgのmRNAを分離してください。注：cDNAライブラリーを作製するために使用される転写物が（所望の組織の顕微解剖以下のような神経板など）の誘導組織に限定することができる、または特定の段階で胚全体からのものであってもよいです。 </li><li>製造業者の指示に従って、市販のキットを用いてcDNAを生成します。 </li><li> vectoに約20 ngのcDNAをを連結rは、市販のキットまたは他の適当なベクターに含まれています。適当なプラスミドベクターは、5 &#39;βグロビンおよび3のポリ（A）配列（PCS2 +、pTnT、pCS105）などのmRNA安定性のための配列を含みます。 </li><li>熱ショック形質転換のために、供給業者の推奨するプロトコルを使用して有能な細菌細胞へのライゲーションを変換します。 注：また、オープンリーディングフレーム（ORFeome）クローンの回収は、商業的に入手可能であり、注射のための転写物を生成するために使用することができます。 </li></ol></li><li> 10 4複雑（4月10日から5月10日までの総複雑さ）に10 3のプラスミドの10のプールを準備します。万コロニー各 - これは、千と10のプレートを表しています。 <ol><li> 37℃で18時間、および7ミリリットルLBのガラススプレッダーと穏やかな圧力によってそれぞれのコロニーを収集 - プレートライブラリ文化10 15 cmのLB-アンピシリンプレート上に、12を成長させます</li><li> 0.5ミリリットルからグリセロールストックを準備します（-20＆で0.2 mlの滅菌グリセロールおよびストアに追加＃730; C）、製造者の指示に従って、標準的な市販のDNAミニプレップキットを用いてDNAを調製するために、残りの6.5ミリリットルを使用しています。 </li></ol></li><li> 1.5時間-酵素1 37℃で16を消化し ​​、適切な制限付き- （2.0μgの1.0）プールされたプラスミドDNAを線形化。使用されるRNAポリメラーゼキットの仕様に水にエタノール沈殿および再懸濁が続くフェノール/クロロホルム抽出と直線化DNAを単離します。製造業者の指示以下の市販のRNAポリメラーゼキットとセンスRNAを合成します。 </li><li>約20μmの直径の（ガラスキャピラリーチューブと針プラーを使用して）マイクロインジェクション用の針を準備します。較正済み接眼マイクロメータとの複合顕微鏡の針の先端を測定します。注：ニードルプラーの設定が細かい鉗子で壊れたときに所望のチップサイズを生成するように細かいチップで針を製造するために経験的に決定されなければなりません。 </li><li>準備（に粘土を押してくださいマイクロインジェクションの間に所定の位置に卵母細胞を保持するための平行溝と皿の底に均一な層）粘土で内張り35×10ミリメートルペトリ皿。炎で先端に融合したショッピングモールプローブまたはパスツールピペットで溝を作ります。粘土の代替として、エラストマー金型17とのくぼみを作 ​​るアガロース料理を準備します。粘土が並ぶ料理の行で1X MBSで3％フィコール（約2ミリリットル）に広口径ピペットで転送卵母細胞。 </li><li>マイクロインジェクターを用いて、1 ngの/ NL RNAと針を記入し、（卵母細胞の細胞質のアップ描画防ぐために）わずかな正の圧力を生成するためにバランスを調整します。 </li><li>赤道域で約20 NL RNAを卵母細胞に注入します。その後、フィコール-MBSに残る1X MBSに優しく転送するために注入した卵母細胞のための1時間を許可します。アニマルキャップアッセイの前に20℃で24時間 - 8インキュベートします。 </li></ol> 3.アニマルキャップアッセイ<ol><li> 3/4倍NAMを準備し、細かい鉗子、ヘアループ、湾曲したカバースリップフラグメント、粘土ライニングDISを得ます卵母細胞を保持するカップ状のくぼみとHES。 （ - 2ミリメートル×2 - 約1〜4 mm）の小さな断片にカバーガラスを離れて壊すことにより、湾曲したカバースリップフラグメントを作成し、エッジポリッシュまで炎を通過すると垂れ、湾曲した部分を生成します。 </li><li> Xを肥やしますアフリカツメガエルの卵のin vitroまたは自然交配やステージ原腸する培養による18 -前段階でソートするに0.1X MBS中（10室温で11時間後に受精を）。 10の胚-ミッド原腸胚（11.5ステージ11）を収集。 </li><li> NAM 3/4倍で、ハーフ、フル約ペトリ皿に胚を移します。細かい鉗子の二組を使用して、原腸胚から受精（卵黄）膜を除去します。 </li><li>粘土が並ぶ皿でNAM（約2ミリリットル）3/4倍に転送する卵母細胞との溝は上述したように、個々の胚に対応するために、感想を生産、粘土の個々の印象に固定化します。 </li><li>移植胚粘土が並ぶお料理にとgオフアニマルキャップをカット微細鉗子の二組を使用してastrulae。だけではなく、赤道組織18アニマルキャップ外胚葉を分離するように注意してください。 </li><li>卵母細胞を接触させることをアニマルキャップの内面と各卵母細胞の動物半球上のアニマルキャップを置きます。 8時間以上 - 6のための卵母細胞の表面に露出した内部層に開いたままにすることができます（カバースリップの連絡先などの動物のキャップを粘土を外胚葉を平坦化、湾曲したガラスカバースリップフラグメントを塗布し、ガラスに下向きの圧力を加えることによって組換え体を一緒にホールド）。 注意：別の方法として、その内面を上に向けて、粘土のインデントにアニマルキャップを配置し、キャップに卵母細胞を置きます。粘土の小さな拡張子の組換え体を固定します。 </li><li> 20℃での培養制御胚がアッセイに所望の段階に達するまで。 </li><li>カバーガラス/粘土を除去し、鉗子とヘアループと外胚葉を単離することにより、組換えセパレート。 </li><li> MEMFAで1時間（3.8％のため、外胚葉断片を修正MEM中のホルムアルデヒド[0.1 M MOPS pHは7.4、2 mMのEGTA、および1mMのMgSO 4]）。 </li><li> -20℃でエタノールとストアにMEMFAからの断片（およびコントロール胚）を転送します。 </li></ol> in situハイブリダイゼーション （ISH） ではにより外胚葉における応答の解析4。 <ol><li> ISHのためのソリューションを準備します。 <ol><li>準備し、1×PBS：0.01Mのリン酸緩衝生理食塩水、塩化ナトリウム0.138 M、pH7.4の</li><li>準備をPBS-Tweenで（PTW）：1×PBS、0.1％のTween-20 </li><li> 2％BSA、2％のポリビニルピロリドン、2％フィコール：100×デンハルト溶液を調製します</li><li>ハイブリダイゼーションバッファーを準備します：50％ホルムアミド、5×SSC、1 mg / mlのトルラ酵母RNA、1 / mlのヘパリン、1×デンハルト液、0.1％Tween-20を、0.1％CHAPS、10mMのEDTA、DEPC-H 2 Oを</li><li> 100 mMのマレイン酸、150mMのNaCl、pHが7.5：マレイン酸バッファー（MAB）を準備</li><li>準備MAB +ブロック：MAB、2％ブロッキング試薬（溶解する60℃の熱） </li><li>準備アルカリホスファターゼ（AP）緩衝液：100mMトリスpHは9.5、50のMgCl 2、100mMのNaCl、0.1％トゥイーン、のdH 2 O </li></ol></li><li> RNAプローブを準備します。 <ol><li> 1.5mlチューブ（50μlの反応）に追加、商業RNAポリメラーゼキットを使用し、ミックスのNTP掘る：25.5μlのDEPC-H 2 O、10μlの5X転写バッファー、2.5μlの10倍DIG-NTPミックス、5μlの100 mMのDTT、2μLのRNAsin、2μlの直線化DNAテンプレート（〜を1μg/μl）を、3μlのRNAポリメラーゼと90分間37℃でインキュベートします。 </li><li> 2μlのRNAポリメラーゼを加え、60分間37℃でインキュベートします。 </li><li> 1％アガロースゲル上での反応の2μLを確認してください。 </li><li> 1μlのRQ1 RNaseフリーのDNaseを追加し、20分間37℃でインキュベートします。 </li><li> 50μlのDEPC-H 2 O、25μlの10 M酢酸アンモニウムおよび313μlのエタノールを添加することによって、プローブを沈殿させます。 -20℃で一晩（O / N）で保存し、その後20分間13,800×gで遠心分離することによりRNAを回収します。簡単にスピンし、500μlの75％エタノールで洗浄し、削除しますエタノール、空気乾燥さペレットを許します。 50μlのDEPC-H 2 Oを追加</li><li> 〜0.5μgの/μlの最終濃度になるようにハイブリダイゼーションバッファーを追加します。 </li></ol></li><li>ハイブリダイゼーションのために組織を準備します。特に断りのない限り、説明した各溶液交換（約4ml）でトップにバイアルを埋めます。 <ol><li>水平ロッカー上、10分ごとに75％エタノール/ PTW、その後、50％エタノール/ PTWにバイアルおよび移植胚からエタノールを除去します。 </li><li>ロッカーに各5分間PTWで3回洗浄します。 </li><li> 10μgのPTWで/μlのプロテ​​イナーゼK処理に移します。垂直ロックチューブ15分。 </li><li>垂直ロックチューブ - 0.1 MトリエタノールアミンpHは7.8で10分間2回ずつ洗浄します。 </li><li>チューブに12.5μLに無水酢酸を加え、垂直方向に5分を揺すります。 5分間の追加の12.5μlの無水酢酸で繰り返します。 </li><li>ロッカーに縦PTW 5分で洗浄します。 </li><li>ロッカーに4％パラホルムアルデヒド20分でREFIX。ヒートハイブリダイゼーションバッファー60℃に。 </li><li>ロッカーに各5分間PTWで3回洗浄します。 </li><li>各チューブからPTWのすべてが、〜1ミリリットルを削除し、250μlのHybをバッファに追加します。穏やかに混合する管を渦巻きます。垂直ロックチューブ5分。 </li><li> 60℃Hybをバッファー（0.5ml）で交換し、60℃10分で静かに攪拌します。新鮮なHybを緩衝液で交換して、60℃2〜4時間で攪拌します。 </li><li> 60℃（3分）にヒートプローブ（Hybをバッファー中の0.5μg/μlので1ミリリットル）。 Hybを緩衝液を除去し、チューブにプローブを追加します。 O / Nは、60℃で穏やかに撹拌します。 </li></ol></li><li>抗体のための組織を準備します。 <ol><li>暖かいHybをバッファと、2×SSC + 0.1％Tween-20を60℃にソリューションを提供しています。 </li><li> Hybをバッファ（ - 3X再利用2、-20℃のプローブを保存）とプローブ溶液を交換してください。 10分間60℃で洗浄します。 </li><li> 2X SSC-Tween中60℃（20分攪拌しながら、それぞれ）で3回洗浄します。 </li><li> 0.2X SSC-Tween中60℃（20分攪拌しながら、それぞれ）で3回洗浄します。 </li><li>ロッカーにそれぞれ水平に15分間（RT）MABで2回洗浄します。 </li><li> 1ミリリットルのMAB +ブロックを追加します。ロッカーの上に縦に2時間を洗ってください。 </li><li> 1ミリリットルのMAB + 1 / 2,000の抗ジゴキシゲニンAPを含むブロックに転送します。 4 CO / Nで垂直方向にロック。 </li></ol></li><li>色試薬のために組織を準備します。 <ol><li> MABと抗体溶液を交換してください。ロッカーにそれぞれ水平にMAB 5分間で3回洗浄します。 </li><li>ロッカーにそれぞれ水平にMAB 1時間で3回洗浄します。 </li><li>ロッカー上の各水平APバッファ10分間で2回洗浄します。 </li><li>複数のウェルプラスチックトレーに組織を転送し、APのバッファを削除し、BMパープル試薬（〜1ミリリットル）を追加します。反応は、O / Nに暗い5分で進行させます。 </li><li>適切な染色が達成されると、PTWのバイアルに組織を移します。ロッカー上PTWで2回各々10分間洗浄します。 </li><li>ロッカーの4 CO / Nでブアン液中で固定してください。 </li><li> RTで3 70％エタノール/ 30％PTW洗浄でブアンを洗浄します。トンを続行Oイメージ落射顕微鏡に取り付けられたカメラを使用してキャプチャ、漂白に必要な18の場合。 </li></ol></li></ol> 5.兄妹の選択およびクローニング<ol><li>最も高い活性（外胚葉組織の最大の応答）とプールを選択します。 </li><li> （上記のプロトコルにセクション2を使用して）前のステップからのコロニーを、最も高い活性を有するプールのグリセロールストックを（適切な密度にLBで希釈）と、10分の1程度で新たに10のプレートをプレートアウト滴定します。 </li><li>活動が単一コロニーにトレースされるまで、プールのサイズを減らします。 </li><li>ベクター標準プライマーを用いてDNA配列を得ます。 </li></ol>

