Name: HIVとライブ共焦点顕微鏡の蛍光クローンを使用して、HIVの可視化細胞間伝達 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: 学ぶHIVの細胞間伝達をライブ共焦点顕微鏡で可視化する方法。GFP標識したHIV分子クローンを用いて、ウイルス学的シナプスを介するT細胞間のHIV移動をリアルタイムで観察し、感染メカニズムの理解に貢献します。

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このレビューはBKCに健康補助金の国立研究所、AI074420 - 02、バローズウェルカム奨励賞、Hirschlキャリア科学賞でサポートされており、NSFバイオフォトニクス科学技術センター、協力協​​定PHY012099、およびTHにUCDの保健システム研究賞がされたUCD CTSC NCRR ULRR024146。

このメソッドは、で報告された研究で使用されて<a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1743">ブナーらScience 323：。1743年から1747年（2009） 。</a> 1。概要 HIVの細胞間のスプレッドは、もともとドナー細胞と一次CD4 +受容体の細胞は1,2,3のようなTリンパ球としてHIV感染Jurkat細胞を用いて記述されていた。これらの研究では、ウイルスは抗体染色を用いて固定された細胞で検出された。生細胞での細胞から細胞へのウイルスの伝達を追跡するために、我々は、HIVのGag - iGFP 4と呼ばれるHIVの遺伝子組換え、感染性分子クローンを利用する。それは、MAとCAのドメイン間のGagタンパク質に内部的に挿入された緑色蛍光タンパク質（GFP）を運びます。 HIVのこの分子クローンは、ヘルパーウイルスを必要とせずに感染性を保持します。このクローンから作られたウイルス粒子は、化学量論的に細胞間のウイルスのアセンブリとの転送を監視するために強い蛍光シグナルを提供し、緑色蛍光タンパク質がロードされます。不活性細胞トラッキング蛍光色素と組み合わせて使用すると、受容細胞は、入力のドナー細胞と区別し、一感染したT細胞から非感染T細胞5〜HIVの伝達を視覚的に確認できますすることができます。それらは密閉、ガス透過性の撮像室内で培養され、一方のセルから別のウイルスのウイルス学的シナプス形成と伝達は、生きた細胞で観察することができます。 （1日目） 2。 HIVギャグiGFPトランスフェJurkat T細胞の調製<ol><li> Jurkat細胞培養培地中の× 10 5細胞/ mLのは、（RPMI 1640、10％ウシ胎児血清、慎重に2 × 10 5と8の間の濃度で細胞を維持することにより、ヒトCD4 + T細胞株Jurkat（ATCC、マナッサス、VA）を準備100単位/ mLペニシリン、および100μg/ mlのストレプトマイシン）。成功への鍵：8 × 10 5細胞/ mLを超える濃度でJurkat細胞の培養は、トランスフェクション効率の低下になります。 注：以下に示すようにT細胞へのHIVギャグiGFPプロウイルスDNAのトランスフェクション、、複製コンピテントヒト免疫不全ウイルスの生産の結果。このように、すべての手続きは、認定されたバイオセイフティレベル2 +または生物学的安全性レベル3（BL2 + / BL3）組織培養室では、訓練を受けた検査技師が行うこととなります。イメージング施設における感染性HIVとの作業は、最寄りの機関のバイオセーフティの事務所によって承認されなければならない。 </li><li> Amaxaのnucleofection法（ロンザ、ウォーカー、MD）を用いてウイルスプラスミド、HIVギャグiGFPとJurkatsをトランスフェクション。 150 × gで10分間の遠心分離によってペレット5 × 10 6細胞上清を吸引除去し、緩衝生理食塩水（PBS）滅菌リン酸で細胞を洗う。細胞を遠心分離し、メーカーのサプリメントを含むV予め温めておいた、nucleofectorソリューションの97μLにペレットを再懸濁します。細胞懸濁液にエンドトキシンフリーHIVギャグiGFPプラスミド（1μg/μLの）の三μLを加え、穏やかに混ぜる。プログラムS - 18を使用してキュベットとnucleofectに細胞懸濁液を移す。すぐに抗生物質なしで温めたジャー培養培地3 mlに細胞を移す。 </li><li>ウイルス学的シナプスのためにCD4 +標的細胞を調製するために、我々は標準をFicoll - Paque（GE Healthcare社、ウプサラ、スウェーデン）プロトコルを使用して軟膜からヒト末梢血単核細胞を得る。 CD4 + T細胞は、マイナスの磁気ビーズ分離用キット（Miltenyi Biotec社、オーバーン、カリフォルニア州）を使用して選択されます。これらは、極低温冷凍メディアの5 × 10 6 cells/500μL（90％ウシ胎児serum/10％DMSO）のアリコートにおける液体窒素で保存することができる。解凍した主CD4 + T細胞はIL - 2の10単位/ mLで添加したRPMI、10％FBSで培養される。 </li></ol> （2日目） 3。 HIVギャグiGFPと蛍光色素で標的細胞の染色でトランスフェクションJurkatsから生細胞の回収<ol><li> Jurkat細胞は、一晩トランスフェクションから回復することができます。その後、フィコールHypaque密度勾配の材料を介して遠心分離により細胞破片を除去。 15 mLコニカルチューブの底までをFicoll - Paqueの1.5 mLを分注する。優しくRPMI 5 mLの量で、トランスフェクションJurkatsでこの傾斜材料を重ねます。ブレーキをオフにし、室温で20分間400 xgで細胞を遠心分離します。慎重にピペットを使用してメディア/フィコールインターフェイスからセルを削除する。新しい15 mLコニカルチューブに移す。 10分間、300 xgで15 mLの遠心分離との合計量にRMPIで細胞を希釈する。ウェル2 cmのジャー培養培地3mLの（6ウェルプレート）でペレットを再懸濁し、組織培養インキュベーターにセルを返します。 </li><li>細胞間の伝達実験でドナー細胞から標的細胞を区別するために我々は、蛍光色素でCD4 +標的細胞をprelabel。主なCD4 + T細胞であってもラベルが付いています使用前に優先します。我々は、CellTrackerとCellTrace染料（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）の両方でT細胞を標識する優秀な成功を収めている。色素濃度とインキュベーション時間が使用される特定の色素と細胞の種類に応じて最適化する必要がありますが、代表的なプロトコルは以下の通り。ペレット4 × 10 6主なCD4 + T細胞を10分間、400 × gで回転させて。 PBS 2ml中のPBSに懸濁する5 mLで細胞を洗浄。 1.5μMの最終濃度にCellTrackerオレンジを（CMTMR、Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）を加え、37℃で20分間℃でインキュベートする。完全なジャーメディアの8 mLを加え、10分間、400 × gで遠心。 IL - 2および組織培養一晩培養器内の場所の10単位/ mLを補充した完全培地3mLに細胞を再懸濁します。 </li></ol> （3日目） 4。生細胞イメージングを用いてHIVの監視の細胞間の転送ギャグiGFP 我々は日常的に48時間トランスフェクション後のHIVギャグiGFPトランスフェクトしたJurkat細胞を使用してください。しかし、我々は成功し、24時間には早くもセルを使用している、と72時間トランスフェクション後のように遅い。 <ol><li>約48時間トランスフェクション後、HIVギャグiGFP Jurkatsを発現する（CO 2の独立したメディア、10％ウシ胎児血清、、数えCO 2 -独立系メディア（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）で洗浄し、生細胞イメージングメディアに再懸濁している1〜3 × 10 7細胞/ mLの濃度で100 U / mlペニシリン、および100μg/ mlのストレプトマイシン、10単位/ mLのIL - 2）。 </li><li>同様の方法で、洗浄および生細胞イメージングメディアの1-3 × 10 7細胞/ mLの濃度で主要なCD4 + T細胞を標識し懸濁します。 </li><li>主なCD4 +扱わ組織培養に1:2または1時03分比と負荷時のT細胞は、ガス透過性、マイクロチャンバー（Ibidi、ベローナ、ウィスコンシン州）との混合感染は、Gag - iGFPトランスフェJurkats。例えば、標識一次CD4 + T細胞の40μLでHIVギャグiGFPトランスフェJurkatsの20μLを混合する。 Ibidi室にこの混合物50μLをロードし、プラグが付いているチャンバーをシール。パラフィルムでプラグ/ Ibidi室のインタフェースをラップしてプラグを固定します。 </li></ol> 5。顕微鏡プラットフォームに関する考慮事項：回転するディスク共焦点イメージング細胞とIbidiイメージングチャンバーをロードした後、我々はすぐに倒立型光学顕微鏡（iX71オリンパス、センターバレー、ペンシルバニア州）の上にデバイスをマウントします。 Ibidi室は、適切な安全衣服を着てBL2 +訓練された実験室の担当者が顕微鏡に転送する必要があります。生きた細胞のイメージングは​​、一般的に安定した37℃の環境を維持するために高価なインキュベーションチャンバーを使用していますが、これはT型熱電対の先端と一緒に簡単で経済的な恒温器を（ASI 400、Nevtek、ウィリムズヴィル、バージニア州）を用いて達成されたの隣に取り付けられて適切な温度フィードバックのためのサンプル。我々はCO 2 -独立系メディアを使用して発見したCO 2チャンバーの使用を回避しながら、私たちは、高い細胞生存率を維持することができます。部屋の温度の変動に対してプラットフォームをバッファリングすると、背景の部屋の光を遮断するために、大きな黒のシュラウドは、システム周りの断熱エアポケットを作成する全体顕微鏡/ヒーターの設定を介して掛けている。