Name: 剛性依存性細胞応答の研究のための簡単なポリアクリルアミド系マルチウェル剛性アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 学ぼう、ポリアクリルアミドゲルを用いたマルチウェルプレート剛性アッセイ法。簡便かつ低コストで細胞応答を評価し、神経科学や細胞生物学の研究に応用可能です。

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この研究は、セントルイス大学がシルヴィヤ・ズスティアク博士に提供したスタートアップ資金と、セントルイス大学がシルヴィヤ・ズスティアック博士に授与した学長研究基金（PRF）の助成金によって資金提供されました。技術支援を提供してくださったNaveed Ahmed氏とKeval Shah氏に感謝します。

ヒドロゲル関連ソリューションおよびアリコートの調製<ol><li>ポリアクリルアミドゲル前駆体溶液の調製。 <ol><li>アクリルアミド（A）を混合することにより、ポリアクリルアミドゲル前駆体溶液を製造（w / vの40％、Mは、rは 71.08グラム/モル）、架橋剤ビスアクリルアミド（B）（2％w / vの、Mは、154.17グラム/モルrの ）、およびデ表1に指定されたボリュームの割合でイオン水。 注：これらのソリューションは、大きなバッチで調製し、数ヶ月まで4℃で保存することができる。 <ol><li>注意：アクリルアミドは特に、とき粉末状の、吸入または摂取時に有毒である：従って、好ましくは、毒性のリスクを減らすためにw / v溶液40パーセントを使用します。そのような手袋、ゴーグル、そして白衣として、防護服を着ている間だけハンドル。冷蔵庫の中の光耐性、しっかりと密閉容器（&lt;23℃、換気の良い場所）に保管してください。 </li><li>注意：ビス ​​- アクリルアミドは特に、吸入または摂取時に有毒である、時粉末形態で：従って、好ましくは、毒性のリスクを減らすために2％w / v溶液を使用しています。そのような手袋、ゴーグル、そして白衣として、防護服を着ている間だけハンドル。冷蔵庫の中の光耐性、しっかりと密閉容器（&lt;4℃、換気の良い場所）に保管してください。 </li></ol></li></ol></li><li>調製およびN -Sulfosuccinimidyl -6-（4&#39;-アジド-2&#39;-ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエートの使用アリコート（スルホSANPAHは、Mは、492.40グラム/モルrを）。注意：スルホSANPAHは深刻な眼刺激を引き起こす。手袋と適切な保護眼鏡または保護面を扱う。ストア受信時に-20℃で前分注する。 <ol><li>スルホ - SANPAHを保存するには：50 mg / mlのでdimethylsulfoxane（DMSO）にスルホSANPAHを溶解する。チューブあたり20μlに50マイクロ遠心チューブにストック溶液を分注し。ドライアイス上または液体窒素中でフラッシュ凍結-80℃で、店舗（最大架橋剤効率を維持するために任意であるが好ましい工程）。 注：一定分量は、CAnは、数ヶ月間保存すること。 </li><li>スルホ - SANPAH使用するには：簡単にアリコートを解凍し、脱イオン水480μlの希釈する。すぐに使用してください。スルホSANPAHは水に迅速に加水分解する：ので、すぐに上記の手順をすべて実行するために注意を取る。 </li></ol></li><li>過硫酸アンモニウム（M rは 228.18グラム/モル）のアリコートを調製する。 注：過硫酸アンモニウムは、目、皮膚、呼吸器への刺激の原因となる。取り扱いの際に適切な個人保護具を着用する。化学ヒュームフードの過硫酸アンモニウム粉末を扱う。ドライ、風通しの良い場所に保管して粉末。分注した後、希釈溶液は、作業台の上に使用することができる。 <ol><li> w / vの10％の最終の硫酸アンモニウム濃度を達成するために、脱イオン水に過硫酸アンモニウムを溶解する。 -20℃で小分けし、保存。使用直前に解凍します。 </li></ol></li><li> I型コラーゲン溶液の調製。 <ol><li>そうストックを希釈することによって0.2 mg / mlのコラーゲン溶液を調製pH7.4での1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中リュー。簡単に氷の上に保管してくださいまたは希釈するとすぐに使用しています。 </li></ol></li></ol> 2.ハイドロゲル準備（図1を参照してください） <ol><li>疎水性スライドガラスの調製。 <ol><li>ガラス板上に疎水性溶液を数滴を置き、表面全体に広がってティッシュペーパーを使用しています。空気が乾燥してみましょうと疎水性コーティングを均等に再びティッシュペーパーで拭いてください。 注：RTで可燃性のキャビネットに保管して疎水性のソリューション。取り扱う際は保護具を着用。換気の良い場所で作業します。 </li></ol></li><li>可撓性プラスチック支持体の作製。 <ol><li>疎水性コーティングされたガラス板のサイズに合わせて柔軟なプラスチック支持体を切断した。 </li><li>軽くそのような外科用メスなどの鋭利な工具で表面を引っ掻くことにより、柔軟なプラスチック支持体の疎水性側をマークします。 