HIVとライブ共焦点顕微鏡の蛍光クローンを使用して、HIVの可視化細胞間伝達

この手順では、生細胞イメージングを用いて、HIVを発現するジャコブ猫（jerk CAT）T細胞と未感染の初代T細胞との間のウイルス学的シナプスを介したGFP標識HIVの移行を可視化します。細胞間移行アッセイは、まずHIV 1の感染性蛍光クローンであるHIV gag GFPでジャコブ猫T細胞をトランスフェクションし、HIV gag GFPを発現するジャコブ猫細胞を作製することから始まります。次に、これらの細胞をCMTMR標識した未感染の初代T細胞と混合し、イメージングチャンバーにロードして、ウイルス学的シナプスを介したGFP標識HIVの移行を観察します。

得られたデータは画像解析ソフトを用いて解析し、T細胞のウイルス学的シナプスを介したHIV伝播の詳細を明らかにします。こんにちは、私はマウントサイナイ医科大学医学部のBen Chen研究室のBenjamin Daleです。私はUC DavisメディカルセンターNSFバイオフォトニクスセンターのThomas Huser博士の研究室のGreg McNerneyです。

私はThomas Huser博士の研究室のDeanna Thompsonです。本日は、ライブ共焦点顕微鏡を用いてHIV-1の細胞間伝播を可視化する手順をご紹介します。この手順では、Jurkat細胞にHIV-1の感染性分子クローンをトランスフェクションします。なお、本操作は、認定されたバイオセーフティー施設で勤務する訓練を受けた研究員のみが行ってください。

本プロトコルは、バイオセーフティレベル2（BSL-2+）またはバイオセーフティレベル3（BSL-3）の組織培養室で実施可能です。イメージング施設で感染性HIVを取り扱う場合は、管轄の機関バイオセーフティ委員会の承認を得る必要があります。ドナー細胞として使用するjerk cat cellは、2 × 10⁵ から 8 × 10⁵ cells/mL の濃度で維持してください。

jerk cat細胞の培養において、培地中の細胞濃度が8 × 10⁵ cells/mLを超えると、導入効率が低下します。手順を開始し、付属の書面プロトコルに記載されているamax nucleo affection法を用いて、5 × 10⁶個のjerk cat細胞にウイルスプラスミドHIV gag IGFPを導入し、細胞を一晩回復させます。末梢血単核細胞は、FICO密度勾配遠心法によりヒト全血のバフィーコートから精製します。

CD4陽性Ｔ細胞分離キットを用いたネガティブセレクションにより、末梢血単核細胞から初代CD4陽性Ｔ細胞を精製します。ネガティブセレクションされたCD4陽性Ｔ細胞を磁気カラムから回収し、10 U/mLの組換えヒトIL-2を添加した10% FPS含有PMI中で培養します。また、単離した初代CD4陽性Ｔ細胞を分注し、凍結保存容器を用いて凍結させることも可能です。凍結保存容器を-70 °Cのフリーザーに最低3〜4時間置きます。

その後、細胞を液体窒素に移して長期保存します。Jurkat細胞へのトランスフェクションと、標的となる一次CD4陽性T細胞の単離が完了したので、トランスフェクションの翌日に細胞のクリーンアップとラベル化に進みます。これで、Jurkat細胞は感染性蛍光HIVコンストラクトを発現しています。

感染性サンプルを扱う際は、前開きの白衣を着用し、手袋を2重に装着します。Ficoll high density mediumを用いた遠心分離により、トランスフェクトした細胞から細胞残渣を除去します。まず、15 mLコニカルチューブの底にFicoll packを1.5 mL分注します。

次に、5 mLのPMI培地を用いた形質導入済みのjerk hat細胞を、グラジエント材料の上に静かに重層します。この時点で、形質導入済みのjerk hat細胞は感染性HIVを産生することが可能です。したがって、HIV発現細胞に接触したすべてのピペットチップは、10%次亜塩素酸ナトリウム溶液で消毒しなければなりません。

バイオセーフティキャビネット内の容器に廃棄する前に、チューブにキャップをし、チューブの外側を70%ethanol溶液でスプレーして、乾いたキムワイプで拭き取ります。細胞を室温で、ブレーキオフの状態で 400 Gs で 20 分間遠心分離します。遠心分離後、ピペットを使用して培地と細胞の界面から細胞を注意深く回収し、新しい 15 milliliter コニカルチューブに移します。細胞をPMI mediumで全量 15 milliliters に希釈し、300 GS で 10 分間遠心分離します。

室温で、ペレットを3 mLのJerk hat培養液に懸濁し、6ウェルプレートの2 cmウェルに移します。プレートを組織培養インキュベーターに入れ、翌日に使用できるよう準備します。同日の夜に、ドナー細胞と区別するため、標的細胞として使用するプライマリーCD4陽性T細胞をラベルします。まず、6種類のプライマリーCD4陽性T細胞をそれぞれ4×10⁶個、400 ×gで10分間遠心分離してペレット化します。

次に、細胞を5 mLのPBSで洗浄し、2 mLのPBSに再懸濁します。Cell Tracker Orangeを最終濃度1.5 µMになるように添加し、37 °Cで数分間インキュベートします。インキュベーション終了後、8 mLの完全chikamediaを加え、400 ×gで10分間遠心分離します。

10 units/mLのIL-2を添加した完全培地3 mLで細胞を再懸濁し、組織培養インキュベーターで一晩培養します。一晩の培養後、ドナー細胞とターゲット細胞が細胞間転送実験に使用可能な状態になります。細胞間転送実験を開始する前に、室温の変動からプラットフォームを保護するため、イメージングチャンバーを準備します。

