剛性依存性細胞応答の研究のための簡単​​なポリアクリルアミド系マルチウェル剛性アッセイ

本手順の全体的な目的は、マルチウェルプレート形式でポリアクリルアミドゲルを迅速、効率的、かつ安価に調製できるようにすることです。まず、疎水性コーティングを施したガラスプレートとアクリルアミド接着性の柔軟なプラスチックサポートの間に、ゲルの前駆体溶液を挟み込みます。次に、重合によって柔軟なプラスチックサポートに共有結合したゲルをガラスプレートから剥離させ、乾燥させます。

次に、乾燥させたゲルと下層の柔軟なプラスチック支持体を任意の形状に切り出し、プラスチック側を下にしてマルチウェルプレートまたはその他の細胞培養容器のウェル底面に接着させます。最終ステップとして、マルチウェルプレートに組み立てられたポリアクリルアミドゲルを、I型コラーゲンの単層などの細胞接着コーティング剤でコートします。最終的に、顕微鏡観察およびその他の細胞特性評価手法を用いて、下層のポリアクリルアミド基質による影響を観察します。

特に、剛性が細胞挙動に及ぼす影響についてです。既存の手法に対する本手法の主な利点は、あらゆる剛性と厚さのポリゲルを扱える点、およびマルチウェルプレート形式でのアセンブリが可能である点であり、他の手法では不可能な低コストかつ時間効率の良い方法で実現できることです。本手順のデモンストレーションは、私の研究室の学生が行います。

まず、アクリルアミド、架橋剤のビスアクリルアミド、および脱イオン水を混合してポリアクリルアミドゲルの前駆体溶液を調製します。Sul OPAをジメチルスルホキシドに50 mg/mLの濃度で溶解させます。このストック溶液を20 µLずつ10本のマイクロ遠心チューブに分注します。その後、溶液を液体窒素で急速凍結させ、-80 °Cで保存します。

次に、過硫酸アンモニウムを脱イオン水に溶解し、最終濃度を10% (w/v) に調製します。この過硫酸アンモニウム溶液を10本のマイクロ遠心チューブに25 µLずつ分注し、-20 °Cで保存します。コラーゲンタイプIストック溶液をpH 7.4の1XPBSで希釈し、0.2 mg/mLのコラーゲン溶液を調製します。

すべての溶液は、使用するまで氷上で保持します。ここで、疎水性溶液をガラスプレート上に数滴滴下し、ティッシュペーパーを使用して表面全体に広げます。プレートを自然乾燥させた後、再度ティッシュペーパーで拭き取り、疎水性コーティングを均一にします。

疎水性コーティングが施されたガラスプレートと同じサイズに、柔軟なプラスチックサポートをカットします。次に、メスなどの鋭利な器具で表面に軽く傷をつけ、柔軟なプラスチックサポートの疎水性側を印付けします。ゲルの調製では、目的の最終濃度に調整したポリアクリルアミド前駆体溶液 4972.5 µLを、50 mLコニカルチューブに加えます。

チューブのキャップを開けた状態で、脱気チャンバーに30分間置きます。その後、あらかじめ調製した過硫酸アンモニウム溶液を25 µL、DGAsゲル溶液に添加し、最終的な過硫酸アンモニウム濃度を0.05%にします。次に、TM MEを2.5 µL添加し、最終的なTM ME濃度を0.5%にします。ピペッティングで3〜5回ゆっくりと混ぜ合わせます。続いて、柔軟なプラスチック支持体の親水性側に、任意の厚さのシリコンスペーサーを配置します。

次に、ゲルの溶液をスペーサー間の柔軟なプラスチック支持体にピペットで分注し、疎水性コーティングを施したガラススライドで軽く挟みます。45分間ゲルを重合させた後、ポリアクリルアミドゲルが共有結合した柔軟なプラスチック支持体を剥がし、ゲル面を上にして自然乾燥させます。乾燥後、ポリアクリルアミドゲルを目的の形状に切り出します。

メーカーの指示に従い、マルチウェルプレートの底にゲルを接着させるため、96ウェルプレート1枚につき約500 µLのポリメチルメタクリレートを用意します。ピンセットを用いて、各ウェルの中央にポリメチルメタクリレートを少量滴下します。各ウェルにポリアクリルアミドゲルを1枚ずつ、柔軟なプラスチックサポート面を下にして配置します。

ポリジメチルシロキサンの硬化後、あらかじめ調製したセルロースサンプルをトランスファーピペットで各ウェルに少量ずつ加え、左右に揺らしてゲルの表面を均一にコーティングします。ウェルプレートを高強度UVランプの下に5分間置きます。完了後、PBSでゲルをすすぎ、過剰なセルロースを除去します。

このピペットを用いて、事前に調製したコラーゲンType one溶液を各ウェルに約50 µLずつ分注します。プレートに蓋をしたまま室温で少なくとも2時間放置した後、PBSで洗浄して過剰なコラーゲン溶液を除去します。組織培養フード内で、UVライトを用いてゲルを2時間滅菌します。

最後に、ゲルを完全培地で一晩浸し、水和および平衡化を行います。細胞播種にはすぐにゲルを使用するか、冷蔵庫で最大2日間保存してください。想定される、複数のアクリルアミドおよびビスアクリルアミド濃度（それぞれAおよびBと指定）の関数としてのヤング率をここに示します。

貯蔵弾性率G'および損失弾性率G''はともに周波数に依存しません。また、ゲルを乾燥させた後に再水和させても、ヤング率に影響を与えないことが確認されました。架橋剤Sulo sampaを用いることで、どのような剛性のハイドロゲルに対しても、均一なコラーゲンコーティングを実現できます。

乳がんM-D-A-M-B 2 31細胞をポリアクリルアミドゲル上に24時間播種したところ、柔らかい0.5および1 kilo pascalのゲル上では細胞は円形のままであったが、硬い100 kilo pascalのゲル上では伸展および伸長することが観察された。加えて、柔軟なプラスチックサポートの上に作製されたハイドロゲルは透明であるため、視覚化および顕微鏡観察が容易である。さらに、この柔軟なプラスチックサポートは自家蛍光を発しないため、蛍光標識された細胞のイメージングを妨げない。

細胞形態は、全体の細胞伸展面積および細胞円形度に基づいてさらに定量化されました。このビデオを視聴することで、マルチウェルプレート形式でポリアミドゲルを効率的かつ安価に作製する方法について十分な理解が得られたはずです。これは、剛性に依存する細胞生物学の研究に有用です。