<ol><li>Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+Genetic+Screens+in+Xenopus.+Using+Transposon-Mediated+Insertional+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).</li>
<li>Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+tropicalis.+as+a+Model+Organism+for+Genetics+and+Genomics%3A+Past%2C+Present+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).</li>
<li>Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+Efficient+CRISPR%2FCas9-Mediated+Targeted+Mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51, 835-843 (2013).</li>
<li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis.</a> Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+Genetic+Studies+Using+Antisense+Morpholino+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).</li>
<li>Smith, W., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injected+Xwnt-8.+RNA+acts+early+in+Xenopus.+embryos+to+promote+formation+of+a+vegetal+dorsalizing+center%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center.</a> Cell. 67, 753-765 (1991).</li>
<li>Smith, W., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+noggin.%2C+a+new+dorsalizing+factor+localized+in+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li>
<li>Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+stages+of+induction+of+anterior+head+ectodermal+properties+in+Xenopus.+embryos+are+mediated+by+transcriptional+cofactor+ldb1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1.</a> Developmental Dynamics. 243 (12), 1606-1618 (2014).</li>
<li>Servetnick, M., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+neural+and+lens+competence+in+Xenopus.+ectoderm%3A+evidence+for+an+autonomous+developmental+timer%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer.</a> Development. 112, 177-188 (1991).</li>
<li>Nieuwkoop, P., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+P+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).</li>
<li>Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+Siamois.%2C+a+Xenopus.+homeobox+gene+expressed+in+dorsal-vegetal+cells+of+blastulae+and+able+to+induce+a+complete+secondary+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis.</a> Cell. 81, 85-94 (1995).</li>
<li>Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+a+Xenopus+T.-related+gene+%28Xombi.%29+involved+in+mesodermal+patterning+and+blastopore+lip+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation.</a> Development. 122, 4001-4012 (1996).</li>
<li>Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus.+dorsalizing+factor+Gremlin+identifies+a+novel+family+of+secreted+proteins+that+antagonize+BMP+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities.</a> Molecular Cell. 1 (5), 673-683 (1998).</li>
<li>Lustig, K., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+oocyte+expression+assay+to+reconstitute+inductive+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> JoVE Science Education Database. , (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Restriction+Enzyme+Digests%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> JoVE Science Education Database. , (2015).</li>
<li>Viczian, A., Zuber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Determination+Using+the+Animal+Cap+Transplant+%28ACT%29+Assay+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis.</a> J. Vis. Exp. (39), e1932(2010).</li>
<li>Sive, H., Grainger, R., Harland, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+H+%22Early+development+of.Xenopus+laevis.%3A+A+laboratory+manual%22">Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor. New York. (2000).</li>
<li>Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+activation+during+early+stages+of+lens+induction+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus.</a> Development. 125, 3509-3519 (1998).</li>
<li>Medina-Martinez, O., Jamrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxe+view+of+lens+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Foxe view of lens development and disease.</a> Development. 134, 1455-1463 (2007).</li>
<li>Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+in+the+tetraploid+Xenopus.laevis.+enables+genome-wide+insight+in+a+classic+developmental+biology+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism.</a> Methods. 66, 398-409 (2014).</li>
<li>Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+large+set+of+full-length+clones+from+a+Xenopus+tropicalis+EST+project%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project.</a> Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).</li>
<li>Karpinka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%2C+the+Xenopus.+model+organism+database%3B+new+virtualized+system%2C+data+types+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).</li>
<li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+Genome-Wide+In+Vivo+Screen+Identifies+New+Regulators+of+Signaling+Pathways+during+Early+Xenopus+Embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis.</a> PLoS ONE. , e79469(2013).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