これにより、温度変化とそれに関連する温度に関連するサンプルのドリフトを減少しますが、前にサンプルをマウントするまで30分間予熱を必要とします。 6。データ収集、転送、画像処理画像は、高開口数（NA）非常に解像度を向上させると60倍1.42 NA油浸対物レンズ（UPlanApo N、オリンパス）を用いて撮影されています。 3D共焦点画像を作成するには、スキャンが同時に飛躍的にスキャン速度を向上させる&gt; 800共焦点スポットを使用して、回転するディスク共焦点ユニット（CSU - 10、Yokagawa、日本）によって実行されます。お世辞、その速度をするために、CSU - 10は、光退色や光毒性の両方を削減する、高速、低光のイメージングを可能にする高感度電子乗じ電荷結合素子（EMCCD、IXON + 897、アンドールテクノロジーズ、アイルランド）カメラと対になっています。蛍光光源は、によって選択される所望の波長（488 nm）とレーザーのパワーは右の顕微鏡対物レンズ（&lt;1 mW）の前に測定された多波長ArKrイオンガスレーザー（イノーバ70C、コヒーレント、サンタクララ）は、音響光学波長可変フィルタ（AOTF）、（アンドールテクノロジーズ）。新たに取得した画像をCCD（15-30ミリ秒露光）から配信されている間、さらに退色を軽減し、全体の撮像時間を延長するには、急速にAOTF（マイクロ秒）は、レーザービームからカメラが非アクティブになるたびに（10〜20ミリ秒）をシャットダウンしますコンピュータに。レーザー光は405/488/568/647クワッドバンドダイクロイックミラーを（Semrock、ロチェスター、NY）を使用して回転するディスクのシステムに結合されている。蛍光発光は、フィルターホイール（Ludl電子製品、ホーソーン、ニューヨーク州）の内部に50分の525バンドパスフィルタ（Semrock）を使用してフィルタリングされるマウントBEMCCDカメラと共焦点回転するディスクユニットをetween。 Zステージ（マッドシティ研究所、マディソン、WI）を​​含むすべてのハードウェアと買収は、、アンドールiQのV1.8ソフトウェアによって制御されます。 1.2から1.9秒程度の3D画像スタックでの買収の速度を最大化するために、我々は細胞ペアのすぐ近くにEMCCDのカメラの記録領域をトリミング。さらに、Zの一部の情報を犠牲にして、0.45から0.75μmの間に大きなz -ステップは、買収をスピードアップするために使用することができます。これらの条件下でのイメージングは​​6時間まで持続することができます - 連続20〜60分のセグメントを使用して - 最小限の退色と。画像の数万は取られると完全に、各データセグメントは通常、スペースの5〜20 Gbを占めている。大規模なデータファイルの転送や分析を容易にするために、それぞれ買収セットは、分解し、アンドールiQのV1.8ソフトウェアを使用して1GbのTIFFイメージファイルのセグメントとしてエクスポートする必要があります。ここから、多くの優秀なソフトウェアパッケージは、Metamorph、Volocityすると、ImageJなどの画像解析、（我々はその変化フィジーをお勧めします）をご用意しています。 つの蛍光マーカーが追跡されなければならない時に、我々は、同時に使用することで買収を落とすことなく、それらの両方を記録&quot;分割画面モードを。&quot;両方のマーカーを一度に二つの異なるArKrのレーザライン（多くの場合、488と568 nmの）によって励起される。 EMCCDカメラは、2つの異なるイメージが分離画像スプリッタ（OptoSplit II、ケアン、ケント、イギリス）になる前に直接挿入。各画像は、その後独立して一度、&quot;分割画面&quot;効果を作成することで、カメラで蛍光フィルター（Semrock）と予測される横並びを用いて濾過する。これは、手動トリミングし、後で画像処理で画像の位置合わせが必要になります。 7。画像処理とデータ解析のための考慮事項我々は、通常、Macintoshコンピュータ上でVolocity（パーキンエルマー社、マサチューセッツ州ウォルサム）（アップル社）で画像解析を行う。回転するディスクのレーザー共焦点顕微鏡画像は、最初のVolocityでデコンボリューションし、退色を補正するために彼らの強さに調整されます。ギャグ涙点の強度の測定とトラッキングがVolocity定量化モジュールで実行されます。予め形成されたシナプスの相対運動を計算する必要が画像セットの場合、自動追跡アルゴリズムは、シーケンス全体を通してシナプスボタンを追跡するため採用されている。オートトラッキングソフトウェアで定義された関心領域の手動検査は、ソフトウェアが正しく、目的のオブジェクトを追跡していることを確認するために実行する必要があります。周囲の物体とのコントラストが弱すぎるのオブジェクトの場合は、手動での追跡は、フレームごとに実行することができる。 Volocityソフトウェアパッケージは、XYZの位置、ボリュームと目的のオブジェクト内で統合された信号の輸出が可能になります。追跡対象オブジェクトのシナプスと速度からの距離は、シナプスボタンの中心に動きを正規化することによって計算されます。 8。代表的な結果つを混合10〜15分以内に主要なCD4 + T細胞に接着したJurkat細胞を発現するHIVギャグiGFPを可視化することができるはずです。イメージングこれらの複合体、一synaspe後に感染した細胞でだけでなく、標的細胞のギャグの涙点の動きを評価することができます。一つは、シナプスが形成されている直後に標的細胞にギャグiGFP涙点の動きを観察することがあります。

