細胞骨格および焦点接着組織化アッセイ:免疫蛍光法による細胞接着および基質への拡散の研究

- 基質の形態は、がん細胞の挙動や転移反応に大きく影響します。アクチン細胞骨格の動的ネットワークは、細胞に構造的支持を提供し、細胞の動きを媒介します。焦点接着と呼ばれる大きな膜結合タンパク質複合体は、細胞骨格と細胞外マトリックスを結合し、細胞拡散を促進します。

染色を開始するには、がん細胞培養を行い、パラホルムアルデヒドで処理して細胞を固定し、透過処理します。次に、タンパク質を含むシグナルエンハンサー試薬で細胞をインキュベートし、バックグラウンド染色を減らすための細胞を調製します。焦点接着複合体内のタンパク質の1つであるビンキュリンに結合する抗ビンキュリン一次抗体を添加します。

次に、一次抗体を標的とする蛍光色素標識二次抗体とサンプルをインキュベートします。最後に、細胞骨格のアクチンフィラメントに選択的に結合する蛍光タグ付きファロイジンコンジュゲートで細胞を処理します。共焦点レーザー走査型顕微鏡で細胞を観察し、蛍光シグナルを研究します。

形態が良好に広がる細胞は、明確なアクチン繊維を示し、ビンキュリンを含む焦点接着が明確で細長いを示します。逆に、拡散が不十分な細胞は、明確なアクチンフィラメントを持たず、点状のビンキュリン含有焦点接着を示します。次のプロトコルでは、原発性結腸癌細胞の細胞骨格と焦点接着組織を研究するための免疫蛍光アッセイを示します。

- 免疫染色する基質を層流フードに取り、培地を取り出します。次に、基質をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすぎ、細胞をPBS中の4%パラホルムアルデヒドで室温で20分間固定します。基板をPBSで5分間、合計3回洗浄します。次に、基質を500マイクロリットルのシグナルエンハンサーで30分間インキュベートしてから、PBSですすぎます。

次に、モノクローナル抗ビンキュリン抗体とモノクローナル抗ビンキュリン抗体をPBSで1〜250希釈して室温で45分間インキュベートします。次に、基板をPBSで5分間、合計3回洗浄します。サンプルを二次抗体Alexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgGとPBSで1〜200希釈、室温で30分間インキュベートします。その後、基板をPBSで再度5分間、合計3回洗浄します。

F-アクチンの構造を可視化するには、テトラメチルローダミン-ファロイジンコンジュゲートと細胞を50μL/mLの濃度で室温で45分間インキュベートします。その後、前回と同様に基板を再度洗浄します。最後に、共焦点走査型レーザー顕微鏡を使用してサンプルのイメージングに進みます。