Name: メカノキューの影響をデカップリングするためのヒドロキシのPAAmハイドロゲルの調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学ぶヒドロキシPAAmハイドロゲルの調製法。PDMSスタンプを用いたマイクロコンタクトプリンティングでECMタンパク質を固定し、細胞マイクロ環境のパラメータを独立制御してメカノトランスダクションを研究する。

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この研究は、ベルギー国立科学研究財団(F.R.S.-FNRS)の「MIS共焦点顕微鏡法」、「Crédit aux Chercheurs」助成金、および「Nanomotility FRFCプロジェクト」(no. 2.4622.11)を通じて支援されました。T.G.博士研究員は、Foundation for Training in Industrial and Agricultural Research（FRIA）の支援を受けています。著者らは、機械的特性評価のためのSylvain Desprez氏と共焦点イメージングのためのGéraldine Circelli氏に感謝します。

1ガラスカバースリップの表面を活性化<ol><li>ペトリ皿とスミア（推奨化学ヒュームフード）で5分間、その上に、0.1MのNaOH溶液中でガラスの円形カバースリップ（直径25mm）。 </li><li> NaOH溶液を外し、静かに無菌培養フード内で揺動板に揺動しながら、完全に20分間、無菌のddH 2 Oでカバースリップを浸す。 </li><li>無菌のddH 2 Oを排出し、ステップ1.2を繰り返します。 </li><li>無菌ピンセットでカバーガラスを取り外して、活性化した顔を上にして新しいペトリ皿に配置します。 </li><li>高純度窒素ガスの定常流の下で乾燥したカバースリップ。 </li><li>無菌培養フードでは、1時間カバースリップの活性化された側の3-（トリメトキシシリル）プロピルアクリレート（92％）の薄層を汚す。 </li><li>広範囲に無菌のddH 2 Oを3回洗浄したカバーガラスを洗浄し、新しいシャーレに無菌のddH 2 Oでそれらを浸す。 </li><li>ペトリ皿をタップそしてパラフィルムで10分間穏やかに攪拌しながらロッカープレートの上に置きます。 </li><li>細かいヒントを、滅菌ピンセットでのddH 2 Oからのカバーガラスを取り外して、活性化した顔を上にして新しいペトリ皿に配置します。 </li><li>カバーガラスに付着するほこりを避けるために、アルミホイルで乾燥した場所に、室温で保管してください。 </li></ol>ヒドロキシのPAAmハイドロゲルの調製<ol><li> 1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブ中のN-ヒドロキシエチルアクリルアミド（HEA）65mgの重量を準備します。それは、新鮮なHEA溶液を調製することが重要です。 </li><li> HEAに50mMのHEPES緩衝液1mlを加え、完全に溶解するまでのHEAボルテックスを使って混ぜる。 </li><li>希望ヒドロゲルの剛性に到達するために（ 表1参照）のHEPESアクリルアミド溶液およびHEPESビスアクリルアミド溶液中のw / wの2％の必要な数量のw / wの40％の400を添加する。最終容量5mlに50 mMのHEPESで調整する。 </li><li>ボルテックスと脱ガスを使用して溶液を混ぜるヒドロキシ-PAAmを重合を防止し、溶液内の酸素濃度を減少させるために20分間真空チャンバー内。 </li><li>無菌フード下では、それを滅菌するために、0.2μmの孔径のフィルターと脱気溶液を濾過。 </li><li> 7分間のUV /オゾンクリーナー円形カバーガラス（直径22mm）をアクティブにします。 </li><li> 10％硫酸アンモニウム（APS）溶液100μlを準備し、それを100μlのddH 2 O中に10mgのAPSですこれは、新鮮なAPS溶液を調製することが重要である。 </li><li>重合を開始し滅菌ヒドロキシのPAAm溶液（ステップ2.5）にテトラメチレンジアミン2.5μlの（TEMED）とAPS溶液25μlを追加します。無菌条件下で、気泡を導入せずに3連続したピペッティングにより溶液を混ぜる。 </li><li>無菌フード下では、（ステップ1.9から入手可能）25mmのカバースリップ上のヒドロキシのPAAm溶液25μl滴を配置し、すぐに22ミリメートルGLを置くヒドロキシ-PAAmをソリューションを絞る液滴の上に（ステップ2.5に調製した）お尻のカバースリップ。無菌ピンセットで22ミリメートルのガラス製カバースリップを中央にして気泡を滑らかに。 </li><li>ヒドロキシのPAAmハイドロゲルは、室温で15分間重合させた。重合プロセスの完了を追跡する手動エッペンドルフチュー​​ブ内の残りのヒドロキシのPAAm水溶液を反転させる。 </li><li>完全無菌のddH 2 Oでカバーガラスを浸すと、慎重に22ミリメートルのガラス製カバースリップおよびヒドロキシのPAAmハイドロゲル層との間にカミソリの刃のエッジを導入することにより、22ミリメートルのカバーガラスを分離する。 </li><li>滅菌PBS（PBSの3取引所）とヒドロキシのPAAmハイドロゲルを洗浄し、ゲルが完全に水分補給を維持するために、無菌PBS中に浸漬してみましょう。 </li><li>最大3日間4℃で滅菌PBS中のヒドロキシ-PAAmをヒドロゲルに保管してください。 </li></ol> 3ポリジメチルシロキサン（PDMS）Microstamp製作注：シリコンマスターの製造は、駅の前に必要とされるPDMSのmicrostamp製造を室温。シリコンマスターのこの微細加工は、特殊な装置や訓練を必要リソグラフィ技術によって行うことができる。ナノ加工施設とのコラボレーションは、シリコンマスターを製作することをお勧めします。代わりに、オンデマンドでカスタムメイドの微細構造のシリコンマスターを製作する会社に連絡してください。これは、シリコンマスターの製造は一度だけ実行される必要があることに留意することが重要である。実際に、微細構造のシリコンマスターが、エラストマースタンプを生成するために無期限に使用することができる。 <ol><li> 10にPDMSと硬化剤を混合する：プラスチックビーカー中に1の比率で10分間、ピペットを用いて完全に混合する。 </li><li>ステップ3.1の間に形成された気泡を除去するために真空下でPDMS混合物を脱気。 </li><li>シャーレ内の微細構造のシリコンマスターを配置し、気泡を形成することなく、その上に脱気したPDMS混合物の10 mmの厚さの層をキャスト。 </li><li>で、60℃で2時間、PDMSを治すLETオーブン。 </li><li>ほこりのない環境では、剥離PDMS層と物品税メスで1cm 2の microstamps。 </li><li>鉗子を使用して、場所PDMSをペトリ皿にパターンアップmicrostamps。 </li></ol> 4。マイクロパターニングヒドロキシ - のPAAmハイドロゲル<ol><li> 15分間のエタノール/水（50:50）溶液中超音波処理中に置きのPDMS microstampsを。 </li><li>窒素流流でスタンプを乾燥させ、それらを7分間UV /オゾンクリーナーパターンアップ（λ&lt;200 nm）を配置します。 </li><li>無菌フード下で、1cmの2 PDMSスタンプの微細構造表面上に所望のタンパク質溶液（ 例えば 、100μg/ mlのラミニンPBS中または25 / mlのフィブロネクチンPBS中）の150μlのドロップを置きます。 </li><li>オプション：細胞 - リガンド密度を調節するために、タンパク質溶液の濃度を変更します。 </li><li>の各コーナーに向かってピペットの先端を無菌でそれを移動させることによって、スタンプ表面を横切るタンパク質溶液を広げるスタンプ。 </li><li>無菌フード下で60分間PDMSスタンプに吸着するタンパク質溶液のままにしておきます。タンパク質損傷を避けるため、ランプをオフにします。 </li><li>無菌フード下では、ペトリ皿に（ステップ2.13から入手可能）、ヒドロキシPAAmをコーティングしたカバースリップを転送します。 </li><li>無菌条件下での低窒素流でヒドロキシ-PAAmを基材の表面から過剰のPBSを削除します。とすぐにゲル表面に水を立っての証拠が観察されないように手続きを停止します。ゲルは、この段階で完全に乾燥してはならない。 </li><li>乾燥は、慎重にPDMSの構造化表面は、高純度窒素ガスの定常流でスタンプ。 </li><li>ドレッシング組織鉗子を用いたタンパク質でコーティングされたスタンプをつかみ、乾燥したハイドロゲル表面に接触して構造化した表面に置きます。スタンプマイクロ構造およびヒドロゲル表面との間の良好な接触を確保するためにPDMSスタンプの上にピンセットの先端で簡単な圧力ポイントを適用します。 </li><li>目の上のPDMSスタンプのままに室温で1時間の電子化ヒドロゲル表面。 </li><li>静かにドレッシング組織鉗子でヒドロキシ - のPAAmハイドロゲルからPDMSスタンプを削除して、スタンプをきれいにするステップ4.1に従ってください。 </li><li>為替当たり10分間、無菌状態でのPBS 3の交換液（pH = 7.4）によって広く刻印ヒドロキシPAAmをハイドロゲルを洗ってください。 </li><li>オプション：他のECMタンパク質のさらなる微細パターンは、ステップ4.11〜4.5に従うことによってヒドロキシPAAmを表面に添加することができる。 </li><li>ロッキングプレート上穏やかな撹拌下、4℃で1夜の間に、PBS中5mg / mlのBSAの無菌溶液で不動態化非印刷ゾーン。 </li><li>交換につき10分間滅菌条件下でのPBS 3の交換液（pH = 7.4）で広く洗浄します。この段階では、スタンプさヒドロキシ-PAAmをヒドロゲルは、一週間まで4℃で保存することができる。 </li></ol>マイクロパターンヒドロキシPAAmをヒドロゲル上の5の細胞沈着<ol><li>めっき前cに30〜45分間、細胞培地中でカバースリップをインキュベートのエル。 </li><li> 37℃で滅菌したPBSで75cm 2の培養フラスコで培養接着細胞を洗浄し、トリプシン-EDTAまたは10分間ACCUTASE 3mlで、それを取り外してください。 </li><li> 650のx gで3分間、細胞懸濁液を遠心分離した細胞を含むフラスコにあなたの細胞株についての予め温めた完全増殖培地に適切な所望の量を転送する。 </li><li>マイクロピペットで上清を除去し、15-20,000細胞/ mlで完全培地中で細胞を懸濁します。 </li><li> （ステップ5.1から得られた）マイクロパターン化カバースリップに細胞溶液4mlを加え、37℃で培養インキュベーター中で細胞に覆われたカバースリップを置き、1〜2時間、5％の湿度。 </li><li>吸引し優しく付着していない細胞と培養液を交換してください。インキュベーターに付着した細胞を戻し、それらを（細胞型に応じて、3〜6時間）完全に広げてみましょう。 </li></ol>

