HIVとライブ共焦点顕微鏡の蛍光クローンを使用して、HIVの可視化細胞間伝達

この手順では、ライブセルイメージングを使用して、HIVを発現するジャークCAT T細胞と感染していない初代T細胞との間のウイルス学的シナプスを介したGFP標識HIVの移動を視覚化します。細胞間転写アッセイは、HIV Gagを発現するHIV Gagの感染性蛍光クローンであるHIV Gag IG FPをJerk CAT T細胞にトランスセクトすることから始まります。次に、IG FPをC-M-T-M-R標識未感染の初代T細胞と混合し、イメージングチャンバーにロードして、ウイルス学的シナプスを介したGFP標識HIVの転移を観察できます。

得られたデータは、画像解析ソフトウェアを使用して分析され、T細胞ウイルス学的シナプスを介したHIV転写の詳細が明らかになります。こんにちは、私の名前はベンジャミン・デールで、マウントサイナイ医科大学医学部のベン・チェン研究室に所属しています。私の名前はグレッグ・マクナーニーで、カリフォルニア大学デービス校メディカルセンターのNSFバイオフォトニクスセンターのトーマス・ハウザー博士の研究室に所属しています。

そして、私はディアナ・トンプソンで、同じくトーマス・ハウザー博士の研究室に所属しています。今日は、共焦点顕微鏡を使用してHIV Oneの細胞細胞移動を視覚化する手順をご紹介します。この手順では、ジャークハット細胞に、認定されたバイオセーフティで働く訓練を受けた実験室職員のみのHIV感染性分子クローンをトランスフェクションします。

レベル2プラスまたはバイオセーフティレベル3の組織培養室では、ここに示すプロトコルを実施できます。画像施設での感染性HIVの取り扱いは、地元の機関のバイオセーフティオフィスによって承認されなければなりません。ドナー細胞として使用するジャークキャット細胞を、ミリリットルあたり10〜5分の1の2倍と10〜5分の8の濃度に維持します。

ジャークキャット培養では、培地細胞濃度が1ミリリットルあたり10から5番目の細胞の8倍を超えると、トランス効率が低下します。手順を開始するには、ウイルスプラスミドを用いて6つのジャークキャット細胞に10回5回トランスフェクションし、添付の書面によるプロトコルに記載されているように、HIVギャグIGFPのamax核愛情法を使用して、細胞を一晩回復させる。末梢血単核細胞は、FICO密度勾配遠心分離法により、全ヒト血液のバフィーコートから精製されます。

初代CD4陽性T細胞は、CD4陽性T細胞単離キットを用いた陰性選択により末梢血単核細胞から精製される。否定的に選択されたCD 4つの陽性T細胞は、磁気カラムから収集され、10%FPSでPMIで培養され、これは1ミリリットルあたり10ユニットの組換えヒトILを補充し、分離された一次CDの4つの陽性T細胞を分注し、極低温凍結容器の助けを借りてそれらを凍結することができます。冷凍容器は、マイナス70°Cの冷凍庫に最低3〜4時間入れられます。

その後、細胞を液体窒素に移して長期保存します。ジャークヘッド細胞をトランスフェクションし、標的の一次CDの4つの陽性T細胞を単離したので、トランスフェクションの翌日に細胞のクリーンアップと標識に進みます。ジャーク細胞は現在、感染性蛍光HIVコンストラクトを発現しています。

感染性サンプルを取り扱う際には、フロントクロージングの白衣と手袋を2枚着用します。トランスフェクションした細胞から細胞の破片を、高密度のフィアル培地で遠心分離して除去します。まず、15ミリリットルの円錐管の底に1.5ミリリットルのフィアルパックを分配します。

次に、5ミリリットルの容量のPMI培地で、トランスフェクションされたジャークハット細胞と勾配材料を穏やかに重ねます。この時点で、トランスフェクションされたジャークハット細胞は感染性HIVを産生することができます。そのため、HIV発現細胞と接触するすべてのピペットチップは、10%漂白剤溶液で消毒する必要があります。

バイオセーフティキャビネット内の容器に廃棄する前に、チューブにキャップをし、チューブの外側に70%エタノールの溶液をスプレーし、ドライキムワイプで細胞を400Gで室温で20分間遠心分離します。遠心分離後、ピペットを使用して培地界面から細胞を慎重に取り出し、細胞を新しい15ミリリットルの円錐管に移します。細胞をPMI培地で総容量15ミリリットルに希釈し、300 GSで10分間遠心分離します。

室温で、ペレットを3ミリリットルのジャークハット培養培地に懸濁し、6ウェルプレートの2センチメートルウェルに移します。翌日使用する準備ができるまで、プレートを組織培養インキュベーターに入れます。同日夕方、標的細胞として用いる4つの陽性T細胞を標識し、ドナー細胞と区別するために、400Gで10分間回転することにより、6つの一次CD陽性T細胞のうち10回を最初にペレット化する。

次に、5ミリリットルのPBSとResusで細胞を洗浄します。PBSの2ミリリットルに懸濁し、セルトラッカーオレンジを最終濃度1.5マイクロモルに加え、摂氏37度で数分間インキュベートします。細胞のインキュベーションが終了したら、8ミリリットルの完全チカ培地を加え、400Gで10分間遠心分離します。

IL 2のミリリットルあたり10単位を補充した3ミリリットルの完全培地に細胞を懸濁し、組織培養インキュベーターに一晩置く。一晩のインキュベーション後、ドナー細胞と標的細胞は細胞間転写実験の準備が整います。細胞間移管実験を設定する前に、室内の温度変動に対してプラットフォームをバッファリングするためのイメージングチャンバーを準備します。