コンピテント外胚葉における応答を誘導することができる遺伝子の機能的クローニングのためにここに記載された方法は、遺伝子産物の広い範囲を同定することができます。この方法は、発現クローニング技術と組織誘導のアッセイを組み合わせることにより、過去の作品を発展させ。我々は、RNA注入後、直接的または間接的に、誘導因子の産生の供給源としてアフリカツメガエル卵母細胞の代謝経路を利用します。これ、cDNAライブラリーまたはクローンの他のコレクションから生成された転写物の発現を用いて目的6,7の遺伝子をクローニングするための確立された方法の使用と組み合わせて、胚に関わる新たな関心の遺伝子を同定するために求める人々のための貴重なアプローチを提供誘導。新しい遺伝子の機能同定にこの方法の広範な適用は、エキサイティングな新しい逆遺伝学的アプローチに便利な補完であり、また高THRを使用して同定された試験転写物を機能的にするために使用することができます（例えば、RNA-seqのような）oughput法21。 コントロールは、キャップアッセイで使用した...

機能喪失を通じて関心のある遺伝子を特定するための前方遺伝学的アプローチは、発生における複雑なパターン形成イベントを理解するための不可欠な部分です。 ますます拡大するシステムや研究者3-5が利用できる強力なリバースジェネティック技術と組み合わせることで、パスウェイで重要な機能的役割を果たす遺伝子を特定し、その機能を細胞レベルで、また他の遺伝子産物と相互作用して解明することが可能になりました。 過去に多くの重要な発見をもたらした目的の遺伝子を機能的に同定するための1つのアプローチは、発現クローニング6,7です。
私たちの最近の目的8は、脊椎動物の水晶体誘導プロセスの最初のステップが原腸期の早い段階で発生することが実証されているため、初期の水晶体誘導因子を特定することでした。 そのために、Xenopus胚の一過性のレンズコンピテント9動物キャップ外胚葉(ステージ11-11.510)を誘導の応答組織として使用し、ステージVIのXenopus卵子を誘導因子の産生源として使用しました。
次のプロトコルは、Smith and Harland6,7の発現クローニングとsib選択プロトコルに基づいており、他の11-13でも成功裏に使用されています。 私たちの卵子発現システム(LustigとKirschnerによる誘導因子の産生に最初に利用された14)では、直接的または間接的に卵子に動物キャップ外胚葉のレンズ誘導応答を誘発する因子を産生させることができる注入された転写産物のプールが選択され、同定されます。 このシステムは、分泌誘導分子を直接発現するのに有用であるため(卵子注入されたINHBB mRNAは、中胚葉コンピテント動物外胚葉8で中胚葉誘導を引き起こします)、当初、スクリーニング手順は主にパラクリン因子の同定に役立つと期待していました。 しかし、私たちのスクリーニングで核因子を同定した(ldb18)ことから、転写または翻訳調節因子、miRNA、補因子、ジャクスタクリン因子など、さまざまな分子を同定するためにこのシステムを使用できることが明らかになりました。