<ol><li>Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+route+to+functionalize+polyacrylamide+gels+for+the+independent+tuning+of+mechanotransduction+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues.</a> Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).</li>
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</ol>

利益相反は宣言されていません。

現代の細胞生物学のin vitroでの観察の多くは、多くの場合、ECMタンパク質またはRGD配列を含む合成ペプチドの薄層で被覆された硬質ガラス製カバースリップ上で行われている。しかし、そのような基本的な培養基質は、細胞のメカノプロセスを研究するための正確なモデルを提供しないので、ECMの全体の物理化学の複雑さを再現していません。この問題に取り組むために、任意の所望の量およびECMタンパク質の性質二次元ヒドロゲルを官能化するための単純な代替案を提案する。この方法は、このようなマトリックスのこわばり、細胞形態および閉じ込めまたは細胞リガンド密度として、重要なメカノ合図を独立して制御することができます。また、ヒドロキシ-PAAmをヒドロゲルに固定化し、複数のECMタンパク質の空間分布を制御することができないことであり、現在の官能化法の最大の限界の一つを克服する。水力発電の高親和のためにXY-PAAmを生体分子のためのヒドロゲル、人はどんな補助装置を必要としないシーケンシャルmicroprintingsを使用することによって、関係なく、マトリックスの剛性を同一面上にさまざまなECMタンパク質の空間分布を制御することができます。...

局所的な細胞微小環境（ 例えば 、剛性、細孔径、タンパク質の性質、または細胞リガンド密度）の多くの局面は、運動性、細胞増殖、分化、および遺伝子発現のような細胞プロセスを制御する調節手がかりの座標セットを提供する。細胞外環境の物理化学的特性の改変は、細胞によって認識されると細胞の分極の変形、移動、および分化を含む、異なる生理学的結果を引き起こすことができる。これは、細胞が細胞の生化学的シグナルにECMの変更を変換する方法が、依然として不明である。したがって、主要な重要性メカノ経路を研究するための細胞とそれらの微小環境との間の相互作用を再現できるin vitroでの微小環境を制御操作することである。この問題に対処するために、容易に二ダイムを生成するために、ヒドロキシ-PAAmをヒドロゲルと呼ばれる新規な方法1を 、最近導入されている独立して重要なメカノキューを制御することが可能とnsionalソフト行列：行列のこわばり、セルの形状と閉じ込め、タンパク質の性質および細胞リガンド密度。 ECMはモルフォゲン（走化性）における勾配、接着性タンパク質（走触性）、および剛性（durotaxis）を介して細胞プロセスを指示します。過去数十年にわたり、in vitroでのプラットフォームの高度は、細胞が生理学的プロセス2-5に生化学的および生物物理学的特徴を翻訳することができますどのように引き出すために、これらの細胞外の合図を分離するために開発されてきた。電子ビーム6、フォトリソグラフィー7、光化学固定化8、またはプラズマ支援技法9は、マイクロパターン化基体上の生きている細胞の増殖を導くために開発されてきた。これらの技術は重要な結果が得られているが、それらのほとんどが細胞挙動に対する異なる手がかりの個別の影響の間の識別を許可しない彼らはいくつかの研究室は余裕ができるという技術的設備を必要とします。これらの技術の中でも、マイクロコンタクトプリント（μCP）は、細胞接着性ミクロの島10を作成するために、堅牢でアクセス可能な方法として浮上している。より最近では、多大な努力11-14は、生体組織において観察された剛性の広い範囲を再現するために調整可能な剛性を有するヒドロゲルでμCPの開発がなされてきた。これらの作品の中では、ポリアクリルアミド（PAAmを） を15普及し、すでに細胞バイオメカニクスアッセイのための最も一般的に使用されるポリマーベースのマトリックスの1つになっています。 PAAmを表面は一般的にN-スルホスクシンイミジル-6 - [4&#39;-アジド-2&#39;-nitrophenylamido]（スルホ-SANPAH）およびECMタンパク質は、スルホ-SANPAHニトロフェニルのUV活性化により表面に結合されているヘテロ二官能性架橋剤で官能化されアジド基16。別の技術は深刻な酸化されたタンパク質に結合ヒドラジンから成るヨウ素酸17。ハインドらはアクロイル-ストレプトアビジンモノマー18の存在下での光重合を必要とするタンパク質およびペプチドと生体模倣ハイドロゲルの表面をパターン化するための技術を導入した。より最近では、ツェンらは、1 -エチル-3 - [3 -ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDC）で活性化PAゲルをインキュベートするために必要な光学石英マスクを通してのPAAmのディープUV露光に基づいて新しい微細方法19を報告しているタンパク質を追加する前とN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）水溶液。長い合成方法（ 例えば 、透析、凍結乾燥など）、高価な化学化合物（ 例えば 、ヒアルロン酸、スルホ-SANPAH）または深UV：均質で再現性のあるタンパク質の微細パターンを作成するためにこれらの技術の能力にもかかわらず、それらのほとんどは、主要な制限を被る照射。また、これらの技術は、基板の剛性の独立した変調、微細パターンを許可しないジオメトリ、ECMタンパク質の性質、および細胞 - リガンド密度。 考慮にこれらの制限を考えると、私たちはソフトハイドロゲル上のタンパク質および生体分子の多様性の固定化を可能にし、細胞機能に及ぼす役割を解読するために、メカノキューとは独立してチューニングを可能にする新規かつシンプルなアクリルアミドベースのアプローチを開発しました。代わりに過酷な化学的化合物とのPAAmヒドロゲルの治療は、PAAmを重合中のヒドロキシル基を有する市販のアクリルアミドモノマーを導入する。この単純な操作は、他の技術的な要件なしのPAAmハイドロゲルの固有抗接着性を克服する。 水酸基の存在は水素結合相互作用を形成するタンパク質および生体分子のためのヒドロキシ-PAAmをヒドロゲルの高い親和性をもたらす。 μCPと組み合わせて、ヒドロキシ-PAAmをヒドロゲルは、独立した制御を備え​​た二次元培養プラットフォームの迅速な生成を可能にするメカノを研究するための強力なプラットフォームであると想定されているマトリックスの剛性、ECMタンパク質の種類、細胞リガンド密度と閉じ込められた接着性、オン。 このプロトコルの目的は、容易に材料科学の専門知識を持たない任意のヒドロキシPAAmをヒドロゲルを作製するために必要な情報を提供することにある。研究者は病態生理学的メカニズムに関与してメカノ経路のより良い理解につながる可能性が細胞および組織レベルでの生理学的に関連する質問をするための究極の目標は、手段を提供することである。