また、背景の室内光を遮断するために、大きな黒いシュラウドが顕微鏡の熱セットアップ全体に覆われ、システムの周りに断熱エアポケットが形成されています。イメージングチャンバーは、温度フィードバックのためにサンプルの隣にTタイプの熱電対チップが配置されたサーモスタットヒーターを使用して、摂氏37度に安定して維持されます。サンプルをマウントする前に30分間予熱してください。

倒立光学顕微鏡によるスピニングディスク共焦点イメージングは、HIVの細胞間移動の3D共焦点画像を作成するために使用されます。Zステージを含むすべてのハードウェアとアクイジションは、およびまたはIQバージョン1.8ソフトウェアスキャンによって制御され、同時に800以上の共焦点スポットを使用してスキャン速度を劇的に向上させ、その速度を補完するCS U 10スピニングディスク共焦点ユニットによって実行されます。CS U 10は、高感度の電子増倍炭化結合デバイスカメラと組み合わせることで、光退色と光毒性の両方を低減する高速な低照度イメージングを可能にします。

蛍光光源は、多波長アルゴンクリプトンイオンガスレーザーです。ANまたはまたはOko光学チューナブルフィルターまたはOTFを使用して、488ナノメートルと568ナノメートルの所望の波長を選択しながら、光退色をさらに低減し、イメージング時間を延長するためにそれらの電力を制御します。A OTFは、カメラが画像を取得していないときに15〜30ミリ秒の露光ごとにレーザーを急速にシャッターし、画像がE-M-C-C-Dカメラからコンピューターに転送される間の不要な露出を回避します。

レーザー光は、4 0 5 4 88 5 68 6 47クワッドバンドダイクロイックミラー蛍光発光を使用してスピニングディスクシステムに組み込まれ、イメージスプリッターを備えた560ナノメートルの過去のDIICミラーを使用して波長ごとに分離されます。緑のチャネルは525 over 50 nmメートルのバンドパスフィルタを使用してフィルタリングされ、赤のチャネルは609 over 54ナノメートルのバンドパスフィルタを使用してフィルタリングされます。2つのチャンネルが並べてE-M-C-C-Dカメラに投影されます。

イメージングチャンバーがウォーミングアップしている間に、細胞間転写実験のために細胞を準備します。ヘモサイトメーターを使用して、HIV gag IGFP発現ette細胞をカウントします。ヘモサイトメーターをペトリ皿に入れて、ウイルス発現細胞に直接さらされないようにします。

細胞を二酸化炭素、独立した培地で洗浄し、1ミリリットルあたり7個の細胞のうち10の1〜3倍の濃度で生細胞イメージング培地に再懸濁します。二酸化炭素に依存しない媒体を使用することで、二酸化炭素環境チャンバーが不要になります。イメージング用。

また、細胞は、ジャークハット細胞について示したように、標識された一次CDの4つの陽性T細胞をカウントし、洗浄し、再懸濁します。次に、20マイクロリットルのHIVギャグIGFPトランスフェクションdurハット細胞を40マイクロリットルの標識された一次CD4陽性T細胞と混合した細胞間転写を開始し、50マイクロリットルを組織培養処理ガス透過性にロードします。EBDマイクロチャンバーは、チャンバーをプラグで密閉し、プラグEBIT Dチャンバーインターフェースをパラフォームで包むことでプラグを固定します。

70%エタノールと結合したケミストリーワイプでイメージングチャンバーを拭き取り、フード内で短時間風乾させます。密封されたイメージングチャンバーは、偶発的な曝露を避けるために密閉容器に入れて輸送してください。IBDイメージングチャンバーに細胞をロードした直後にチャンバーを輸送中に落とした場合は、デバイスを顕微鏡に取り付けます。

60 x 1.42 NAの油浸対物レンズを使用して細胞ペアの画像を撮影 高い開口数により解像度が大幅に向上し、3D画像スタックあたりの取得速度が最大化されます。EM CDのカメラの録音領域をセルペアのすぐ近くの領域に切り抜きます。さらに、0.45マイクロメートルから0.75マイクロメートルまでの大きなZステップも、これらの条件下での収集を高速化するのに役立つ可能性があります。

画像は20〜60分間隔で連続して記録されます。同じサンプルスポットの繰り返しイメージングは、取得時の光退色を最小限に抑えながら、最大6時間延長できます。各データ セグメントは、合計 5 ギガバイトから 20 ギガバイトを占める数万枚の画像で構成されています。

大きなファイルの転送と分析を容易にするために、各ファイルは分割され、1 ギガバイトの TIFF イメージ ファイル セグメントとしてエクスポートされます。取得した画像を解析するには、いくつかの画像解析ソフトウェアのいずれかを使用します。強度漂白剤の補正やギャグプンクタの自動および手動追跡など、画像解析の詳細については、付属の書面によるプロトコルを参照してください。

混合から10〜15分以内に、HIVギャグIGFPを発現するジャークキャット細胞が一次CDに付着している4つの陽性T細胞イメージングを視覚化できます。これらのコンジュゲートは、感染細胞および標的細胞におけるギャグプンクタの動きを評価できます。シナプス後、30分から3時間以内に、Gag IG FP punctaがCell Trackerで標識された標的細胞に移動するのが観察されます。

T細胞間のHIVの細胞間移動を視覚化する方法を示しました。これらの手順を実行する際には、HIV発現細胞に曝露されたサンプルを取り扱う際に、バイオセーフティレベル2プラスまたはバイオセーフティレベル3のすべての予防措置を遵守することを忘れないでください。また、トランスフェクションを最適化するために、手入れの行き届いたJCA細胞とエンドトキシンフリーDNAを使用することも忘れないでください。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。