<ol><li>Blanco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+level+of+coreceptor-independent+HIV+transfer+induced+by+contacts+between+primary+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells.</a> J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).</li>
<li>Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+human+immunodeficiency+virus+replication+in+mobile+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes.</a> J Virol. 81, 1000-1012 (2007).</li>
<li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced%2C+actin-dependent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J Exp Med. 199, 283-293 (2004).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent%2C+fluorescently+tagged+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> J Virol. 81, 12596-12607 (2007).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+video+microscopy+of+HIV+transfer+across+T+cell+virological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses.</a> Science. 323, 1743-1747 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここでは、細胞 - 細胞からのHIVの伝達を可視化するための簡単​​な方法を説明します。我々の研究室と他者からの最近の研究では、これがT細胞の間に広がるHIVの主要なモードであることを示唆している。ここで説明する方法は、コア構造タンパク質、ギャグで遺伝的に符号化された緑色蛍光タンパク質タグを運ぶHIVのGag - iGFPと呼ばれるHIVの組換え形態を、採用しています。ために各ウイルス粒子の生産GFPの高いレベルから、HIVのこの複製コンピテントクローンは、リアルタイムで個々のウイルス粒子を追跡する研究が可能になります。このウイルスは、HIVのアセンブリと、細胞間伝達に関する研究で特に有用であると考えられる。 細胞間の転送によるHIVの転送は非常に効率的です。 3時間共培養時には、我々のルーチンは、フローサイトメトリーによって評価されるウイルスは一次T細胞の20〜30％に転送してください。同様の効率は質的に生細胞イメージングの間に見られている。ウイルスに感染したT細胞は、ほぼすぐに共培養開始後感染していない一次T細胞とシナプスを形成し始める。興味深い、すべての主要なT細胞は、レーザーピンセット（未発表の観察、GM）との強制相互作用にもかかわらず、HIV感染Jurkat細胞と対話する機能があります。 HIVギャグiGFPは間違いなく、in vitroおよび in vivo の両方で細胞間の伝達、に最も影響を受けやすいT細胞サブセットを決定するために有用であろう。

<table><tbody><tr><td>Jurkat T細胞</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>全血由来白血球バフィーコート</td><td>New York Blood Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleofectorシステムおよびSolution V</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Maxi Prepキット</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HIV Gag-iGFPプラスミド</td><td>Chen Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD4+ T細胞分離キット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celltracker/CellTrace色素</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;独立培地</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イメージングチャンバー</td><td>Ibidi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-71 倒立顕微鏡</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PlanApo N 1.42NA 60X 油浸対物レンズ</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 70C ArKrイオンガスレーザー</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSU-10 ニプコウ型回転ディスク共焦点ユニット</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 ダイクロイックビームスプリッター</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>525/50 バンドパスフィルター</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon+ 897 電子倍増型電荷結合素子（EMCCD）カメラ</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ASI 400 定温ヒーター</td><td>Nevtek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hivとライブ共焦点顕微鏡の蛍光クローンを使用して、hivの可視化細胞間伝達

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

融合することにより自分の好きなタンパク質に緑色蛍光タンパク質は、生物学者は、現在蛍光ビデオ顕微鏡を用いて生きている複雑な細胞プロセスを研究する能力を持っている。ヒト免疫不全ウイルスの細胞間の送信中にヒト免疫不全ウイルスのコアタンパク質の動きを追跡するために、我々はHIVの感染性分子クローンのコンテキストでGagタンパク質をGFP -タグ付きて、HIVのGag - iGFPと呼ばれる。我々は、ビデオ共焦点顕微鏡を使用してこのウイルスのクローンを研究する。以下の可視化実験では、我々はHIVギャグiGFPとヒトT細胞株をトランスフェクトし、我々は、蛍光標識した非感染CD4 + T細胞ウイルスの標的細胞として機能するを使用してください。我々は容易にウイルス学的シナプスと呼ばれる細胞間の構造を介してウイルスの生産と輸送を追うことができる異なる蛍光標識を使用する。シンプルなガス透過イメージング室は、私たちは数分から数日にライブ共焦点顕微鏡でシナプスを観察することができます。これらのアプローチは、彼らは一つの細胞から次へに移動するとウイルスタンパク質を追跡するために使用することができます。

この可視化実験では、ライブ共焦点イメージングの実験のためにHIVの蛍光分子クローンを利用するためのガイドです。

HIVとライブ共焦点顕微鏡の蛍光クローンを使用して、HIVの可視化細胞間伝達

生物学者は、緑色蛍光タンパク質を標的タンパク質に融合させることで、...を用いて生きた複雑な細胞プロセスを研究することが可能になりました。

本手順では、HIVを発現するジャージー猫T細胞と非感染の一次T細胞との間のウイルス学的シナプスを介した、GFP標識HIVの移行をライブセルイメージングを用いて可視化します。細胞間移行アッセイは、まずHIV-1の感染性蛍光クローンであるHIV gag-GFPでジャージー猫T細胞をトランスフェクトし、HIV gag-GFPを発現させたジャージー猫細胞を調製することから始まります。次に、これらの細胞をCMTMR標識した非感染一次T細胞と混合し、イメージングチャンバーにロードして、ウイルス学的シナプスを介したGFP標識HIVの移行を観察します。得られたデータは画像解析ソフトウェアを用いて分析し、T細胞のウイルス学的シナプスを介したHIV転移の詳細を明らかにします。こんにちは、私はマウントサイナイ医科大学医学部のBen Chen研究室のBenjamin Daleです。私はUC DavisメディカルセンターのNSFバイオフォトニクスセンターにあるThomas Huser博士の研究室のGreg McNerneyです。私はDeanna Thompsonで、同じくDr.Thomas Huserの研究室に所属しています。本日は、生細胞共焦点顕微鏡を用いてHIV-1の細胞間移行を可視化する手順をご紹介します。この手順では、Jurkat細胞にHIV-1の感染性分子クローンをトランスフェクションします。