メカノキューの影響をデカップリングするためのヒドロキシのPAAmハイドロゲルの調製

本手順の全体的な目的は、細胞微小環境のさまざまなパラメータを独立して制御するために、任意の標的タンパク質をポリアクリルアミドハイドロゲル上に固定化するための簡便かつ効率的な戦略を開発することです。これは、まずタンパク質溶液をPDMSスタンプ表面に広げることで達成されます。次のステップでは、高純度窒素ガスの安定した気流を用いて、PDMSスタンプの構造化された表面を慎重に乾燥させます。

次に、タンパク質でコーティングしたスタンプの構造面を乾燥させたハイドロゲル表面に接触させ、PDMSスタンプの上部から軽く圧力を加え、スタンプのマイクロフィーチャーとハイドロゲル表面を密着させます。最終ステップとして、PDMSスタンプをハイドロゲル表面から慎重に取り除き、非プリント領域の処理後にスタンプを洗浄します。BSAを用いて、マイクロパターン化されたハイドロゲル表面に細胞を播種できます。最終的に、倒立蛍光顕微鏡を用いてタンパク質のマイクロフィーチャーを観察します。

この手法は、細胞外マトリックスの特性（例えば、剛性、細胞リガンド密度、あるいはタンパク質の性質など）の相対的な寄与など、メカノトランスダクション分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。アノトランスダクションのプロセスにおいて、この手順は化学薬品用ドラフトチャンバー内で行うことが推奨されます。まず、直径25 millimeterの円形ガラスカバースリップをペトリ皿に配置し、0.1 molar 水酸化ナトリウム溶液を塗布して5分間放置します。

水酸化ナトリウム溶液を取り除き、カバーガラスを滅菌超純水に完全に浸し、ロッキングプレート上で20分間緩やかに揺らす。滅菌超純水を捨て、さらに滅菌超純水を加えてカバーガラスを完全に浸し、もう一度20分間緩やかに揺らす。滅菌ピンセットでカバーガラスを取り出し、新しいシャーレに移す。活性化面を上に向け、高純度窒素ガスの定常流でカバーガラスを乾燥させる。

カバーガラスを乾燥させた後、再び滅菌カルチャーフードに戻し、各カバーガラスの活性化面に3-トリメチルプロピルアクリルを薄く塗布します。1時間そのままにしておきます。その後、滅菌DD H2Oでカバーガラスを十分に洗浄します。

次に、新しいペトリ皿に入れた滅菌DD H2Oにカバーガラスを浸します。ペトリ皿をパラフィルムで密閉し、ロッキングプレートに乗せて10分間緩やかに撹拌します。最後に、先端の細い滅菌ピンセットを使用して、カバーガラスをDD H2Oから新しいペトリ皿に移します。

活性面を上にします。カバースリップに埃が付着するのを防ぐため、ディッシュをアルミホイルで覆い、室温の乾燥した場所に保管します。この手順を開始するには、5 mLの滅菌済みヒドロキシポリアクリルアミドハイドロゲル溶液と、100 µLの調製直後の10%過硫酸アンモニウム溶液を用意します。

プロトコルの本文に記載されている通り、ヒドロキシポリアクリルアミドハイドロゲル溶液に、テトラメチレンジアミン2.5 µLと過硫酸アンモニウム溶液25 µLを加えます。重合を開始させるため、滅菌フード内の滅菌条件下で、気泡が入らないようにピペッティングを3回繰り返して溶液を混合します。次いで、ヒドロキシポリアクリルアミドハイドロゲル溶液を25 µL、直径25 mmの円形カバーガラス上に滴下し、直ちに直径22 mmの円形ガラスカバー slipsを滴上の上に置いて、ヒドロキシポリアクリルアミドハイドロゲル溶液を押し広げます。なお、この22 mmのガラスカバー slipsは、あらかじめUVオゾンクリーナーで7分間処理して活性化させておいたものを使用します。

滅菌ピンセットを用いてガラスカバースリップを中央に配置し、気泡をなくします。ヒドロキシポリアクリルアミドハイドロゲルを室温で15分間重合させます。チューブに残っているヒドロキシポリアクリルアミドハイドロゲル溶液を手動で反転させて混ぜ合わせます。

重合プロセスの完了を確認するため、カバーガラスを滅菌D DH₂Oに完全に浸します。カミソリの刃の端を22 mmガラスカバーガラスとヒドロキシポリアクリルアミドハイドロゲル層の間に挿入し、22 mmガラスカバーガラスを慎重に剥離させます。ヒドロキシポリアクリルアミドハイドロゲルを滅菌PBSで3回洗浄し、水和状態を維持するため、ゲルを滅菌PBSに完全に浸したままにします。