<table><tbody><tr><td>12/101 抗体</td><td>開発研究 ハイブリドーマバンク</td><td>12/101</td><td>モノクローナル抗体 筋肉組織検出用</td></tr><tr><td>20x SSC バッファー</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td>ISH</td></tr> 無<tr><td>水酢酸</td><td>Sigma</td><td>A6404</td><td>ISH</td></tr><tr><td>Anti-Dig-AP</td><td>ロシュ</td><td>11093274910 ISH</td><td></td></tr><tr><td>Aurum プラスミド ミニキット</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6400</td><td>プラスミドDNA精製</td></tr><tr>ブロッキング<td>試薬</td><td>ロシュ</td><td>11096176001</td><td>ISH</td></tr><tr><td>BM パープル</td><td>ロシュ</td>用 <td>11442074001</td><td>ISH</td></tr><tr><td>Boekel ハイブリダイゼーション オーブン</td>用 <td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>13-245-121</td><td>ISH</td></tr><tr><td>ブインの溶液</td><td>用 シグマ</td><td>HT10132</td><td>ISH</td></tr><tr><td>BSA</td><td>シグマ</td><td>A9647</td><td>OCM</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>シグマ</td><td>C3023</td><td>ISHの場合</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ A</td><td>ロシュ</td><td>10103578001</td><td>卵母細胞の脱毛</td></tr><tr><td>システイン</td><td>シグマ</td><td>C121800</td><td>デゼリー胚</td></tr><tr><td>DEPC-H2O</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP5611</td><td>ISH</td></tr><tr>用<td>Dig-RNA ラベリングミックス</td><td>ロシュ</td><td>11277073910</td><td>ISH プローブ用</td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子</td><td>ワールド プレシジョン</td><td>500233</td><td>ビテリン エンベロープ用除去</td></tr><tr><td>エチル 3-アミノ安息香酸</td><td>シグマ</td><td>A5040</td><td>MS222 麻酔薬</td></tr><tr><td>フィコール PM 400</td><td>シグマ</td><td>F4375</td><td>注射剤用</td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>シグマ</td><td>F9037</td> ISH<td>用</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン硫酸塩</td><td>シグマ</td><td>G1914</td><td>OCM</td></tr><tr><td>用 ガラス毛細血管</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ</td><td>4878</td><td>3.5インチ 長さ、I,D、0.530 mm</td></tr><tr><td>ガラスサンプルバイアル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>06-408B</td><td>ISH</td></tr><tr><td>用 ヘアループ</td><td></td><td></td><td>パスツールピペットに貼られた髪 組織操作用</td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td>H4784</td><td>ISH</td></tr><tr><td>インジェクター用 ナノリットル 2010</td>年 <td>ワールド精密機器</td><td>ナノリットル 2010</td>年 <td>マイクロプロセッサ制御マイクロインジェクター</td></tr><tr><td>インスタントオーシャン</td><td>カロライナ</td><td>972433</td><td>水族館 カエルの回復のための塩</td></tr><tr><td>IRBG XGC Xenopus 検証済み 全長カム cDNA</td><td>ソース バイオサイエンス</td><td>989_IRBG</td><td>cDNA ライブラリ&nbsp;</td></tr><tr><td>LB寒天プレート、100&マイクロ;g/ml アンピシリン</td><td>テクノバ</td><td>L5004</td><td>150 mm 注入済み LB-Amp プレート シブ選択用</td></tr><tr><td>LB ルリアブロス</td><td>テクノバ</td><td>L8650</td><td>LB シブのコロニーを採取するためのプレート選択と培養液の希釈</td></tr><tr><td>磁気 mRNA アイソキット</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>S1550S</td><td>ポリ(A)濃縮 RNA の単離用</td></tr><tr><td>マレイン酸</td><td>シグマ</td><td>M0375</td><td>ISH用</td></tr><tr><td>手動マイクロフィルマイクロマニピュレーター</td><td>ワールド精密機器</td><td>M3310R</td><td>手動マイクロマニピュレーター</td></tr><tr><td>ニューティングミキサー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-363-152</td><td>ISH用ロッカー</td></tr><tr><td>パーモプラスト</td><td>ナスコ</td><td>SB33495M</td><td>注射および解剖皿用粘土</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td></td><td>P5368</td><td>ISH</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>用シグマ</td><td>G4877</td><td>卵子の発達を刺激する</td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン</td><td>ΣPVP40</td><td>ISH</td><td></td></tr><tr><td>プログラマブルプーラー</td><td>ワールド精密機器用</td><td>PUL-1000</td><td>マイクロピペット ニードルプーラー</td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>Σ</td><td>P6556</td><td>ISH</td></tr><tr><td>pTnT用 ベクター</td><td>Promega</td><td>L5610</td><td>cDNA ライブラリ構築</td></tr><tr><td>リボプローブ コンビネーションシステム</td><td>Promega</td><td>P1450</td><td>in vitro転写</td></tr><tr><td>上付き文字 全長cDNAライブラリ構築キット</td><td>Life Technologies</td><td>18248013</td><td>キット cDNAライブラリ構築用</td></tr><tr><td>縫合糸、3-0シルク</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>19-037-516</td><td>卵子除去後のための縫合糸と針</td></tr><tr><td>トルラ RNA</td><td>Sigma</td><td>R3629</td><td>ISH用</td></tr><tr><td>トリエタノールアミン</td><td></td><td>ΣT1502</td> ISH<td>用</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>for ISH</td></tr><tr><td>Universal RiboClone cDNA Synthesis System</td><td>Promega</td><td>C4360</td><td>alternative kit for cDNA library construction</td></tr><tr><td>Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration</td><td>Source Bioscience</td><td>5055_XenORFeome</td><td>ORFeome Clones</td></tr><tr><td>XL2-Blue Ultracompetent Cells</td><td>Agilent Technologies</td><td>200150</td><td>cells for transformation of cDNA図書館</td></tr></tbody></table>