本操作は、認証済みのバイオセーフティー施設で勤務する、訓練を受けた専門職員のみが行ってください。本プロトコルは、バイオセーフティーレベル2（BSL-2+）またはレベル3（BSL-3）の組織培養室で実施可能です。イメージング施設で感染性HIVを取り扱う場合は、所属機関のバイオセーフティー委員会の承認を得る必要があります。ドナー細胞として使用するjerk cat cellsは、2×10⁵～8×10⁵ cells/mLの濃度で維持してください。jerk cat細胞の培養において、培地中の細胞濃度が8×10⁵ cells/mLを超えると、導入効率が低下します。手順を開始するには、付属の書面プロトコルに記載されているamax nucleo affection法を用いて、5×10⁶個のjerk cat細胞にウイルスプラスミドHIV gag IGFPを導入し、一晩細胞を回復させてください。末梢血単核細胞は、ヒト全血のバフィーコートからFICO密度勾配遠心法により精製されます。CD4陽性T細胞分離キットを用いたネガティブセレクションにより、末梢血単核細胞から一次CD4陽性T細胞を精製します。ネガティブセレクションされたCD4陽性T細胞を磁気カラムから回収し、10 units/mLの組換えヒトIL-2を添加した10% FPS含有PMIで培養します。また、単離した一次CD4陽性T細胞を分注し、凍結保存容器を用いて凍結保存することも可能です。凍結保存容器は、-70 °Cのフリーザーに最低3〜4時間置きます。その後、細胞を液体窒素に移し、長期保存します。Jurkat細胞のトランスフェクションと、標的となる一次CD4陽性T細胞の分離が完了しましたので、トランスフェクションの翌日に細胞の洗浄およびラベル化に進みます。これにより、Jurkat細胞で感染性蛍光HIVコンストラクトが発現します。感染性サンプルを取り扱う際は、前開きのラボコートを着用し、手袋を2重に装着します。Ficoll高密度勾配 mediumを用いた遠心分離により、トランスフェクションした細胞から細胞残渣を除去します。まず、15 mLコニカルチューブの底にFicoll Packを1.5 mL分注します。次に、5 mLのPMI培地を用いたトランスフェクション済みのjerk hat細胞で、グラジエント物質を静かに覆います。この時点で、トランスフェクション済みのjerk hat細胞は感染性HIVを産生できる状態にあります。したがって、HIV発現細胞に接触したすべてのピペットチップは、10%次亜塩素酸ナトリウム溶液で消毒しなければなりません。バイオセーフティキャビネット内の容器に廃棄する前に、チューブにキャップをし、チューブの外側を70% ethanol溶液でスプレーし、乾いたキムワイプで拭き取ります。細胞を室温で、ブレーキをオフにした状態で400 Gs、20分間遠心分離します。遠心分離後、ピペットを用いて培地と細胞の界面から細胞を注意深く回収し、新しい15 milliliterコニカルチューブに移します。細胞をPMI mediumで希釈して全量を15 millilitersにし、300 GSで10分間遠心分離します。室温にて、ペレットを3 mLのJurkat培養培地に懸濁し、6ウェルプレートの2 cmウェルに移します。翌日の使用準備が整うまで、プレートを組織培養インキュベーターに入れておきます。同日の夜に、ターゲット細胞として使用する一次CD4陽性T細胞を、ドナー細胞と区別するためにラベル付けします。まず、6種類の一次CD4陽性T細胞から4×10⁶個を、400 ×gで10分間遠心分離してペレット化します。次に、細胞を5 mLのPBSで洗浄し、2 mLのPBSに再懸濁します。CellTracker Orangeを最終濃度1.5 µMになるように加え、37 °Cで数分間インキュベートします。インキュベーション終了後、8 mLの完全CHIK mediaを加え、400 ×gで10分間遠心分離します。10 units/mLのIL-2を添加した3mLの完全培地で細胞を再懸濁し、組織培養インキュベーターで一晩培養します。一晩の培養後、ドナー細胞およびターゲット細胞が細胞間転移実験に使用可能な状態になります。細胞間転移実験を開始する前に、室内の温度変動からプラットフォームを保護するため、イメージングチャンバーを準備します。また、室内の背景光を遮断するため、顕微鏡の加熱セットアップ全体に大きな黒色のシュラウドを被せ、システム周囲に断熱空気層を形成します。イメージングチャンバーは、サンプルに隣接して配置したT型熱電対チップによる温度フィードバックを備えた恒温ヒーターを用いて、37 °C の安定した温度に維持します。サンプルの装着前に30分間予熱してください。倒立光学顕微鏡を用いたスピニングディスク共焦点イメージングにより、HIVの細胞間伝播の3D共焦点画像を構築します。Zステージを含むすべてのハードウェアおよびデータ取得は、IQ version 1.8ソフトウェアによって制御されます。スキャンはCS U 10スピニングディスク共焦点ユニットによって行われ、800以上の共焦点スポットを同時に使用することでスキャン速度を劇的に向上させ、その高速性を補完しています。