注： - 完全に透過的である - ゲル一度乾く、スクラッチマークは、柔軟なプラスチック製の支持体側がゲルを含む区別しやすくなります。 注：可撓性プラスチック支持体は、疎水性および親水性の側面を有する。蒸着後、ポリアクリルアミドは、恒久的に簡単に後続のヒドロゲルの取り​​扱いを容易にプラスチック支持体の親水性側に付着する。 </li></ol></li><li>ゲルの調製（例えば容積5mlのゲル前駆体溶液のために与えられている）。 NOTE：ゲルの初期厚さが0.5mmである場合を5ml〜40のゲルを生成するのに十分であろう。ゲルの厚さを小さくすれば、よりゲルを製造することができる。 <ol><li> 50ミリリットルコニカルチューブに所望の最終濃度（ 表1）のポリアクリルアミド前駆体溶液の4972.5μLを置 ​​きます。キャップで30分間脱ガスチャンバ内の場所を開け。 NOTE：酸素ラジカル捕捉剤として作用し、存在する、重合を阻害する。 </li><li>過硫酸アンモニウムw / vの10パーセントの25μlを加え、最終的に達成するために（1.3を指すように参照してください。）0.05％の過硫酸アンモニウムの濃度。 </li><li> N、N、N &#39;、N&#39;-テトラメチルエチレンジアミンの2.5μl加え、0.5％の最終TEMED濃度を達成するために脱気したゲル溶液に（TEMED、Mは116.24グラム/モルをR）。 注：RTで可燃性のキャビネットに保管TEMED。適切な個人保護具を身に着けているときに、化学ドラフト内で取り扱ってください。それは非常に空気や水分に敏感であるように、しっかりと不活性ガス下で閉じておいてください。 </li><li> 5回 - ダウン3をピペッティングにより穏やかに溶液を混合する。ゲル前駆体溶液への酸素の拡散を回避するためにボルテックスしないでください。 </li><li>疎水性コーティングされたスライドガラスを有する可撓性プラスチック支持体とサンドイッチの親水性側上にゲル溶液をピペット。所望の厚さ（ 例えば、0.5ミリメートル）のシリコーンスペーサーを2スライドを区切ります。ゲル化の指標として使用する50mlの円錐管中でポリマー前駆体溶液の少量（約100μl）を残す。 注意：任意のスペーサーを使用することができる。 120μmで - 例えば、パラフィルムの単一のストリップは、100の最後の膨潤ゲルの厚さを与えます。 </li><li>重合時にさえヒドロゲル表面を確認するために柔軟なプラスチック支持体/ゲルサンドイッチの上に別のガラス板を置きます。 </li><li>所望であれば、より少ない時間でより高い重量％のゲルのために使用することができるゲルを、45分間重合してみよう。ゲルが重合したことを確認するため、50ミリリットルコニカルチューブ中の残留溶液を観察する。残りの溶液がゲル化していれば、それはガラス板上にゲル化が同様に開始された可能性がある。しかし、金型の早期開口部が完全な重合を防止することに注意。 </li><li>ゲルが形成されると、上に共有結合したポリアクリルアミドゲルを有する可撓性プラスチック支持体から剥離し、空気乾燥ゲル側を上向きにして設定。 NOTE：対流または熱乾燥は、このステップを加速するためにも使用することができる。可撓性プラスチック支持体上に乾燥した後、ゲルをストアすることができ無期限dは。 <ol><li>ポリアクリルアミドゲルは、気泡のために形成されなかった柔軟なプラスチック支持体、のいずれかの裸のスポットをマークします。ゲルが乾燥したら、これは柔軟なプラスチック支持体に溶け込むようマークゲルはまだ水和されている間。 </li></ol></li></ol></li></ol> 3.マルチウェルプレートアセンブリ、コラーゲンコーティング、および滅菌<ol><li>マルチウェルプレートアセンブリ。 <ol><li>乾燥させた後、所望の形状にPAゲルをカット。 <ol><li> 96ウェルプレートの場合は、〜6ミリメートルの直径を有する大型穴パンチを使用しています。正方形または長方形の形状にゲルをカットする大型ペーパーカッターを使用してください。代わりに、はさみを使用しています。 </li></ol></li><li>製造元の指示に従って、96ウェルプレート当たりPDMSの約500μlのを準備します。マルチウェルプレートの底にゲルを接着するために、各ウェルの中心にポリジメチルシロキサン（PDMS）の小滴（〜5μl）を配置します。鉗子を使用して、1つのポリアクリルアミドを配置ダウン各ウェル、可撓性プラスチック支持体側の電子ゲル。 PDMSを硬化できるようにするには、4時間の最小37℃で組み立てられたプレートを残す。 </li></ol></li><li>ポリアクリルアミドゲルのコラーゲンコーティング。 <ol><li>転送ピペットを用いて、少量プレイス - スルホ - SANPAHの（7 8μl）をゲル表面に均一にコーティングするために左右によくスワールそれぞれに（1.2.2を指すように参照）。スルホ - SANPAHは水中で安定していないので、速やかに作業します。 </li><li> 5分間 - 高強度UVランプ（365nmの強度= 37ミリワット、λ= 302）の下でウェルプレートを置きます。過剰スルホ - SANPAHを除去してPBSでゲルを洗浄します。 </li><li> 0.2ミリグラムのピペットを50μl/ mlのI型コラーゲン溶液（1.4ポイントを参照）を各ウェルに。 