アクリルアミド系ハイドロゲルを用いた細胞機能のマトリックスの剛性の影響を研究

アクリルアミドハイドロゲルを用いたin vivo組織コンプライアンスのモデル化。これは、最初に反応性ボトムカバースリップとシリコン処理トップカバースリップを生成することによって達成されます。手順の2番目のステップは、アクリルアミドヒドロゲルを注ぎ、作成することです。

手順の3番目のステップは、選択した細胞外マトリックスタンパク質をハイドロゲルに架橋することです。手順の最後のステップは、細胞のインキュベーションと分析です。最終的には、免疫蛍光顕微鏡、リアルタイム定量PCR、ウェスタンブロッティングを用いた解析を通じて、in vitroでのさまざまな細胞外マトリックスコンプライアンスが細胞の挙動をどのように制御するかを示す結果を得ることができます。

今日は、アクリルアミドハイドロゲルの生成と使用の手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用して、細胞外マトリックスの硬さを研究し、細胞の形態、細胞シグナル伝達、および増殖を調節しています。それでは始めましょう。

この手順は、反応性カバースリップを生成することから開始します。まず、150mmのシャーレの下半分にパラフォームの層を置きます。次に、最大9つのオートクレーブ25ミリメートルカバースリップをパラフィルムに移し、1ミリリットルの0.1モル水酸化ナトリウムで覆います。

カバースリップを3分間インキュベートします インキュベーション後、各カバースリップに3つのアミノプロファイルトリメチルまたは3つのA-P-T-M-Sの0.5ミリリットルのケミカルフードピペットで動作する真空ラインで水酸化ナトリウムを吸引します。カバースリップを3分間インキュベートし、次に3つのA-P-T-M-Sを吸引します。カバーに泡が形成されないように、インキュベートしすぎないように注意してください。

治療後のスリップ。同じ皿に20ミリリットルの脱イオン水でカバースリップを一度すすぎます。湾曲した鉗子を使用してカバースリップを皿から取り外し、処理された面を新しい150ミリメートルの皿に向けて移します。

次に、カバースリップを脱イオン水で再度洗い、ロッカーに10分間置きます。インキュベーション後、水を取り除き、さらに2回洗浄します。グルタルアルデヒドと反応してグルタルアルデヒドに使用する10分前に濁った白い沈殿物が残らないように、3つのA-P-T-M-Sをすべて除去することが非常に重要です。

湾曲した鉗子を使用して、カバースリップをparamで層状にされた清潔な皿に移し、真空ラインを使用して残りの液体を吸引し、次に各カバースリップを滅菌脱イオン水で0.5ミリリットルの0.5%グルタルアルデヒドで完全に覆い、3つのA-P-T-M-Sとポリアクリルアミドゲルを架橋します。カバースリップを化学フードで30分間インキュベートします。次に、グルタルアルデヒドを吸引し、すすぎ、カバースリップを脱イオン水で再度洗います。

次に、カバースリップを完全に乾かします。クロロホルムと岩石に10%の表面シール溶液が入った50ミリリットルのファルコンチューブに新しいカバースリップを少なくとも10分間追加します。表面シール溶液をデカントし、風乾します。

カバーは、ハイドロゲルがハイドロゲルの準備を開始するために準備される生物学的安全キャビネット内のキムワイプに滑ります。湾曲した鉗子を使用して、カバースリップの反応性面を生物学的安全キャビネットの表面にテープで留められたパラフォームのシートに移します。カバースリップがパラフォーム表面で平らになっていることを確認してください。

次に、少量のNHSを十分なトルエンに溶解することにより、飽和したヒドロキシCIN助剤またはトルエン中のNHS溶液を調製します。特定の実験では、NHSが溶解しなくなるまで少量のNHSを追加します。飽和溶液は通常、濁りとピンク色です。

次に、アクリルアミドBISアクリルアミド水とPSを調製して、目的のアクリルアミドの割合に到達します。書面によるプロトコルに概説されているように、試薬をマイクロユースチューブに追加します。その後、一度に1つのアリコート。

NHSとTMmeを追加します。チューブを短時間かつすぐにボルテックスします 生物学的安全キャビネット内のカバースリップあたり140マイクロリットルを使用して、3〜5個のゲルを注ぎます。SILICONIZEDの25mmカバースリップを各ゲルの上に素早く置き、重合を始めます。