<table><tbody><tr><td>UV/オゾンフォトリアクター</td><td>紫外線 製品</td><td>PR-100</td><td></td></tr>型 <tr><td>ロッキングプレート</td><td>IKAcWerke</td><td>型KS 130 ベーシック</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス</td><td>科学産業</td><td>モデル ボルテックス Genie2</td><td></td></tr><tr><td>真空脱気室</td><td>応用真空工学</td><td>DP-8-KIT</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>細い先端のステンレス鋼鉗子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z225304-1EA</td><td></td></tr><tr><td>ドレッシング組織鉗子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4392-1EA</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレンのシャーレ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5731-500EA</td><td></td></tr><tr><td>アルミホイル、厚さ0.5&nbsp;mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>266574-3.4G</td><td></td></tr><tr><td>アイソポア メンブレン フィルター (0.2 &micro;細孔径)</td><td>Millipore</td><td>GTTP フィルターコード</td><td></td></tr><tr><td>丸型ガラスカバースリップ(直径22mm)</td><td>Neuvitro</td><td>GG-22</td><td></td></tr><tr><td>丸型ガラスカバースリップ(直径25mm)</td><td>Neuvitro</td><td>GG-25</td><td></td></tr><tr><td>可変容量マイクロピペット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z114820</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質微量遠心チューブ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505-100EA</td><td></td></tr><tr><td>メスハンドル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2896-1EA</td><td></td></tr><tr><td>メスブレード</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2771-100EA</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ (75 cm2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641</td><td></td></tr><tr><td>超音波バストレイ、固体(ステンレス鋼)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z613983-1EA</td><td></td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン&nbsp;</td><td>ダウコーニング</td><td>シルガード184シリコーンエラストマーキット</td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミド(粉末)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A3553</td><td></td></tr><tr><td>N、N'-メチレンビス(アクリルアミド)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>N-ヒドロキシエチルアクリルアミド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>697931</td><td></td></tr><tr><td>N、N'、N'、N'-テトラメチルエチレンジアミン</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アモニウム (APS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>3-(トリメトキシシリル)プロピルアクリル酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1805</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血漿 フィブロネクチン</td><td>ミリポア</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>EHSからのラミニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465-25G</td><td></td></tr><tr><td>二蒸留水(ddH2O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>内皮細胞増殖培地</td><td>細胞 アプリケーション</td><td>211K-500</td><td></td></tr><tr><td>ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)</td><td>Invitrogen</td><td>C-003-5C</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA laboratories</td><td>L11-007</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 緩衝液 1 M in H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌薬</td><td>PAA 研究所</td><td>P11-002</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>PAA 研究所</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ファロイジン</td><td>分子プローブ</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>マウスで産生される抗ビンキュリン抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V9131</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス抗体-テトラメチルローダミン</td><td>分子プローブ</td><td>T-2762</td><td></td></tr><tr><td>抗フィブロネクチン(ウサギ)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3648</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41469</td><td></td></tr><tr><td>抗ラミニン抗体 (ウサギ)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギ IgG-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7512</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924-100ML</td><td></td></tr><tr><td>無水エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844-2.5L</td><td></td></tr></tbody></table>