4℃で少なくとも2時間またはO / N RTで​​覆われたプレートのままにしておきます。 NOTE：コラーゲンコーティングのプロセスをスピードアップするために、ピペットは、コラーゲン溶液を追加するために使用することができる。一般的に、1 - 溶液2滴が完了するのに十分であるべきであるLYゲル表面をカバーしています。 </li><li>コラーゲン結合を可能にするために、少なくとも2時間室温でウェルプレートにしておきます。 </li><li> 2時間、組織培養フード中の過剰コラーゲン溶液を除去し、UV（λ= 200 nm）の下で殺菌するためにPBSで洗浄すること。 </li><li>水和平衡化するO / N（培地組成はセクション4.1を参照のこと）完全培地中でゲルを浸す。最大2日間すぐに播種細胞ま​​たは冷蔵庫に店舗に使用します。 </li></ol></li></ol> PA剛性アッセイ4.細胞播種注：一般的な哺乳動物細胞株のための代表的なものの、ここで説明するプロトコルは、特に乳癌MDA-MB-231細胞株で使用される（ 図4及び図5を参照）。 <ol><li> 37℃で5分間、5％トリプシン/ EDTAに暴露することにより組織培養フラスコから細胞を収集する。 〜培養フラスコ領域の各1cm 2当たりのトリプシン/ EDTA80μlのを使用します。例えば、トリプシン/ EDTA foの2 mlを使用RA T25細胞培養フラスコ。再懸濁所望の最終細胞濃度で、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した完全培地中で回収された細胞である。細胞は、アッセイに播種される時間だけでなく、時間の長さを倍にアカウントセルに入れて、適切なサブコンフルエント細胞濃度を選択する。添加した培地を完全にヒドロゲルを沈めるのに十分であることを確認してください。 NOTE：ヒドロゲル培地で予め平衡化されているために十分であるべきで100μlの体積（3.2.6ステップを参照）。ゲルは前のステップでメディアで事前に平衡化されているので、マルチウェルプレートに使用される典型的なメディアのボリュームは十分なはずです。 注：このアッセイは、任意の付着依存性細胞型のために適切であろう。 <ol><li>血球計を使用して、倒立顕微鏡下で細胞数をカウントする。負荷10の各血球計ポートに細胞懸濁液μlの少なくとも8象限から細胞数を平均化する。取得するため最終細胞濃度は、10 4細胞数を掛ける。 注：各血球計象限における細胞数が20である場合、最良の細胞計数結果が得られる - 50。 </li></ol></li><li>培養物を37℃で加湿インキュベーター中でPA剛性アッセイ上に細胞を、5％CO 2。 3日間 - すべての2メディアを変更します。 5分間37℃で5％トリプシン/ EDTAに暴露することによって、必要なときに、細胞を収集する。組織培養フラスコの1cm 2当たりのトリプシン/ EDTAの〜80μlのを使用してください。ヒドロゲルに触れるのではなく、わずかに横マルチウェルプレートを傾けると、各ウェルの側壁にピペットチップに触れることにより、吸引またはピペット媒体：全細胞操作工程の間に、ヒドロゲルの表面を破壊しないように特別な注意を払う。 注：標準的な組織培養処理時のヒドロゲルの表面を損傷しないように十分注意し除き、細胞は、それらが上に播種されたかのように剛性のアッセイは同じように操作することができる上に播種定期的なマルチウェルプレートに。 </li></ol> PA剛性アッセイ上に播種された細胞の5イメージング<ol><li>直接PA剛性アッセイにおける画像セル。 注：すべての顕微鏡 - 倒立蛍光または共焦点顕微鏡は、細胞イメージングのために使用することができる。 NOTE：剛性アッセイを構築するために使用される可撓性プラスチック支持体は、完全に透明であり、autofluoresceまたは細胞画像化を妨害しない。しかし、可撓性プラスチック支持体自体が透明であっても、イメージング機能は対物レンズの作動距離によって制限される。柔軟なプラスチック支持体は、0.23ミリメートルの厚さを有し、10倍の対物レンズの典型的な作動距離が急激に高倍率のために減少〜4mmである。 <ol><li>生細胞イメージングのための顕微鏡のプレートホルダー及び画像中の位置PA剛性アッセイ。 2時間の下でイメージングセッションを保持し、またはより長い撮影時刻のための環境室を備えた顕微鏡を使用しています。 </li><li>ときに生細胞イムエージングが目的ではない、0.1％の界面活性剤を補充した4％ホルムアルデヒド溶液で細胞を固定する。 2時間の最小室温で固定液中で細胞を浸す。二回PBSですすぐ。指定された廃棄物容器内の固定液の廃棄物を捨てる。 注：細胞は、直ちに画像化することができる、または2週間まで4℃でPBS中に沈めて格納。注意：ホルムアルデヒドは吸入と接触した際に有毒である。化学ヒュームフード中で手袋を取り扱ってください。 注記：特定の固定剤は、いくつかの細胞タンパク質に損傷を与えるので、細胞の固定プロトコルは、その後の細胞染色および処理プロトコルに基づいて選択されな​​ければならない。 </li><li>蛍光イメージングのために、染色は、マルチウェルプレート中で直接所望の細胞染色で細胞を固定。画像をすぐに。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