用いた機能クローニング<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;卵母細胞発現システム

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

胚の誘導に関与する遺伝子の同定は、多くの課題を提起します。いくつか例を挙げると、目的の分泌された分子は存在量が少ないか、分泌されずにシグナル伝達細胞につながれているかもしれません、または結合パートナーや上流の調節分子の存在を必要とするかもしれません。したがって、コンピテントエクトダームにおける初期のレンズ誘導応答を誘発できる遺伝子産物の探索において、パラクリン因子またはジャクスタクリン因子、ならびに転写タンパク質またはその他の調節タンパク質の同定を可能にする発現クローニングシステムを利用しました。mRNAのプールをXenopus卵子に注入し、応答組織を卵子に直接配置して共培養しました。レンズコンピテント動物キャップ外胚葉における初期のレンズプラコードマーカーfoxe3の発現を誘発する能力に基づいて、神経プレートステージのcDNAライブラリーからldb1の機能的クローニングを行った後、mRNA発現パターンを特徴付け、ldb1の過剰発現またはノックダウン後の発生進行を分析しました.このシステムは、コンピテント組織における機能的応答を用いてインデューサーまたはその上流の調節分子の同定が求められる非常に幅広い状況に適しています。

mRNAの発現に応答して、卵母細胞に注入し、応答動物キャップ組織は、in situハイブリダイゼーション （ 図2および表1）によってOTX2の発現についてアッセイした。OTX2、レンズプラコードを介して神経管閉鎖の推定レンズ外胚葉（PLE）で表され肥厚19。 OTX2も PLE外側前方神経外胚葉ならびに非神経外胚葉ヘッドで表現されているのでしかし、それは神経とplacodal応答の両方に関連付けられています。 foxe3は神経板からPLEで発現されるのでfoxe3の使用は、発現クローニングの目的に、より具体的なアプローチを可能にしたレンズコンピテント動物キャップ外胚葉におけるレンズ誘導応答を産生することができる遺伝子産物のためのライブラリーをスクリーニングします隣接placodal領域に存在するが、neuroectoder欠席ステージとレンズの小胞形成20を通して、<html>メートル...

私たちは、有能な外胚葉で応答を誘発することができる遺伝子の発現クローニングのためのXenopus卵子と動物キャップシステムについて説明し、そのような遺伝子のその後の解析技術について議論します。このシステムは、幅広い遺伝子産物の機能同定に役立ちます。