メカノキューの影響をデカップリングするためのヒドロキシのpaamハイドロゲルの調製

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

現在では、多くの細胞機能は、それらの細胞外マトリックス（ECM）環境の物理化学的および機械的な手がかりを用いた細胞の相互作用によって調節されることが確立されている。真核細胞は、常に、遺伝子発現の特定の変化を達成するために、生化学的シグナルにECMの物理的変化を形質導入し、これらの信号を統合するために、表面mechanosensorsを通じて局所微小環境を感知する。興味深いことに、互いにECM缶のカップルの物理化学的及び機械的パラメータは、細胞の運命を調節する。そのため、メカノを理解する鍵は、細胞機能上のECM手がかりの相対的な寄与を分離することです。 ここでは、迅速かつ容易にin vitroでのメカノ手がかりから独立チューニングのための生物学的に関連するヒドロゲルを生成するために、詳細な実験プロトコルを提示します。私たちは化学的に修飾されたポリアクリルアミドハイドロゲル（PAAmを）は、それらの本質的に非adhesを克服するために重合中にヒドロキシル官能アクリルアミドモノマーを組み込むことによって特性をアイブ。私たちは、ECMタンパク質の任意の所望の性質の固定化を可能にするヒドロキシPAAmを呼ばれる小説のPAAmハイドロゲルを、取得した。マイクロコンタクトプリンティング、ヒドロキシ-PAAmをヒドロゲルの組み合わせは、独立して、単一細胞の形態、マトリックス剛性、性質およびECMタンパク質の濃度を制御することを可能にする。私たちは、in vitro細胞メカノ過程で勉強するすべての生物学の実験室で設定することができ、簡単で迅速な方法を提供する。今後は、ECMの剛性と核との間の機械的結合を実証する内皮細胞上の実験を行うことにより、この新規二次元のプラットフォームを検証します。

図1Aは、ランダムラジカル重合によって埋め込 ​​まヒドロキシル基（水酸基のPAAm）、ポリアクリルアミドの親水性ネットワークを形成された一次ヒドロキシル基を含むN-ヒドロキシエチル（HEA）モノマーとアクリルアミドの共重合（AAM）を提示し、ビスアクリルアミド（ビス-AAmと） 。このプロトコルでは、HEAの重量65 mgのHEPESの1ミリリットルの容量で希釈しなければならない。 HEAの密度は1にほぼ等しいことを知って、私たちは1065液（HEA + HEPES）の作業容量を取得することを前提としています。 表1に示したように、AAmと400μlのとbisAAm50μlのに1065μlの総付加は、1515μlの容量につながる。したがってHEPESの3,485μlの容量を5mlの最終容量に対する解決策を調整するために必要とされる。ステップ2.6に示すように、22ミリメートルのカバーガラスの表面を生じさせることなく、それを除去するために、UV /オゾンでの7分の間に活性化されなければならないヒドロゲル表面への損害。実際に、ガラス表面は、UV /オゾン処理した後に、よ...