もともと電気泳動のために開発され、ポリアクリルアミドゲルは、28は、現在日常的に細胞の形態、運動性、および他の細胞特性のうち通信3,24,29上の基板の剛性の影響を研究するために細胞培養基質として使用される。ポリマー前駆体濃度の単純な変化- （300キロパスカル0.3）1（ 図2、表1も参照17,25,26参照 ）、ポリアクリルアミド、体内のすべての軟組織の剛性を包含するために、基板の剛性の操作を可能にする。 PAゲルを調製するために、かなり安価で簡単であるという事実に結合され、それらは、剛性依存性細胞性物質の相互作用の研究に不可欠なプラットフォームとなっている。にもかかわらず、簡単しかし、PAゲルを調製するための現在の技術は、小さなバッチに限定される。この制限は、過硫酸アンモニウムによって触媒されるフリーラジカル重合されたヒドロゲルのゲル化の性質に由来する反応は、フリーラジカル連鎖重合であるため、およびTEMED 30は、酸素などのフリーラジカル捕捉剤として機能する任意の要素によって阻害するこ...

体内のほとんどの組織は、ソフト軟骨100キロパスカルに脳0.1キロパスカルの範囲のヤング率を有する軟質の粘弾性材料であり、まだ、 インビトロの細胞研究のほとんどは、約1 GPaの弾性率を有する組織培養ポリスチレン（TCP）上で実施される。1この剛性のミスマッチが大幅に細胞がその環境に対応方法に影響します。研究の成長体は、幹細胞を含む種々の細胞型、2,3の運命の基板の剛性の影響を解明するこうして専用である。4その結果、複数のヒドロゲルは剛性依存性細胞の理解を助けるために開発されている基板の剛性が細胞の運命に大きな影響を持っていることの証拠が増えている一方で、ポリアクリルアミド（PA）、5-7ポリエチレングリコール（PEG）、8,9-ジメチルシロキサン（PDMS）、10およびアルギン酸塩を含む、生物。11、ほとんどの研究は、上実施されるsの数が少ない小規模amples。細胞型または環境条件のアレイ用基板の剛性の影響に関する系統的、多次元研究は稀である。12 いくつかの有望なハイスループットヒドロゲル技術は、PEGに基づくマイクロアレイ、アガロースヒドロゲルマイクロビーズを製造するための13のマイクロ流体デバイス、14またはミクロ及び剛性がマイクロロッドの直径および高さによって変調されたナノロッドを含む、開発されてきた。15ただし、そのような基板を製造するための技術が洗練された研究室の限られた数に利用可能である。剛性変調細胞応答に関与する多くの研究が実施が安価で簡単であるだけでなく、ポリアクリルアミド（PA）ゲルを利用するだけでなく、ヤング率、すなわち、0.3の生理学的に関連する範囲を示す-を300kPaにPAを製造する16-22しかしながら、既存の方法細胞培養用ゲルは、労働集約的で、その結果、分取され小さなバッチでARED。細胞基質としてPAゲルの調製に関連する困難のいくつかは、ゲルを用意しなければならない要件から生じる：1）は、酸素の非存在下で完全な重合を可能にする、2）平滑な表面を有する均一なセルを可能にする付着及び拡散、および3）永久フローティング防止するための細胞培養皿の底に固定された。 いくつかのグループが、大きなバッチでの細胞培養のためのPAゲルを製造することを試みてきた。ゼムラーらパンチ、次いで「切断」であり、96ウェルプレートに入れ、PAゲルを調製した厚さのシート23は、しかしながら、この方法は、より堅いゲル、 すなわち、&gt; 1キロパスカルのヤング率で、より柔らかいために制限されゲルは、カットすることは困難であり、容易に損傷を受けた「スティッキー」である。 MIH らは、ゲルが直接ガラスボトムウェルプレート中で重合することができ、より洗練された技術を開発した。 <sアップ&gt; 6これは、官能化ガラス底プレート中にゲル溶液を注ぐとカスタムカバーガラス配列でそれらを「挟み込む」ことによりゲルを形成することによって達成された。6にもかかわらず、非常に有望な、わずかなエッジ効果はまだ、この技術を用いて観察された。さらに、この技術は、多くの研究室だけでなく、高価なガラスボトムマルチウェルプレートにすぐにアクセスすることはできませんカスタムデザインの配列が必要です。 本論文では、簡単に任意の研究室によって採用することができ、マルチウェルプレートにPAゲルを組み立てるための簡単​​で安価な方法について説明します。撥PAゲルに疎水一つ、共有結合、堆積時PAゲルに結合する親水オン、 - ここで、柔軟なプラスチック支持体は、2つの側面を有し、利用される。 PAゲルシートは、可撓性プラスチック支持体に固定され永久に堆積された後は、任意の厚さまたは剛性のゲルを処理し、任意の所望の形状にして切断を可能にする。このAPPRoachは、PA結合溶液で、ガラスカバースリップまたは高価なガラスボトムマルチウェルプレートのウェルのいずれかを他の方法で市販されていないサイズのカスタムプラスチック「カバーガラス」を生成するだけでなく、ガラス表面-御馳走事前に必要がなくなるだけでなく、退屈で時間のかかる工程。最後に、均一なPAゲルシートは、大きなバッチで調製し、数ヶ月デ水和格納することができる。 要約すると、ここで提示アッセイは、いくつかの態様において、既存の方法の改良である。まず、マルチウェルプレートアセンブリのプロセスが効率的であり、必要な材料の全体的なコストが低い。第二に、ヒドロゲルは、単一の均質ゲルフィルムに大きなバッチで製造される。最終的に、市販されている唯一の材料が必要とされる。アッセイの有用性は、細胞形態の基板の剛性の影響を探索し、面積を広げることによって示されている。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>40% アクリルアミド</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2% ビスアクリルアミド</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>Bio-Rad</td><td>161-07000</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン1型、ラットテール由来、3.68 mg/ml</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>疎水性溶液 &#8212;シランをはじく</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x), pH 7.4</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]</td><td>Elsworth Adhesives</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Tyrpsin/EDTA (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44174</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30027-02</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>HyClone</td><td>SH30073-03</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>MP バイオメディカル</td><td>1670046</td><td></td></tr><tr><td>洗剤: Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド 37% 溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>BSAベースの細胞接着ブロッキングキット &#8212;ECM細胞接着アレイキット</td><td>Chemicon International</td><td>ECM540</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Disposable lab equipment</strong</td></tr><tr><td>>flexible plastic support &#8212;ポリアクリルアミドゲル用GelBond PAGフィルム</td><td>GEヘルスケアバイオサイエンス</td><td>309819</td><td></td></tr><tr><td>ガラスプレート</td><td>スランピー GBS4100SFSL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mlコニカルチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>3181345107</td><td></td></tr><tr><td>15mlコニカルチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>2ml:02681258</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート(平底)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てピペット(1&nbsp;ml、2&nbsp;ml, 5&nbsp;ml、10&nbsp;ml, 25&nbsp;ミリリットル、50&nbsp;ml)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>1ml:13-678-11B、2&nbsp;ml:05214038、5&nbsp;ml(ファルコン):357529、10&nbsp;ml:13-678-11E、25&nbsp;ML:13-678-11、50&nbsp;ml:13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>ガラストランスファーピペットフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>5 3/4 ":1367820A、9":136786B</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ(1-200&nbsp;&#956;l, 101-1000&nbsp;&#956;l)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック標準使い捨てトランスファーピペットフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>パラフィルム&nbsp;</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>パウダーフリー検査用手袋</td><td>クエスト</td><td>92897</td><td></td></tr><tr><td>シリコーンスペーサー&#8212;シリコンシート 厚さ0.5mm/13cm x 18cm</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR-S-0.5<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">大型/使い捨て不可</強力></td></tr><tr><td>軽くて蛍光顕微鏡 (Axiovert 200M)</td><td>ツァイス</td><td>3820005619</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡ソフトウェア</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision Rel. 4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>UVオーブン</td><td>UVITRON</td><td>UV1080</td><td></td></tr><tr><td>真空チャンバー/デガッサー</td><td>BelArt</td><td>999320237</td><td></td></tr><tr><td>デガッサー用真空ポンプ</td><td>KNFラボ</td><td>5097482</td><td></td></tr><tr><td>組織培養フード</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>ケミカルヒュームフード</td><td>KEWAUNEE</td><td>99151</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡(アクシボレート25)</td><td>ツァイス</td><td>663526</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td></td><td>NUAIRE NU-8500</td><td></td></tr><tr><td>ピペットエイド</td><td>ドラモンドサイエンティフィック株式会社</td><td>P-76864</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Bright-Line</td><td>383684</td><td></td></tr></tbody></table>

