0 閲覧数 • 3:44 分 • April 30th, 2023
- 白血病細胞を間葉系間質細胞と共培養すると、白血病細胞は間質細胞と相互作用し、3つの亜集団を形成します。自由に浮遊する浮遊細胞、間葉系単層の表面に付着する位相明るい細胞、および間葉系単層の下の位相薄暗い細胞。各亜集団を分離するには、間葉系間質細胞単層を有する組織培養プレートを採取します。
腫瘍特異的培養培地に存在する白血病細胞を単層に播種し、プレートを所望の期間インキュベートします。次に、自由に浮遊する細胞を別のチューブにピペッティングして、懸濁液中の腫瘍細胞を回収します。次に、新鮮な培地をプレートに加え、激しくピペットで動かして、間葉系単層表面から位相明るい腫瘍細胞を取り除きます。
これらの細胞を別のチューブにピペッティングして回収します。接着性間葉系細胞を除去するために、プレートにトリプシンを添加します。ウシ胎児血清(FBS)を添加して、トリプシンの作用を止め、細胞凝集体をバラバラにします。次に、位相薄暗い細胞をチューブに集めます。異なる細胞亜集団を含む3つのチューブすべてを個別に遠心分離し、ペレットを新鮮な培地に再懸濁してさらに分析します。次のプロトコルでは、2D共培養から懸濁液、phase-bright、およびphase-dim白血病細胞を単離します。
- 懸濁した腫瘍亜集団を採取するには、白血病細胞共培養プレートから培地を吸引し、同じ培地を使用してプレートを1回穏やかにすすいでください。次に、浮遊懸濁白血病細胞の亜集団を15ミリリットルの円錐管に移します。位相が明るい腫瘍亜集団を採取するには、10ミリリットルの新鮮な培地を共培養プレートに戻します
そして、接着性細胞単層を剥がすことなく付着性白血病細胞を除去するために、約5回ほど強力にすすぎます。次に、位相明るい亜集団をそれ自身の15ミリリットルの円錐管に移します。期薄暗い腫瘍亜集団を採取するには、1ミリリットルのPBSリンスで残りの培地を取り除き、摂氏37度で3ミリリットルのトリプシンで細胞を剥離します。
5分後、プレートの側面を軽くたたいて付着細胞を取り除き、続いて1ミリリットルのFBSを添加して酵素反応を停止します。次に、血清を3〜5回すすぎ、大きな細胞凝集体をバラバラにし、未精製の位相薄暗い亜集団を新しい15ミリリットルの円錐管に移します。すべての亜集団が収集されたら、細胞をスピンダウンし、各ペレットを1ミリリットルの予熱培地に再懸濁します。