私たちは、最小限のコストや専門知識を持つECMタンパク質の直接結合を可能にするヒドロキシPAAmを呼ばれる新しいポリアクリルアミドハイドロゲルを、提示します。マイクロコンタクトプリント法でヒドロキシ - のPAAmハイドロゲルの組み合わせは、細胞のmechanostransductionを研究するための天然の細胞の微小環境の多くの手がかりを独立して制御を容易にします。

メカノキューの影響をデカップリングするためのヒドロキシのPAAmハイドロゲルの調製

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

本手順の全体的な目的は、細胞微小環境のさまざまなパラメータを独立して制御するために、任意の標的タンパク質をポリアクリルアミドハイドロゲル上に固定化するための簡便かつ効率的な戦略を開発することです。これは、まずタンパク質溶液をPDMSスタンプ表面に広げることで達成されます。次のステップでは、高純度窒素ガスの安定した気流を用いて、PDMSスタンプの構造化された表面を慎重に乾燥させます。次に、タンパク質でコーティングしたスタンプの構造面を乾燥させたハイドロゲル表面に接触させ、PDMSスタンプの上部から軽く圧力を加え、スタンプのマイクロフィーチャーとハイドロゲル表面を密着させます。最終ステップとして、PDMSスタンプをハイドロゲル表面から慎重に取り除き、非プリント領域の処理後にスタンプを洗浄します。BSAを用いて、マイクロパターン化されたハイドロゲル表面に細胞を播種できます。最終的に、倒立蛍光顕微鏡を用いてタンパク質のマイクロフィーチャーを観察します。この手法は、細胞外マトリックスの特性（例えば、剛性、細胞リガンド密度、あるいはタンパク質の性質など）の相対的な寄与など、メカノトランスダクション分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。アノトランスダクションのプロセスにおいて、この手順は化学薬品用ドラフトチャンバー内で行うことが推奨されます。まず、直径25 millimeterの円形ガラスカバースリップをペトリ皿に配置し、0.1 molar 水酸化ナトリウム溶液を塗布して5分間放置します。水酸化ナトリウム溶液を取り除き、カバーガラスを滅菌超純水に完全に浸し、ロッキングプレート上で20分間緩やかに揺らす。滅菌超純水を捨て、さらに滅菌超純水を加えてカバーガラスを完全に浸し、もう一度20分間緩やかに揺らす。滅菌ピンセットでカバーガラスを取り出し、新しいシャーレに移す。活性化面を上に向け、高純度窒素ガスの定常流でカバーガラスを乾燥させる。カバーガラスを乾燥させた後、再び滅菌カルチャーフードに戻し、各カバーガラスの活性化面に3-トリメチルプロピルアクリルを薄く塗布します。1時間そのままにしておきます。その後、滅菌DD H2Oでカバーガラスを十分に洗浄します。次に、新しいペトリ皿に入れた滅菌DD H2Oにカバーガラスを浸します。ペトリ皿をパラフィルムで密閉し、ロッキングプレートに乗せて10分間緩やかに撹拌します。最後に、先端の細い滅菌ピンセットを使用して、カバーガラスをDD H2Oから新しいペトリ皿に移します。活性面を上にします。カバースリップに埃が付着するのを防ぐため、ディッシュをアルミホイルで覆い、室温の乾燥した場所に保管します。この手順を開始するには、5 mLの滅菌済みヒドロキシポリアクリルアミドハイドロゲル溶液と、100 µLの調製直後の10%過硫酸アンモニウム溶液

preparation-hydroxy-paam-hydrogels-for-decoupling-effects

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

細胞機能上の基層の剛性の影響をモデル化することができます...