剛性依存性細胞応答の研究のための簡単​​なポリアクリルアミド系マルチウェル剛性アッセイ

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

現在、ほとんどのin vitro細胞研究は硬質組織培養ポリスチレン(~1 GPa)で行われていますが、体内のほとんどの細胞は弾力性があり、はるかに柔らかい(0.1 – 100 kPa)マトリックスに付着しています。このような剛性のミスマッチは細胞の応答に大きく影響するため、細胞の基質として幅広い剛性を持つハイドロゲル材料の開発に強い関心が寄せられています。ポリアクリルアミドゲルは、安価で体内のすべての軟組織の剛性範囲をカバーしており、多くの研究グループにとって最適なハイドロゲルです。しかし、ポリアクリルアミドゲルの調製は長く、面倒で、小さなバッチにしか適していません。ここでは、ゲルの構造支持体として永久的な柔軟なプラスチックフィルムを利用することにより、マルチウェルプレートフォーマットでポリアクリルアミドゲルを調製できるアッセイについて説明します。この技術は、現在の方法よりも速く、効率的で、安価であり、他の方法では利用できないカスタムサイズのゲルを調製することができます。特別な機器を必要としないため、この方法はどの研究室でも簡単に採用でき、特に剛性依存性細胞応答の理解に焦点を当てた研究に役立ちます。

ポリアクリルアミド（PA）ヒドロゲルは広く剛性依存性細胞応答を試験するために使用される。17,24アクリルアミド（A）とビスアクリルアミド（B）の種々の濃度を混合することにより、一つのほとんどの軟組織の剛性の範囲に及ぶPAゲルを作ることができるボディ- 0.3 -ここで300kPaのヤング率1が、ポリアクリルアミドゲルの調製が面倒であり、時間は、多くの場合、例えば薬物スクリーニングのために「ハイスループット」用途におけるその有用性を制限し、かかる12、簡単かつ迅速な方法が（ 図1）マルチウェルプレート中でPAゲルを組み立てまたは他の所望の組織培養容器が提供される。 図2Aは、（表1に要約）は、いくつかのAとBの濃度の関数としてのヤング率を示している。追加のA及びBの組み合わせの弾性率は、文献に報告されている。17,25,26完全swolleのゲル剛性10ヘルツ、及び2％の一定のひずみ - nはゲルは、上側平行ジオメトリ20ミリメートルとのレオロジー（ARの2000exレオメーター、...

ここでは、マルチウェルプレートフォーマットのポリアクリルアミドゲルの迅速、効率的、安価な調製を可能にする方法について説明しています。この方法は特別な機器を必要とせず、どの研究室でも簡単に採用できます。これは、剛性依存性の細胞応答の理解に焦点を当てた研究に特に役立ちます。

