メカノキューの影響をデカップリングするためのヒドロキシのPAAmハイドロゲルの調製

この手順の全体的な目標は、細胞微小環境のさまざまなパラメータを独立して制御するために、ポリアクリルアミドハイドロゲル上に関心のあるタンパク質を固定化するためのシンプルで効率的な戦略を開発することです。これは、まずタンパク質溶液をPDMSスタンプ表面全体に広げることによって達成されます。2番目のステップは、高純度窒素ガスの安定した流れでPDMSスタンプの構造表面を慎重に乾燥させることです。

次に、タンパク質被覆スタンプは、乾燥ヒドロゲル表面と接触する構造化された表面とともに配置され、短い圧力ポイントがPDMSスタンプの上部に適用されて、スタンプのマイクロ機能とハイドロゲル表面との間の良好な接触を確保し、最終的なステップは、ヒドロゲル表面からPDMSスタンプを穏やかに除去し、スタンプをきれいにすることです非印刷ゾーンのオン後。BSAを使用すると、細胞をマイクロパターンのヒドロゲル表面に着座させることができます。最終的には、倒立型蛍光顕微鏡を使用して、タンパク質の微小な特徴を観察します。

この方法は、細胞外マトリックス特性の相対的な寄与、例えば、剛性、細胞ライゴン密度、タンパク質の性質など、メカノ形質導入分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。anoトランザクションプロセスでは、この手順を化学ヒュームフードで実行することをお勧めします。まず、直径25mmの円形ガラスカバースリップをシャーレに入れ、0.1モルの水酸化ナトリウム溶液を5分間塗ります。

水酸化ナトリウム溶液を除去し、完全に無菌DD H2Oにカバースリップを浸し、ロッキングプレート上で20分間穏やかに揺さぶり、滅菌DDH 2 Oを排出し、さらに滅菌DDH 2 Oを追加してカバースリップを完全に浸し、さらに20分間穏やかに揺さぶる。滅菌ピンセットでカバースリップを取り外し、新しいペトリ皿に入れます。活性化された面を上にして乾かすと、カバーは高純度の窒素ガスの安定した流れで滑ります。

カバースリップが乾いたら、滅菌培養フードに戻し、各カバーの活性化面に3つのトリメチルプロピルacrlの薄い層を塗ります。1時間後に1時間滑ります。ガラスカバーのスリップは、滅菌済みのDD H2Oで広範囲に洗浄します。

次に、カバースリップを滅菌済みのDD H2Oに新しいシャーレに浸します。ペトリ皿をパラフィルムで密封し、10分間穏やかに攪拌しながらロッキングプレートに置きます。最後に、先端が細い滅菌ピンセットを使用して、カバースリップをDDH two Oから新しいペトリ皿に移します。

アクティブ化されたものを上にして。カバースリップにほこりが付着しないように皿をアルミホイルで覆い、乾燥した場所に室温で保管してください。この手順を開始するには、5ミリリットルの滅菌ヒドロキシポリアクリルアミドヒドロゲル溶液と100マイクロリットルの新鮮な10%アンモニウム/硫酸溶液を準備します。.

プロトコルのテキストに記載されているように、2.5マイクロリットルのテトラメチレンジアミンと25マイクロリットルの硫酸塩溶液あたりのアンモニウムをヒドロキシポリアクリルアミドヒドロゲル溶液に加えます。重合を開始するには、滅菌フードの下で無菌条件下で気泡を導入せずに3回連続してピペッティングして溶液を混合し、25ミリメートルの円形カバースリップに25マイクロリットルのヒドロキシポリアクリルアミドヒドロゲル溶液を滴下し、すぐに液滴の上に22ミリメートルの円形ガラスカバースリップを置いてヒドロキシポリアクリルアミドヒドロゲル溶液を絞ります。22mmガラスカバースリップは、以前はUVオゾンクリーナーに7分間さらされることで作動していました。

ガラスカバースリップを滅菌ピンセットで中央に配置し、気泡を滑らかにします。ヒドロキシポリアクリルアミドヒドロゲルを室温で15分間重合させます。チューブ内に残っているヒドロキシポリアクリルアミドヒドロゲル溶液を手動で反転させます。

重合プロセスの完了に続いて、カバースリップを滅菌D DH two oで完全に浸します。22ミリメートルガラスカバースリップとヒドロキシポリアクリルアミドヒドロゲル層の間にカミソリの刃の端を挿入することにより、22ミリメートルガラスカバースリップを慎重に分離します。ヒドロキシポリアクリルアミドヒドロゲルを滅菌PBSで3回洗浄し、ゲルを滅菌PBSに完全に浸して水分補給を維持します。