本手順で使用したポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロスタンプは、テキストプロトコルに記載する方法で作製しました。PDMSマイクロスタンプをエタノールと水の50:50溶液に入れ、15分間超音波洗浄します。窒素ガス流でスタンプを乾燥させ、パターン面を上にしてUVオゾンクリーナーに7分間置きます。

滅菌フード内で、A-P-D-M-Sのマイクロ構造表面に、目的のタンパク質溶液を150 µL滴下します。本デモンストレーションでは、FI ninスタンプを使用します。滅菌ピペットチップを用いて、溶液をスタンプの各隅に向かって動かし、スタンプ表面全体に広げます。

タンパク質溶液をPDMSスタンプに60分間吸着させます。タンパク質の損傷を防ぐため、この滅菌フード内の照明を消してください。次に、ヒドロキシポリアクリルアミドハイドロゲルをコーティングしたカバーガラスを新しいペトリ皿に移します。

無菌条件下で、低流量の窒素気流を用いてヒドロキシポリアクリルアミドハイドロゲル基材の表面から余分なPBSを除去します。ゲルの表面に水の溜まりが見られなくなった時点で、この操作を停止します。

この段階でゲルを完全に乾燥させてはいけません。高純度窒素ガスの安定した流れを用いて、PDMSスタンプの構造面を慎重に乾燥させます。タンパク質をコートしたスタンプをドレッシング組織鉗子で掴み、構造面を乾燥したハイドロゲル表面に接触させます。

ピンセットの先でPDMSスタンプの上部を軽く数か所押さえ、スタンプの微細構造とハイドロゲル表面が十分に接触するようにします。その後、室温で1時間、PDMSスタンプをハイドロゲル表面に放置します。ドレッシング用組織鉗子を用いて、ヒドロキシポリアクリルアミドハイドロゲルからPDMSスタンプを慎重に取り除き、エタノール水溶液中で15分間浸漬してスタンプを洗浄します。スタンプ転写後のヒドロキシポリアクリルアミドハイドロゲルを、滅菌条件下でPBSを3回交換し、1回につき10分間、十分に洗浄します。

最後のPBS洗浄後、BSAの滅菌溶液を加え、ロッキングプレートを用いて緩やかに撹拌しながら、4°Cで一晩インキュベートします。これにより、翌日の非プリント領域のブロッキングが行われます。スタンプされたヒドロキシポリアクリルアミドハイドロゲルを、滅菌条件下でPBSを3回交換し、1回あたり10分間ずつ十分に洗浄します。

スタンプ処置を施したヒドロキシポリアクリルアミドハイドロゲルは、4 °Cで最大1週間保存可能です。結果から、ヒドロキシポリアクリルアミドハイドロゲルの剛性の変化とビスアクリルアミド架橋剤の量との間に線形相関があることが示されました。3種類の異なる剛性を持つヒドロキシポリアクリルアミドハイドロゲル上に形成された積層矩形マイクロパターンの蛍光画像は、マイクロパターンの形状とマトリックスの剛性を独立して制御できることを証明しています。細胞リガンド密度は、PDMSスタンプのインキュベーションに使用するタンパク質溶液の濃度を変化させることで調節可能です。

ここでは、連続的なマイクロコンタクトプリンティングによって得られた2つの蛍光画像を示しています。赤色のフィブロネクチンと緑色のラミニンのストライプが90度で交差しており、さらにフィブリン、ラミニン、およびコラーゲンのストライプが25 kilo pascalのヒドロキシポリアクリルアミドハイドロゲル基板上に順次マイクロプリントされています。一次細胞を均一にコーティングされたヒドロキシポリアクリルアミドハイドロゲル表面およびマイクロパターン化された表面に播種したところ、播種後3日目まで細胞生存率は少なくとも80%でした。

また、細胞は軟らかい基質よりも硬い基質上でより増殖することが観察されました。3種類の異なる剛性を持つヒドロキシポリアクリルアミドハイドロゲル上に形成された、フィブロネクチンでコーティングされた長方形のマイクロパターンに播種したところ、一次血管内皮細胞は軟らかい基質上でアクチンフィラメント密度が低く、核が円形に近い形態を示しました。

より剛性の高い基質上では、アクチン繊維はより直線的で太くなり、核は発達後に変形します。この手法は、機械的刺激受容（メカノトランスダクション）分野の研究者が、初代細胞や幹細胞、組織レベル、モデル生物、あるいは臓器システムなど、幅広い細胞系において、細胞微小環境の各パラメータが果たす個別の役割を探索するための道を切り開きました。