アクリルアミド系ハイドロゲルを用いた細胞機能のマトリックスの剛性の影響を研究

このビデオでは、内皮細胞を介した細胞外マトリックスの硬さ依存性リステリア菌の播種を評価するための定量的なタイムラプス顕微鏡法を紹介しています。より柔らかいヒドロゲルは、硬いヒドロゲルと比較して、内皮細胞を介した細菌の拡散を容易にし、マトリックスの硬さが細菌の播種に及ぼす影響を強調しています。...

細胞外マトリックスの硬さ依存性細菌播種を評価するための定量的タイムラプス顕微鏡法

ここでは、マルチウェルプレートフォーマットのポリアクリルアミドゲルの迅速、効率的、安価な調製を可能にする方法について説明しています。この方法は特別な機器を必要とせず、どの研究室でも簡単に採用できます。これは、剛性依存性の細胞応答の理解に焦点を当てた研究に特に役立ちます。...

剛性依存性細胞応答の研究のための簡単​​なポリアクリルアミド系マルチウェル剛性アッセイ

この方法は、光重合を用いてクリック化学の手法を提供するポリエチレング リコール (PEG) ゲルの表面にタンパク質やペプチドのパターンを作成する生体外での細胞の研究のため生体信号を固定化、.

生理活性タンパク質や生物学的応用の光化学ハイドロゲルのペプチドをパターニング

付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性をプロービングのためのウェル フォーマット...

付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性を勉強するためのウェル フォーマット ポリアクリルアミドを用いたアッセイ

カプセル化、poly(ethylene glycol) (PEG) ゲル修飾と蛍光マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP) の細胞を培養するためのプロトコルを提示するここでは、-分解性ペプチド。携帯電話の MMP と代謝活性は、標準的なマイクロ プレート...

世界的な細胞のマトリックスメタロプロテアーゼと 3 D ゲルの代謝活性を測定

ここでは、ギャップ接合コネクシン43を破壊する力学ベースのプロトコルを提示し、トラクションと細胞間応力の観察を通じて内皮バイオメカニクスに及ぼすその後の影響を測定する。...

コネクシン43構造破壊による内皮バイオメカニクスの摂動

多能O9-1神経堤細胞と様々な剛性のポリアクリルアミドヒドロゲルを使用して 、インビトロで 機械的信号を研究するための詳細なステップバイステッププロトコルについて説明します。...

神経堤細胞の機械的信号を研究するための最適化されたO9-1/ヒドロゲルシステム

近紫外線リソグラフィーとトラクションフォース顕微鏡を組み合わせて、マイクロパターン化されたヒドロゲル上の細胞力を測定します。単一細胞のターゲット光誘導放出により、同じサンプル上で多数の測定が可能になります。...

牽引力顕微鏡における応用のためのハイドロゲルパターン法を用いた細胞接着制御

ここでは、上皮組織恒常性の電気機械的調節を研究するために、独自の2層マイクロ流体デバイスを製造するためのプロトコルを提示します。この装置は、組織面に垂直な静的な生理学的電流を印加し、細胞間の接着、増殖、および押し出しに影響を与えます。生細胞イメージングと機械的ストレス測定により、これらのプロセスのメカニズムが明らかになります。...

2層マイクロ流体デバイスを用いた組織恒常性の電気機械制御の解明

学ぶヒドロキシPAAmハイドロゲルの調製法。PDMSスタンプを用いたマイクロコンタクトプリンティングでECMタンパク質を固定し、細胞マイクロ環境のパラメータを独立制御してメカノトランスダクションを研究する。

メカノキューの影響をデカップリングするためのヒドロキシのPAAmハイドロゲルの調製

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