また、室内の背景光を遮断するため、顕微鏡の加熱装置全体に大きな黒色のカバーを掛け、システムの周囲に断熱空気層を作ります。イメージングチャンバーは、サンプルの隣に配置したT型熱電対チップによる温度フィードバックを備えた恒温ヒーターを用いて、37 °Cの安定した温度に維持します。サンプルを装着する前に30分間予熱してください。

倒立光学顕微鏡を用いたスピニングディスク共焦点イメージングにより、HIVの細胞間移行の3D共焦点画像を構築します。Zステージを含むすべてのハードウェアおよびデータ収集は、IQ version 1.8ソフトウェアによって制御されます。スキャニングはCS U 10スピニングディスク共焦点ユニットによって行われ、800以上の共焦点スポットを同時に使用することでスキャン速度を劇的に向上させ、高速撮影を可能にしています。CS U 10には高感度の電子増倍電荷結合素子（EMCCD）カメラが組み合わされており、低光量での高速イメージングが可能なため、光退色と光毒性の両方を低減させることができます。

蛍光光源には、多波長アルゴン・クリプトンイオンガスレーザーを使用します。希望する波長（本実験では488 nanometersおよび568 nanometers）を選択し、さらに出力を制御して光退色を抑制し、イメージング時間を延長するために、アコーストオプティック可変フィルター（AOTF）を使用します。AOTFは、カメラが画像を取得していない15 to 30 millisecondの各露光後にレーザーを高速でシャッターし、EMCCDカメラからコンピュータへ画像が転送される間の不要な露光を回避します。

レーザー光は405、488、568、647 nmのクアッドバンドダイクロイックミラーを用いてスピニングディスクシステムに導入され、蛍光放出は560 nmのロングパスダイクロイックミラーとイメージスプリッターを用いて波長ごとに分離されます。グリーンチャンネルは525/50 nmのバンドパスフィルターで、レッドチャンネルは609/54 nmのバンドパスフィルターでフィルタリングされます。これら2つのチャンネルは、EMCCDカメラ上に並べて投影されます。

イメージングチャンバーのウォーミングアップ中に、細胞間移行実験のための細胞調製を行います。ヘモサイトメーターを使用して、HIV gag IGFP発現ette細胞をカウントしてください。ウイルス発現細胞への直接的な曝露を避けるため、ヘモサイトメーターはシャーレの中に置いてください。

細胞を二酸化炭素独立培地で洗浄し、生細胞イメージング培地を用いて1～3×10⁷ cells/mLの濃度で再懸濁します。二酸化炭素独立培地を使用することで、イメージングにおいて二酸化炭素環境チャンバーが不要になります。

また、ラベル化した一次CD4陽性T細胞についても、Jurkat細胞と同様に、細胞数のカウント、洗浄、および再懸濁を行います。次に、細胞間転移を開始するため、HIV gag-GFPを導入したJurkat細胞20 µLと、ラベル化した一次CD4陽性T cells 40 µLを混合し、組織培養処理済みのガス透過性EBDマイクロチャンバーに50 µLをロードします。チャンバーをプラグで密閉し、プラグとEBDチャンバーの接合部をパラフィルムで巻いてプラグを固定します。

70% ethanolを含ませたケムワイプでイメージングチャンバーを拭き、フード内で短時間自然乾燥させます。不慮の曝露を避けるため、密閉されたイメージングチャンバーを密閉容器に入れて運搬します。IBDイメージングチャンバーに細胞をロードした直後、運搬中にチャンバーを落下させないよう注意し、デバイスを顕微鏡にマウントしてください。

60 x 1.42 NAのオイル浸漬対物レンズを用いて細胞対の画像を撮影します。高開口数により分解能が大幅に向上し、3Dイメージスタックあたりの取得速度を最大化できます。EM CCDカメラの記録領域を、細胞対の直近の領域までクロップしてください。さらに、このような条件下では、0.45から0.75 micrometersの大きなZステップを設定することも、取得速度の向上に有効です。

画像は20分から60分の間隔で連続的に記録されます。同一のサンプルスポットを繰り返し撮影する場合、取得時の光退色が最小限に抑えられれば、最大6時間まで延長可能です。各データセグメントは数万枚の画像で構成されており、合計で5GBから20GBの容量を占める場合があります。

大容量ファイルの転送と解析を容易にするため、各ファイルは分割され、1GBのTIFF画像ファイルセグメントとしてエクスポートされます。取得した画像を解析するには、複数の画像解析ソフトウェアプログラムのいずれかを使用してください。強度退色補正や、gag punctaの自動および手動トラッキングを含む画像解析の詳細については、付属の書面プロトコルを参照してください。

混合後10〜15分以内に、HIV gag IGFPを発現するJerk cat細胞が一次CD4陽性T細胞に接着する様子を可視化できます。これらの共役体を用いて、感染細胞および標的細胞におけるgagパンクタの移動を評価できます。シナプス形成後30分から3時間以内に、CellTrackerでラベル化された標的細胞内へのgag IG FPパンクタの移動が観察される場合があります。

T細胞間におけるHIVの細胞間移行を可視化する方法について説明しました。これらの手順を行う際は、HIV発現細胞に曝露したサンプルを扱うにあたり、バイオセーフティレベル2プラス（BSL-2+）またはバイオセーフティレベル3（BSL-3）のすべての予防措置を遵守することが非常に重要です。また、トランスフェクションを最適化するために、適切に維持管理されたJCA細胞およびエンドトキシンフリーDNAを使用してください。

以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。