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

本手順の全体的な目的は、受容能を持つ外胚葉において反応を誘導できる遺伝子産物を同定することに適した、アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞およびアニマルキャップ系を実証することです。この手法は、誘導反応を引き起こすためにどのような遺伝子が必要かという、発生生物学分野における重要な疑問への回答に寄与します。本手法の主な利点は、発現系としてXenopus卵母細胞を用いることで、標的組織に作用する誘導因子、あるいは誘導因子のさらに上流で作用する遺伝子を産生し、同定できる点にあります。解剖および組み換えのステップはステージに強く依存し、洗練された技術を要するため、本手法を視覚的に提示することは非常に有用です。麻酔をかけたメスのカエルの卵巣組織を採取した後、組織を1片あたり約10〜20個の卵母細胞を含む小さな断片にちぎります。これらの断片を、まず新鮮なOR2溶液に、次に2.0 mg/mLのcollagenase Aを含むOR2溶液に移します。続いて、組織を含む混合液をシェーカーで1時間、緩やかに攪拌します。次に、断片を新しいコラゲナーゼ溶液に移し、さらに1時間攪拌します。この処理の終了時に、凝集が解消された卵母細胞が観察されるはずです。続いて、卵母細胞を完全OR2で10回洗浄し、その後、OCMと略記される卵母細胞培養培地で2回洗浄します。その後、卵母細胞を新鮮なOCMに移し、解剖顕微鏡下で視覚的に検査します。より小さく未成熟な卵母細胞を除去することで、ステージ6のものを分離します。次に、卵母細胞をOCMを含むアガロースコートしたペトリ皿に入れ、注入まで18〜20 °Cで保持します。マイクロインジェクションの準備として、ガラスキャピラリーチューブをニードルプラーにセットして延伸させ、その後、ガラスの先端を折り取って直径約20 µmのニードルを作成します。複合顕微鏡を用い、校正済みの接眼ミクロメーターでニードルの先端を測定します。次に、35 × 10 mmのペトリ皿の底にクレイを均一な層になるように押し付けます。次に、小さなプローブのようなツールを使用して、この層に平行な溝を作成します。粘土を敷いたディッシュに、1x修正Barth塩類溶液（MBS）で調製した3%Ficollを約2 milliliters満たします。その後、広口ピペットを用いて卵母細胞をそこへ移します。その後のマイクロインジェクション中に固定されるよう、卵母細胞を溝に配置します。マイクロインジェクターを用いて、あらかじめ調製したmRNAプールを約2 µL針に充填し、注入中に卵母細胞の細胞質が針内に吸引されるのを防ぐため、わずかな正圧がかかるようバランスを調整します。その後、各卵母細胞の赤道領域に20 nLのRNAを注入します。その後、卵母細胞をFicoll MBSに1時間静置し、慎重に1x MBSへ移します。続いて、卵母細胞を20°Cで8〜24時間インキュベートします。アニマルキャップアッセイを開始するために、3/4x normal amphibian medium（略称：NAM溶液）、精密ピンセット、ヘアループ、事前に注入済みの卵母細胞、およびステージ11〜11.5のゼノパス胚を用意します。次に、ガラスカバースリップを約1 mm × 2 mmのサイズの破片に砕き、端が研磨され丸くなるまで炎にかざします。続いて、前述の方法に従い、ディッシュの中に粘土を単層に押し付けます。そして、小型のプローブを用いて、このコーティングの中にカップ状の個別の圧痕を作成します。ディッシュに約2 mLの3/4x NAMを満たします。そこに注射済みの卵細胞を移し、それぞれの卵細胞が1つの窪みの中で固定されるように配置します。胚を準備するために、それらを3/4x NAM溶液の入ったディッシュに移します。外胚葉の齢を確認するためのステージングコントロールとして使用する原腸胚を一部選び、同じ溶液が入った別のディッシュに移動させます。そして、このプレートを脇に置いておきます。動物極キャップアッセイに使用する胚については、2組の微小ピンセットを用いて卵黄膜を除去します。その後、原胃胚を卵母細胞が入った粘土敷きのディッシュに移します。まず、2組の精密ピンセットを用いて、赤道域の組織を避けるように注意しながら、胚から動物極キャップを切り出します。第1の方法を用いて組み換え体を作成するには、あらかじめくぼみに配置した卵母細胞の動物極半球に、動物極キャップの内面が接触するように配置します。この工程を、注入した複数の卵母細胞に対して繰り返します。これらの組み換え体を固定させるため、それぞれの卵母細胞の上に湾曲したガラスカバースリップの破片を置き、動物極が平らになり、カバースリップが粘土に接触するまで下方に圧力をかけます。2番目の方法で組み換え体を生成するには、動物極キャップと卵母細胞を粘土の個別の空の窪みに一緒に配置します。そして、アニマルキャップの内側が卵細胞に向くようにしてください。次に、粘土の小さな断片を用いて、2つの組織を固定します。どちらの方法においても、複数の組換え体が作成できたら、それらと別途用意した対照胚を20 °Cで培養してください。コントロール胚が目的のステージに達したら、組換え胚からカバーガラスを取り外し、ピンセットとヘアループを用いて動物極外胚葉を分離します。続いて、外胚葉断片とコントロール胚の両方をMEMFAで1時間固定します。その後、それらをエタノールに移し、この組織を-20°Cで保存します。ここでは、段階的に少なくなったクローンまたはコロニーに対応するmRNAプールを卵母細胞のセットに注入し、動物極キャップとともに培養しました。続いて、初期神経板段階から嚢胞形成にかけて presumptive lens ectoderm（レンズ原基外胚葉）で通常観察され、ここではレンズ誘導能を評価するために使用したマーカーであるfoxe3を発現している動物極キャップの数を、各セットで測定しました。この手法により、評価した動物極キャップの179個中50個（28%）でレンズ誘導反応を引き起こすことができる核因子コード遺伝子ldb1が同定されました。ここに示すin situハイブリダイゼーション像において、もおよそステージ11からステージ23までldb1注入卵母細胞と共に培養した動物極外胚葉（animal caps）に、矢印で示されるfoxe3シグナルが認められました。対照的に、未注入の卵母細胞上に配置したコントロールの動物極外胚葉では、foxe3の発現は見られませんでした。これらの動物極外胚葉から切片を作成したところ、内側および外側の外胚葉層の両方でfoxe3の発現が観察されました。内層での発現は水晶体反応の特徴です。あるいは、両方の層でシグナルが検出される場合は、嗅盤などの他の構造を示しています。この手順に従った後、免疫組織化学、in situ ハイブリダイゼーション、または蛍光レポーター遺伝子の直接検出などの手法を用いて、動物極外胚葉における誘導反応を評価することができます。

