サンプルおよび測定可能な残存病変と急性骨髄性白血病の白血病幹細胞を測定するプロセス骨髄に対する包括的なプロトコル

このプロトコルの全体的な目標は、急性骨髄性白血病患者の骨髄サンプルの正確な検査を行い、白血病幹細胞の定量化を含む測定可能な残存病変について検査することです。この方法は、急性骨髄性白血病患者の骨髄サンプルにおける測定可能な残存病変の正確な評価を提供できます。このアプローチの主な利点は、プロトコールを綿密に遵守することで、再現性の高い高品質の結果が得られることです。

この手法の意味は、治療に対する患者の反応の読み出しとして使用できるため、臨床上の意思決定にまで及びます。手順を実演するのは、血液学者のJeroen Janssen氏、診断血液学研究所の技術者であるGerrit Sijm氏、MRDチームの技術者であるJennifer Scheick氏とSander Snel氏です。患者を外側の褥瘡の位置に置いた状態で、上後腸骨棘をペンでマークし、目的の生検領域の皮膚をエタノール中の0.5〜1%クロルヘキシジンで外側に円を描くように消毒します。

局所麻酔薬を投与した後、近位端を手のひらに、人差し指を針の先端近くの金属シャフトの側面に当てて、15ゲージの2.8インチの針を手に取ります。穏やかでしっかりとした圧力を使用して、麻酔された皮膚を通って腸骨脊椎に向かって素早く交互に回内回外運動をしながら針を導入します。針が後腸骨棘に接触したら、スチレットを取り外し、空の10ミリリットルの注射器を針に取り付けます。

プランジャーを静かに引き抜き、最大10ミリリットルの骨髄棘が採取されるまで、シリンジ内に負圧を作り出します。血液希釈を避けるために、吸引液ごとに10ミルを超える骨髄を摂取しないでください。.シリンジを取り外し、スチレットを針に戻します。

次に、約2ミリリットルの骨髄を時計のガラスに排出し、ヘパリンでコーティングされた8ミリリットルのチューブに注入するのに十分なサンプルが採取されていることを確認し、すぐにチューブを反転させます。凝固を防ぐためには、骨髄が追加されたらすぐに抗凝固剤含有チューブを投資することが重要です。最適な形態学的評価を行うには、プラスチック製のヘラを使用して、時計のガラスの吸引物からスライドガラスに針状体を移し、骨髄の上に別のスライドガラスを慎重に滑らせます。

乾燥後、針状体をMay-Grunwald Gimsaで染色し、光学顕微鏡で分析します。骨髄チューブをプラスチック製のホルダーに入れ、周囲のゲルパックと記入済みのリクエストフォームと一緒にホルダーをプラスチック容器に入れます。フローサイトメトリーで骨髄を解析する前に、フローサイトメーターを起動し、フローサイトメトリー解析ソフトウェアを開いて、前方散乱光と側方散乱光のドットプロットで新しい実験を作成してください。

細胞のサイズと粒度を評価するには、健康なドナーから標識されていない溶解した末梢血細胞をロードし、Acquire Cells機能を選択します。リンパ球をゲートし、順散乱光と側方散乱光の電圧を調整して、ゲート細胞集団の適切な平均目標値に到達します。次に、少なくとも 10, 000 イベントのデータを取得します。

ターゲット蛍光チャネル光増倍管電圧を設定するには、まず、製造元の指示に従って8ピークのレインボービーズキャリブレーション粒子を使用して、低流量で10, 000のイベントを取得します。前方散乱対側散乱ドットプロットでシングレットビーズをゲートし、続いてFITC-PEドットプロットで7番目のピークをゲートします。得られたビーズ集団を各蛍光色素についてゲートします。