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

本手順の全体的な目的は、マルチウェルプレート形式でポリアクリルアミドゲルを迅速、効率的、かつ安価に調製できるようにすることです。まず、疎水性コーティングを施したガラスプレートとアクリルアミド接着性の柔軟なプラスチックサポートの間に、ゲルの前駆体溶液を挟み込みます。次に、重合によって柔軟なプラスチックサポートに共有結合したゲルをガラスプレートから剥離させ、乾燥させます。次に、乾燥させたゲルと下層の柔軟なプラスチック支持体を任意の形状に切り出し、プラスチック側を下にしてマルチウェルプレートまたはその他の細胞培養容器のウェル底面に接着させます。最終ステップとして、マルチウェルプレートに組み立てられたポリアクリルアミドゲルを、I型コラーゲンの単層などの細胞接着コーティング剤でコートします。最終的に、顕微鏡観察およびその他の細胞特性評価手法を用いて、下層のポリアクリルアミド基質による影響を観察します。特に、剛性が細胞挙動に及ぼす影響についてです。既存の手法に対する本手法の主な利点は、あらゆる剛性と厚さのポリゲルを扱える点、およびマルチウェルプレート形式でのアセンブリが可能である点であり、他の手法では不可能な低コストかつ時間効率の良い方法で実現できることです。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の学生が行います。まず、アクリルアミド、架橋剤のビスアクリルアミド、および脱イオン水を混合してポリアクリルアミドゲルの前駆体溶液を調製します。Sul OPAをジメチルスルホキシドに50 mg/mLの濃度で溶解させます。このストック溶液を20 µLずつ10本のマイクロ遠心チューブに分注します。その後、溶液を液体窒素で急速凍結させ、-80 °Cで保存します。次に、過硫酸アンモニウムを脱イオン水に溶解し、最終濃度を10% (w/v) に調製します。この過硫酸アンモニウム溶液を10本のマイクロ遠心チューブに25 µLずつ分注し、-20 °Cで保存します。コラーゲンタイプIストック溶液をpH 7.4の1XPBSで希釈し、0.2 mg/mLのコラーゲン溶液を調製します。すべての溶液は、使用するまで氷上で保持します。ここで、疎水性溶液をガラスプレート上に数滴滴下し、ティッシュペーパーを使用して表面全体に広げます。プレートを自然乾燥させた後、再度ティッシュペーパーで拭き取り、疎水性コーティングを均一にします。疎水性コーティングが施されたガラスプレートと同じサイズに、柔軟なプラスチックサポートをカットします。次に、メスなどの鋭利な器具で表面に軽く傷をつけ、柔軟なプラスチックサポートの疎水性側を印付けします。ゲルの調製では、目的の最終濃度に調整したポリアクリルアミド前駆体溶液 4972.5 µLを、50 mLコニカルチューブに加えます。チューブのキャップを開けた状態で、脱気チャンバーに30分間置きます。その後、あらかじめ調製した過硫酸アンモニウム溶液を25 µL、DGAsゲル溶液に添加し、最終的な過硫酸アンモニウム濃度を0.05%にします。次に、TM MEを2.5 µL添加し、最終的なTM ME濃度を0.5%にします。ピペッティングで3〜5回ゆっくりと混ぜ合わせます。続いて、柔軟なプラスチック支持体の親水性側に、任意の厚さのシリコンスペーサーを配置します。次に、ゲルの溶液をスペーサー間の柔軟なプラスチック支持体にピペットで分注し、疎水性コーティングを施したガラススライドで軽く挟みます。45分間ゲルを重合させた後、ポリアクリルアミドゲルが共有結合した柔軟なプラスチック支持体を剥がし、ゲル面を上にして自然乾燥させます。乾燥後、ポリアクリルアミドゲルを目的の形状に切り出します。メーカーの指示に従い、マルチウェルプレートの底にゲルを接着させるため、96ウェルプレート1枚につき約500 µLのポリメチルメタクリレートを用意します。ピンセットを用いて、各ウェルの中央にポリメチルメタクリレートを少量滴下します。各ウェルにポリアクリルアミドゲルを1枚ずつ、柔軟なプラスチックサポート面を下にして配置します。ポリジメチルシロキサンの硬化後、あらかじめ調製したセルロースサンプルをトランスファーピペットで各ウェルに少量ずつ加え、左右に揺らしてゲルの表面を均一にコーティングします。ウェルプレートを高強度UVランプの下に5分間置きます。完了後、PBSでゲルをすすぎ、過剰なセルロースを除去します。このピペットを用いて、事前に調製したコラーゲンType one溶液を各ウェルに約50 µLずつ分注します。プレートに蓋をしたまま室温で少なくとも2時間放置した後、PBSで洗浄して過剰なコラーゲン溶液を除去します。組織培養フード内で、UVライトを用いてゲルを2時間滅菌します。最後に、ゲルを完全培地で一晩浸し、水和および平衡化を行います。細胞播種にはすぐにゲルを使用するか、冷蔵庫で最大2日間保存してください。想定される、複数のアクリルアミドおよびビスアクリルアミド濃度（それぞれAおよびBと指定）の関数としてのヤング率をここに示します。貯蔵弾性率G'および損失弾性率G''はともに周波数に依存しません。また、ゲルを乾燥させた後に再水和させても、ヤング率に影響を与えないことが確認されました。架橋剤Sulo sampaを用いることで、どのような剛性のハイドロゲルに対しても、均一なコラーゲンコーティングを実現できます。乳がんM-D-A-M-B 2 31細胞をポリアクリルアミドゲル上に24時間播種したところ、柔らかい0.5および1 kilo pascalのゲル上では細胞は円形のままであったが、硬い100 kilo pascalのゲル上では伸展および伸長することが観察された。加えて、柔軟なプラスチックサポートの上に作製されたハイドロゲルは透明であるため、視覚化および顕微鏡観察が容易である。さらに、この柔軟なプラスチックサポートは自家蛍光を発しないため、蛍光標識された細胞のイメージングを妨げない。細胞形態は、全体の細胞伸展面積および細胞円形度に基づいてさらに定量化されました。このビデオを視聴することで、マルチウェルプレート形式でポリアミドゲルを効率的かつ安価に作製する方法について十分な理解が得られたはずです。これは、剛性に依存する細胞生物学の研究に有用です。