CS U 10は高感度の電子増倍CCDカメラと組み合わされており、低光量での高速イメージングを可能にし、光退色と光毒性の両方を低減させています。蛍光光源には、多波長アルゴンクリプトンイオンガスレーザーを使用します。目的の波長（ここでは488 nanometersおよび568 nanometers）を選択し、出力を制御して光退色をさらに抑制し、イメージング時間を延長するために、アコーストオプティック可変フィルター（AOTF）を使用します。AOTFは、カメラが画像をキャプチャしていない15 to 30 millisecondの各露光後にレーザーを迅速にシャッターし、EMCCDカメラからコンピュータへ画像が転送される間の不要な露光を回避します。レーザー光は、405/488/568/647 nmのクアッドバンドダイクロイックミラーを用いて回転ディスクシステムに導入されます。蛍光放出は、イメージスプリッターを備えた560 nmロングパスダイクロイックミラーにより波長ごとに分離されます。グリーンチャンネルは525/50 nmバンドパスフィルターで、レッドチャンネルは609/54 nmバンドパスフィルターでフィルタリングされます。これら2つのチャンネルは、EMCCDカメラ上に並べて投影されます。イメージングチャンバーのウォームアップ中に、細胞間転移実験のための細胞準備を行います。ヘモサイトメーターを用いて、HIV gag IGFPを発現するette細胞をカウントしてください。ウイルス発現細胞に直接さらされるのを避けるため、ヘモサイトメーターをペトリ皿の中に置いて使用します。細胞を二酸化炭素独立培地で洗浄し、1〜3 × 10⁷ cells/mLの濃度になるようにライブセルイメージング培地で再懸濁します。二酸化炭素独立培地を使用することで、イメージング時に二酸化炭素環境チャンバーを使用する必要がなくなります。同様に、標識した一次CD4陽性T細胞を計数し、洗浄して再懸濁します。次に、細胞間転移を開始するため、HIV gag IGFPをトランスフェクトしたJurkat細胞 20 µLと、標識した一次CD4陽性T細胞 40 µLを混合し、組織培養処理済みのガス透過性EBDマイクロチャンバーに 50 µLをロードします。チャンバーをプラグで密封し、プラグとEBDチャンバーの接合部をパラフィルムで巻いて固定します。70% ethanolを浸した化学ワイプでイメージングチャンバーを拭き、フード内で短時間、自然乾燥させます。不慮の曝露を避けるため、密閉したイメージングチャンバーを密閉容器に入れて運搬します。IBDイメージングチャンバーに細胞をロードした直後に、運搬中にチャンバーを落とした場合は、直ちにデバイスを顕微鏡に取り付けてください。60倍 1.42 NAの油浸対物レンズを使用して、細胞ペアの画像を撮影します。高開口数により分解能が大幅に向上するため、3D画像スタックあたりの取得速度を最大化できます。EM CDカメラの記録領域を、細胞ペアの直近の領域までクロップしてください。さらに、これらの条件下では、0.45 µmから0.75 µmの大きなZステップを設定することで、取得速度をさらに向上させることができます。画像は20分から60分の間隔で連続的に記録されます。同一のサンプルスポットを繰り返しイメージングする場合、取得時の光退色が最小限であれば、最大6時間まで延長可能です。各データセグメントは数万枚の画像で構成されており、合計で5～20ギガバイトの容量を占めることがあります。大容量ファイルの転送と解析を容易にするため、各ファイルは分割され、1 GBのTIFF画像ファイルセグメントとしてエクスポートされます。取得した画像を解析するには、いくつかの画像解析ソフトウェアプログラムのいずれかを使用してください。強度退色補正（intensity bleach correction）や、gag punctaの自動および手動トラッキングを含む画像解析の詳細については、付属の書面プロトコルを参照してください。混合後10〜15分以内に、HIV gag IGFPを発現したジャークキャット細胞が一次CD4陽性T細胞に接着する様子を可視化できます。これらの接合体を用いて、感染細胞および標的細胞におけるgag punctaの動きを評価することが可能です。シナプス形成後30分から3時間以内に、CellTrackerでラベル化された標的細胞内へgag IGFP punctaが移動する様子が観察されます。T細胞間におけるHIVの細胞間移行を視覚化する方法について説明しました。これらの手順を行う際は、HIV発現細胞に曝露したサンプルを取り扱う際、バイオセーフティーレベル2+またはバイオセーフティーレベル3のすべての予防措置を遵守することが非常に重要です。また、トランスフェクションを最適化するために、適切に維持されたJCA細胞とエンドトキシンフリーDNAを使用することを忘れないでください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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HIVとライブ共焦点顕微鏡の蛍光クローンを使用して、HIVの可視化細胞間伝達

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