8ピークレインボービーズサスペンションの取得を続行し、製造元の指示に従って、すべての蛍光チャネルのPMT電圧を調整および微調整して、目標のMFI値に到達します。レコードを使用して、約 2, 000 イベントのデータを収集し、7 番目のピーク ビーズの MFI を確認します。次に、各実験用フロロクロム標識抗体を十分な量に加えて、対応する蛍光チューブ内のビーズから1つのコントロールを除いたものを染色し、チューブを完全にボルテックスします。

前方散乱のしきい値が5, 000に設定され、すべての蛍光色素の補正値がゼロであることに注意しながら、同じ補正パラメータで新しい空白の実験を作成します。コンペンセーションコントロールを作成するには、Create Compensation Control機能を選択し、未染色のコントロールチューブをロードします。シングレットビーズの母集団の周りのP1ゲートを調整し、P1ゲートにシングレットビーズのみが含まれていることを確認します。

P1 ゲートを右クリックし、[Apply to All Compensation Controls] を選択します。次に、標識された単一の蛍光チューブすべてについてデータを記録し、P2ゲートが各蛍光ヒストグラムの陽性集団を包含していることを確認します。フローサイトメトリー解析のために細胞を染色するには、骨髄を検査室に輸送し、リクエストフォームを確認して患者の研究番号と生年月日を確認し、何を染色する必要があるかを決定します。

MRDは、4本のチューブからなる染色パネルを使用します。ここでは、1本のチューブからなるLSCパネルの染色を示します。細胞数を数えた後、適切な量の骨髄を新しい15ミリリットルのチューブに移します。

実験細胞量の10倍で溶解バッファーを添加し、赤血球を溶解します。チューブを反転させて細胞を混合し、室温で10分間インキュベートします。溶解期間の終わりに、遠心分離によって細胞をペレット化します。

細胞を室温で15ミリリットルの洗浄バッファーに再懸濁し、遠心分離により細胞ペレットを再度回収します。その間、5ミリリットルのFACSチューブに適切な量の抗体カクテル溶液をピペットで入れてください。ここに示されているのは幹細胞チューブのパネルです。

ペレットを洗浄バッファーに再懸濁し、モノクローナル抗体カクテル溶液を含むFACSチューブに細胞の懸濁液を加えて、暗所で15分間インキュベートします。次に、細胞を洗浄バッファーで洗浄し、遠心分離により細胞をペレット化します。遠心分離後、ペレットを400マイクロリットルの新鮮な洗浄バッファーに再懸濁します。

白血病性幹細胞を解析するには、幹細胞抗体カクテルで染色した細胞懸濁液に4マイクロリットルのブランクビーズを加えます。次に、実験患者サンプルから少なくとも4倍10〜6番目のイベントを取得する前に設定されたパラメータを使用してサンプルを読み取ります。急性骨髄性白血病患者の約90%で観察された白血病関連免疫表現型を特定するには、ブラストゲートが図のように適切に設定されることが重要です。

ここでは、CD34陽性原始細胞に異なる種類の異常を有する個々の患者のデータの例を示す。これらのグラフでは、完全寛解を維持している患者と、導入療法の2サイクル目後に測定可能な残存病変陽性の結果が出た後に再発した患者を観察でき、サンプル分析の前に正確なゲート設定が必要であることが強調されています。LSCの同定と定量には、これらのグラフに示すように、特にCD34陽性CD38陰性芽球細胞の異常をさらに解析する必要があります。

このプロトコルを実行する際には、骨髄のサンプリング、輸送、実験作業、およびこの手順の分析ステップに専門のバックアップ担当者を配置することが非常に重要です。この手順は、特定の細胞集団と関心のある分子異常との相関に関する追加の質問に答えるために、または臨床転帰を予測するために患者のリスクグループを洗練するために、細胞遺伝学的および分子分析を実行するためにも使用できます。その開発後、この技術は、血液学の分野の研究者が治療後のAML患者の残存病変を調査する道を開きました。

このビデオを見れば、AML患者の骨髄サンプルの収集と輸送を含むフローサイトメトリーを使用して、残存病変を正確に特定し定量する方法を十分に理解できるはずです。