トップカバースリップを追加すると、アクリルアミドがボトムカバースリップを完全に覆うことができます。このサンドイッチを室温でアクリルアミドが重合するまでインキュベートし、重合がいつ発生したかを判断します。マイクロ遠心分離チューブ内の残留アクリルアミド溶液を確認します。

重合には、硬いゲルの場合は数分、柔らかいゲルの場合は少し時間がかかります。重合が起こったら、滅菌手袋を着用してサンドイッチを慎重に手に取ります。次に、重合ゲルがはみ出すまでトップカバースリップをスライドさせて外します。

次に、カバーをこじ開けます。ゲルを滑り落ちさせ、トップカバースリップを捨てます。以下、ハイドロゲルと呼ぶ各底部ゲルカバースリップを6ウェルプレートに入れます。

次に、6ウェルプレートのウェルあたり2ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水またはPBSを加えます。次に、ヒドロゲルをPBSで洗浄し、ロッカーで5分間インキュベートします。この洗浄を2回繰り返します。

実験を開始するには、各ヒドロゲルを2ミリリットルのフィブロネクチン溶液または他の細胞外マトリックスタンパク質で覆います。タンパク質をハイドロゲル上で摂氏4度で一晩インキュベートし、ECM溶液を吸引した後、ハイドロゲルに共有結合します。次に、無反応培地中の活性化脂肪酸を含まないウシ血清アルブミンを加熱して1ミリグラムあたり1ミリグラムで非反応性NHSをブロックし、摂氏37度で少なくとも30分間インキュベートします。

インキュベーション後、ハイドロゲルを滅菌PBSで一度洗浄します。次に、ウシ胎児血清を含む適切な培養培地で細胞をプレート化します。ここでハイドロゲルに。

マウス胚性線維芽細胞が使用されていることを確立します。ヒドロゲルに播種する細胞の数は、細胞の広がりの程度と実験に必要なコンフルエンスに基づいて決定します。ウェスタンブロットおよび定量PCR解析に必要な約10〜5個の細胞。

次に、特定の細胞タイプに適した条件下で細胞をインキュベートします。インキュベーション期間終了後。必要に応じて細胞タンパク質またはmRNAを抽出します。

100マイクロリットルの液滴の溶解バッファーをラボベンチのパラフォームシートにピペットで固定し、各液滴の間に約2〜3センチメートルの間隔を空けます。次に、底蓋スリップをウェルから持ち上げて、各ヒドロゲルを慎重に取り除きます。湾曲した鉗子を使用し、細胞面を下にして液滴の上に置きます。

細胞を溶解バッファーと正確に1分間インキュベートします。最後に、カバースリップを取り外し、溶解バッファーをマイクロ遠心チューブに移します。あるいは、RNAを抽出するときは、各ハイドロゲルを新しい6ウェルプレートに移し、ウェルごとに1ミリリットルのトリアゾールを追加します。

インキュベーション後、ゲルを3分間インキュベートします。トリアゾール溶液を取り出して、マイクロ遠心チューブに保管します。A-P-T-M-Sを添加した後のカバースリップの徹底的な洗浄は、反応性カバースリップを製造するための重要なステップです。

適切に洗浄され、乾燥したカバースリップには、沈殿物の残留物がありません。A-P-T-M-Sはグルタルアルデヒドと反応し、白い曇った沈殿物を生成します。沈殿した場合は、カバースリップが使用できなくなるため、すべての手順を繰り返す必要があります。

ハイドロゲルの形成とECMタンパク質によるコーティングに続いて、一晩で細胞を播種します。染色中のフォイドで見られるように、硬いヒドロゲル上に広がる細胞と柔らかいヒドロゲルに広がる細胞と、柔らかいハイドロゲルと比較して硬い細胞に広がるマウス胚性線維芽細胞細胞との間には明確な違いがあります。実際、柔らかいハイドロゲルに付着するほとんどの細胞はコンパクトなままで、結合効率が低くなります。

マウス胚性線維芽細胞におけるサイクリングD one mRNAレベルの代表的な定量的PCR結果は、サイクリングD oneが硬いマトリックスでは有意にアップレギュレーションされるが、柔らかいマトリックスでは発現しないことを示しています。このことは、マトリックスの硬さがin vitroで細胞周期の進行を制御していることを示唆しています。私たちはちょうどこの手順を行うときにこの手順を行うことが重要であるとき、事故やエラーが発生するので余分な反応性カバースリップを作ることを覚えておくために、ヒドロゲル切断剛性を生成する方法を示しました。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。