simple-polyacrylamide-based-multiwell-stiffness-assay-for-study

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

細胞機能上の基層の剛性の影響をモデル化することができます...

アクリルアミド系ハイドロゲルを用いた細胞機能のマトリックスの剛性の影響を研究

ここでは、セルの剛性を測定するために迅速かつ簡単な方法を説明します。このアプローチの一般的な原則は、細胞表面にマイクロピペットを介して適用、明確に定義された負圧に応答して膜の変形を測定することです。この方法は、基板に接続された細胞の生体力学的特性を研究するための強力なツールを提供します。...

セルの剛性を推定するために基板に接続された細胞のマイクロピペット吸引

このビデオは、接着細胞の細菌感染に対する細胞外マトリックス(ECM)硬化の影響を研究するためのアッセイを示しています。さまざまな硬さのポリアクリルアミドハイドロゲルをコラーゲンで重ね合わせたマルチウェルプレートに重ね合わせることで、生理的ECMの硬さを模倣します。ヒト内皮細胞をハイドロゲル上に重ね合わせ、細胞内で蛍光タンパク質を発現するように設計されたリステリア菌を細胞に感染させると、フローサイトメトリーを使用して、硬いハイドロゲル上に存在する細胞内の内在する細菌と柔らかいハイドロゲル上に存在する細菌を比較します。...

細胞外マトリックスの硬直が細菌感染に及ぼす影響を研究するためのアッセイ

このビデオでは、内皮細胞を介した細胞外マトリックスの硬さ依存性リステリア菌の播種を評価するための定量的なタイムラプス顕微鏡法を紹介しています。より柔らかいヒドロゲルは、硬いヒドロゲルと比較して、内皮細胞を介した細菌の拡散を容易にし、マトリックスの硬さが細菌の播種に及ぼす影響を強調しています。...

細胞外マトリックスの硬さ依存性細菌播種を評価するための定量的タイムラプス顕微鏡法

腫瘍微小環境中の機械的剛性が浸潤突起の活性を増加し、収縮性アクトミオシンによって悪性の挙動を駆動する重要な役割を果たしている。アクリルアミドゲル（PAAS）を使用して、浸潤突起と牽引力アッセイは、マトリックスの剛性に応じて、癌細胞の浸潤性および収縮特性を研究するために利用することができる。...

癌細胞に対する浸潤突起と牽引力のアッセイのために、ポリアクリルアミドゲル

付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性をプロービングのためのウェル フォーマット...

付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性を勉強するためのウェル フォーマット ポリアクリルアミドを用いたアッセイ

広視野蛍光顕微鏡を用いたメカノバイオロジー研究の柔らかいシリコーン基板の剛性測定

機械的な力は、細胞の移動を制御するために重要です。このプロトコルは、ガラスマイクロピペットとマイクロマニピュレータを使用して変形できる弾性ヒドロゲルの使用を示し、細胞構造および移行の変化を引き起こすために局所的な剛性勾配を持つ細胞を刺激する。...

細胞運動と関連するシグナル伝達事象の機械的制御を評価するための単細胞デュロタシスアッセイ

多能O9-1神経堤細胞と様々な剛性のポリアクリルアミドヒドロゲルを使用して 、インビトロで 機械的信号を研究するための詳細なステップバイステッププロトコルについて説明します。...

神経堤細胞の機械的信号を研究するための最適化されたO9-1/ヒドロゲルシステム

このビデオはの使用方法を示しています...

エンジニア心臓組織の移植後免疫反応の評価（EHT）のための生物発光イメージング

学ぼう、ポリアクリルアミドゲルを用いたマルチウェルプレート剛性アッセイ法。簡便かつ低コストで細胞応答を評価し、神経科学や細胞生物学の研究に応用可能です。

剛性依存性細胞応答の研究のための簡単​​なポリアクリルアミド系マルチウェル剛性アッセイ

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剛性依存性細胞応答の研究のための簡単なポリアクリルアミド系マルチウェル剛性アッセイ