剛性依存性細胞応答の研究のための簡単​​なポリアクリルアミド系マルチウェル剛性アッセイ

この手順の全体的な目標は、マルチウェルプレートフォーマットのポリアクリルアミドゲルの迅速、効率的、かつ安価な調製を可能にすることです。これは、まず、疎水性コーティングされたガラスプレートとアクリルアミド接着剤の柔軟なプラスチックサポートの間にゲル前駆体溶液を挟むことによって達成されます。第2ステップは、重合時に軟質プラスチック支持体に共有結合したガラス板からゲルを剥がし、乾燥させることです。

次に、ドライゲルとその下にある柔軟なプラスチック支持体を所望の形状に切断し、プラスチック面を下にしてマルチウェルプレートまたはその他の細胞培養容器のウェル底に接着します。最後のステップは、マルチウェルプレートに組み立てたポリアクリルアミドゲルを、コラーゲンタイプ1の単層などの細胞接着コーティングでコーティングすることです。最終的には、顕微鏡法やその他の細胞特性評価技術を使用して、下にあるポリアクリルアミド基質の影響を観察します。

特に、細胞の挙動に対するその剛性。この方法が既存の方法よりも優れている点は、ポリゲルのあらゆる剛性と厚さ、およびマルチウェルプレート形式での組み立てを、他の方法では得られない低コストで時間効率の良い方法で処理できることです。手順のデモンストレーションは、私の研究室の学生として行われます。

まず、アクリルアミド、架橋剤ビスアクリルアミドを混合してポリアクリルアミドゲル前駆体溶液を調製し、脱イオン水はSul OPAをジメチルスルフォックスに50ミリグラム/ミリリットルで溶解します。20マイクロリットルのストック溶液を10マイクロ遠心チューブに分注します。その後、フラッシュし、溶液を液体窒素で凍結し、摂氏マイナス80度で保存します。

次に、硫酸アンモニウムを脱イオン水に溶解して、最終的な硫酸アンモニウム濃度を体積で10%の重量にします。硫酸塩溶液あたり25マイクロリットルのアンモニウムを10本のマイクロ遠心分離管にEloquaし、摂氏マイナス20度で保存します。コラーゲンタイプ1のストック溶液をpH 7.4の1つのXPBSで希釈することにより、1ミリリットルあたり0.2ミリグラムのコラーゲン溶液を調製します。.

すべての溶液は、使用するまで氷上に保管されます。この時点で、ガラス板に疎水性溶液を数滴垂らし、ティッシュペーパーを使用して表面全体に広げます。プレートを風乾させた後、再度ティッシュペーパーで拭いて疎水性コーティングを均一にします。

疎水性コーティングされたガラスプレートのサイズに合わせて、柔軟なプラスチックサポートをカットします。次に、メスなどの鋭利な工具で表面を軽く引っ掻いて、柔軟なプラスチックサポートの疎水性側面に印を付けます。ゲル調製のために、所望の最終濃度のポリアクリルアミド前駆体溶液4972.5マイクロリットルを50ミリリットルの円錐管に加える。

キャップを開けた状態でチューブを脱気チャンバーに30分間置きます。これに続いて、DGAsゲル溶液に以前に調製した硫酸アンモニウム溶液あたり25マイクロリットルを加えて、硫酸塩あたりの最終アンモニウム濃度を0.05%にした後、TM meを2.5マイクロリットル加えて、最終的なTM ME濃度を0.5%にします3〜5回ピペッティングして溶液を穏やかに混合します。次に、希望の厚さのシリコンスペーサーを、柔軟なプラスチックサポートの親水性側に配置します。

次に、ゲル溶液をスペーサー間の柔軟なプラスチックサポートにピペットで移動させ、疎水性コーティングされたガラススライドライトでサンドイッチします。ゲルを45分間重合させた後、共有結合したポリアクリルアミドゲルを上にして柔軟なプラスチックサポートをはがし、ゲル側を上にして自然乾燥させます。乾燥したら、ポリアクリルアミドゲルを希望の形状にカットします。

製造元の指示に従って、96ウェルプレートあたり約500マイクロリットルのポリメチルソーンを調製し、ゲルをマルチウェルプレートの底に接着します。鉗子を使用して、各ウェルの中央にポリメチルソーンの小さな液滴を置きます。ポリアクリルアミドゲルを各ウェルの柔軟なプラスチックサポート面を下にして1つ配置します。

ポリジメチルサボキサンを硬化させた後、あらかじめ調製したセルロースサンパをトランスファーピペットで各ウェルに少量入れ、左右に渦巻いてゲル表面を均一にコーティングします。ウェルプレートを高輝度UVランプの下に5分間置きます。終了したら、ゲルをPBSですすいで余分なチェロを取り除きます。

このピペットに続いて、事前に調製したコラーゲンタイプ1溶液の約50マイクロリットルをそれぞれに注入します。PBSですすいだ後、プレートを室温で少なくとも2時間覆ったままにして、余分なコラーゲン溶液を取り除きます。組織培養フード内でUV光の下でゲルを2時間滅菌します。

最後に、ゲルを完全な培地に一晩浸し、水分を補給して平衡化します。セルシーティング用のゲルをすぐに使用するか、いくつかのアクリルアミドとビスの関数として最大2日間冷蔵庫に保管してください。ここでは、それぞれAとBと指定されたアクリルアミド濃度を予想通りに示します。

蓄積弾性率Gプライムと損失弾性Gダブルプライムはどちらも周波数に依存しません。また、ゲルを乾燥させてから再水和しても、若年率に影響を与えないことも確認されました。Crosslinker Sulo sampaを使用することで、あらゆる硬さのハイドロゲルに均一なコラーゲンコーティングを実現できます。

ポリアクリルアミドゲルに24時間播種すると、乳がんM-D-A-M-B 2 31細胞は、柔らかい0.5および1キロパスカルゲル上に丸いままであったが、硬い100キロパスカルゲル上で広がり、伸長することができたことが観察された。さらに、柔軟なプラスチックサポートの上に作られたハイドロゲルは透明で、視覚化と顕微鏡観察が容易になります。さらに、柔軟なプラスチック支持体は自己蛍光を発しないため、蛍光標識細胞のイメージングを妨げません。

細胞の形態は、細胞全体の拡散面積と細胞の真円度の観点からさらに定量化されました。このビデオを見れば、マルチウェルプレート形式でポリアミドゲルをいかに効率的かつ安価に組み立てるかを十分に理解できるはずです。剛性依存性細胞生物学の研究に。