この手順で使用されるポリジメチルソーンまたはPDMSマイクロスタンプは、テキストプロトコルに記載されているように作製されました。PDMSマイクロスタンプを50〜50エタノール水溶液に入れ、15分間超音波処理します。窒素の流れの蒸気でスタンプを乾燥させ、UVオゾンクリーナーに7分間パターンアップします。

滅菌フードの下に、A-P-D-M-Sの微細な構造表面に150マイクロリットルの所望のタンパク質溶液を滴下します。このデモでは、Stamp FI nin を使用しています。滅菌ピペットチップでタンパク質溶液をスタンプの各角に向かって移動することにより、タンパク質溶液をスタンプ表面全体に広げます。

タンパク質溶液をPDMSスタンプに吸収するために60分間放置します。この滅菌フードの下で、タンパク質の損傷を避けるためにランプを消します。次に、ヒドロキシポリアクリルアミドヒドロゲルコーティングされたカバーを新しいシャーレに移します。

無菌条件下で、ヒドロキシポリアクリルアミドヒドロゲル基質の表面から余分なPBSを低窒素流で除去します。プロシージャを停止します。ゲル表面に水が溜まっている証拠が観察されなくなるとすぐに。

この段階では、ゲルを完全に乾燥させないでください。PDMSスタンプの構造表面を、高純度窒素ガスの安定した流れで慎重に乾燥させます。タンパク質被覆スタンプを包帯組織鉗子でつかみ、乾燥したヒドロゲル表面に接触するように構造化された表面を置きます。

PDMSスタンプの上部にあるピンセットの先端で短い圧力ポイントを印加して、スタンプのマイクロ機能とハイドロゲル表面との間の良好な接触を確保し、PDMSスタンプをハイドロゲル表面に1時間放置します1時間後に室温で。ヒドロキシポリアクリルアミドヒドロゲルからPDMSスタンプをドレッシング組織鉗子で静かに取り除き、エタノール水溶液で15分間淫行してスタンプを清掃します。スタンプされたヒドロキシポリアクリルアミドヒドロゲルを、PBSを3回交換して滅菌条件で10分間交換して広範囲に洗浄します。

最後のPBS洗浄後、BSAの滅菌溶液を加え、ロッキングプレート上で穏やかに攪拌しながら摂氏4度で一晩インキュベートします。これにより、翌日に印刷されないゾーンが食べられます。スタンプされたヒドロキシポリアクリルアミドヒドロゲルを、PBSを3回交換して滅菌条件で10分間交換して広範囲に洗浄します。

スタンプされたヒドロキシポリアクリルアミドハイドロゲルは、摂氏4度で最大1週間保存できます。結果は、ヒドロキシポリアクリルアミドヒドロゲルの剛性の進化とビスアクリルアミド架橋剤の量との間の線形相関を示しています 3つの異なる剛性のヒドロキシポリアクリルアミドヒドロゲル上に堆積したラミネート長方形のマイクロパターンのエピ蛍光画像は、マイクロパターンの形状とマトリックス剛性の独立したチューニングを示しています。細胞リガンド密度は、PDMSスタンプのインキュベートに使用したタンパク質溶液の濃度を変えることで調節できます。

ここに示されているのは、シーケンシャルマイクロコンタクト印刷からの2つの蛍光画像です。赤のフィブロネクチンと緑のラミニンの縞模様は、90度で交差し、フィブリンラミニンとコラーゲンの縞模様は、25キロのパスカルヒドロキシポリアクリルアミドヒドロゲル基質に順次マイクロプリントされています。初代細胞を均質にコーティングされたマイクロパターンのヒドロキシポリアクリルアミドヒドロゲル表面にプレーティングした場合、細胞生存率はプレーティング後3日まで少なくとも80%でした。

また、細胞は柔らかい基質と比較して硬い基質でより増殖することが観察されました。長方形のフィブロネクチンにめっきすると、3つの異なる剛性のヒドロキシポリアクリルアミドヒドロゲル上に堆積したマイクロパターンがコーティングされます。初代内皮細胞は、軟部ではアクチン線維密度が低く、丸みを帯びた核を示します。

より硬い基板上の基板、アクチン繊維はよりまっすぐで太く、核はその発達後に変形します。この技術は、初代細胞や幹細胞、組織レベル、モデル生物、ファッション、人口統計、臓器系など、幅広い細胞系における細胞微小環境のパラメータの個々の役割を探求するための、機械的形質導入の分野の研究者への道を開きました。