functional-cloning-using-a-xenopus-oocyte-expression-system

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

ここでは、の細胞質マイクロインジェクションを示しています...

アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクション

の受精アフリカツメガエル卵母細胞ホストの転送方式を使用して

アフリカツメガエル胚上皮は、上皮形態形成時の極性の開発と形状の変化などの細胞の挙動を研究する理想的なモデルシステムです。固定試料の伝統的な組織は、ますます生細胞の共焦点イメージングによって補完されています。ここでは、カエルの組織を分離し、生きた細胞の共焦点顕微鏡を使用して、ライブ上皮細胞とその細胞骨格を可視化する方法を示しています。...

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル</em

このビデオプロトコルは、トランスジェニックを生成する方法を示しています...

トランスジェニックの生産アフリカツメガエル制限酵素を介した統合と核移植によって

私たちは、Xenopus laevisの未熟卵子の操作方法、卵子の卵子へのin...

操作と<em&gt;インビトロ</emの&gt;成熟<em&gt;アフリカツメガエル</em細胞質内精子注入し&gt;卵母細胞、胚発生を研究するために

Xenopusの胚では、胚盤胞の屋根からの細胞は多能性であり、さまざまな組織を生成するようにプログラムすることができます。ここでは、両生類の胚盤胞の屋根外植片をアッセイシステムとして使用するプロトコルについて説明し、初期の神経発達の主要なin vivoおよびin...

幹細胞様<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するために<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

単一卵胞の単離、細胞質RNAマイクロインジェクション、周囲の細胞層の除去、およびXenopus卵子におけるタンパク質発現のための最適化された手順が説明されています。さらに、リガンド依存性イオンチャネルを用いた電気生理学的実験における迅速な溶液変化のための簡単な方法が提示されます。...

アフリカツメガエル卵母細胞：マイクロインジェクションのために最適化された方法、濾胞細胞層の除去、および電気生理学的実験における高速解法の変更

生存に不可欠な遺伝子突然変異系統を作成するための技術的なハードルをもたらします。リープフロッギング ゲノムの生殖細胞系突然変異を運ぶ野生型動物を作成する始原生殖細胞移植と編集を組み合わせることにより致死性を回避できます。リープフロッギング F1世代でホモの null...

アフリカツメガエルのリープフロッギング CRISPR/Cas9 ベースの始原生殖細胞の移植

携帯無料ツメガエル卵抽出液のマイクロエマル ジョンにおける細胞周期振動の再構成

この記事は、半クローン胚の構築のための精子の代わりにパルテノジェネティックハプロイド胚性幹細胞の使用を実証することを目的としています。...

マウスパルテノジェネティックハプロイド胚性幹細胞の精子代替としての応用

細胞の駆出や移植などの発生学的操作は、早期の発達を研究するための重要なツールです。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚でこれらの操作を行う簡単で効果的な移植装置を記述する。...

ゼブラフィッシュ胚の簡易かつ効果的な移植装置

学ぶXenopus卵母細胞とアニマルキャップシステムを用いた機能クローニング法。外胚葉への誘導応答を引き起こす遺伝子産物を同定し、発生生物学における遺伝子機能解析の強力なツールとして活用できます。

用いた機能クローニング

さらに動画を探す