Name: クライオ電子顕微鏡によるHIV - 1キャプシドアセンブリの構造とヘリカル実空間の反復再構成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: 学ぼう、ヘリカル実空間反復再構成法を用いてHIV-1キャプシドアセンブリの三次元構造を解明する方法を。低温電子顕微鏡による高密度マップ生成の詳細プロトコルです。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、技術サポートのために博士は公僕趙と丹霞柯に感謝します。我々は、博士に感謝する。それらの画像処理ソフトウェアを共有するためのエドワードEgelmanとNiko Grigorieff。我々はまた、医学のピッツバーグ大学大学の構造生物学低温電子顕微鏡施設、Beowulfクラスタおよびグリッドをサポートするスタッフを認めます。この作品は、GM082251とGM085043によってサポートされていました。

1。凍結水和したEM試料作製 HIV - 1キャプシドタンパク質（CA）アセンブリ9低温電子顕微鏡の画像で強力なバックグラウンドノイズを寄与する、唯一の高塩（1M NaCl）をバッファで安定しているため、我々は一時的に塩を低減する方法をブロッティング急速希釈し、裏面を使用してください凍結水和したEMグリッドを準備する濃度。 <ol><li> 25秒用に25mAの下に200メッシュのR2 / 1 Quantifoil銅グリッドのグロー放電では、炭素側。 </li><li> 80％に、、環境室内の湿度をもたらすために自家製マニュアル重力のプランジャーを噴霧器を使用してください。 </li><li> FEI Vitrobotプランジャデュワー、液体窒素を使ってクールな液体エタンで。手動の重力のプランジャーにプランジ凍結デュワーをマウントします。 </li><li>鉗子にマウントされているグリッドの炭素側、上に組み立てられたCAのソリューション2.5μLを適用し、あなたから離れて直面しているグリッドの炭素側とプランジャに鉗子を読み込みます。 </li><li>グリッドの背面側に低塩の希釈バッファー（100mMのNaCl）を3μlを加え、直ちにろ紙片でグリッドの裏面にしみ。グリッドの全体の裏面には、ろ紙を削除する前に、約6秒間、ろ紙と密接な連絡をしてください。直ちにろ紙を除去した後、液体エタン中にグリッドを突き通す。 </li><li>プランジ​​ャーから鉗子を外し、すぐにグリッドストレージボックスにグリッドを移す。 </li></ol> 2。 CA管状アセンブリの低温電子顕微鏡<ol><li> 200kvでFEI Polara G2電子顕微鏡の動作に凍結水和したグリッドをロードし、ガタン4Kx4K CCDカメラを装備。 </li><li>低線量の検索モードの下で、&lt;0.001e〜200倍の倍率でと用量との- / Å 2は 、適切な氷のある地域のためのグリッド全体を審査し、stageファイルでこれらの領域の位置を保存する。 </li><li>低線量の検索モードで3900 xの倍率で保存された位置とさらに画面これらの領域を思い出してください。データ収集のために、穴の上に十分に分離、長い管を含む氷の均一な、薄層で領域を選択します。第二段階のファイルにこれらの領域の場所を保存してください。 </li><li>露出あたり/ Å 2 - 59000 X、はめ込み100μmの目標の開口部、および〜15 Eの投与のための客観的紅斑出現し、ビーム強度を調整するの倍率で露出モードに切り替えます。 </li><li>低線量の検索モードに戻るには、保存した位置に移動し、CCDカメラを用いて良好なチューブを識別し、センター。フォーカスモードに切り替えて、フォーカスを調整し、0.5〜2.5μmの間で、通常、デフォーカス値を設定します。露出モードに切り替え、15 Eの投与量については、0.3から0.5秒の露光時間を設定します- / Å 2、および画像を収集する。画像は、プレートのカメラで収集され、露光が行われる前に、フィルムは10秒間静置してください。 </li><li>次に保存した位置に移動し、より多くの画像を収集するために手順5を繰り返します。 </li><li>フィルムは12分間フル強度D19で開発され、6.35ミクロンのピクセルサイズでニコンスーパーCOOLSCAN 9000 EDのスキャナを使用してデジタル化されています。画像ファイルの形式はTIFFです。 </li></ol> 3。ヘリカルインデックス作成ベッセル次数 n、およびレイヤの行番号、L：ヘリカルオブジェクトは、2つのパラメータでインデックスを作成することができます。として（N、L）を特徴とフーリエ変換の各レイヤの線は、2次元格子から表記を使用して、（H、K）のインデックスで表される螺旋状の物体の表面の格子上にラインのセットに対応しています。任意の（H、K）の場合は、（N HK、L HK）層の線は、NおよびLの値である2つの基本的なベクトル（nは 10、L 10）と（N 01、L 01）、の線形結合である二つの主要層の線（1,0）と（0,1）。lはフーリエ変換でZ軸に沿って測定されたレイヤの行の高さから取得することができます。 nの値は次の式10を用いて推定することができます πRr≈J のn≈1.1 | N | -0.9 .....................( 1） J nは n 番目の層線の強度を決定するベッセル関数、ここで、rはヘリカルオブジェクトの半径であり、そしてRは、層線の最大振幅の半径です。レイヤの行番号、lは 、選択ルール11でnに関連している L = TN + UM ....................( 2） ここで、t と u は、螺旋の定数である。任意のらせんの場合は、（または非常に密接に）正確にはT Cを正確にuは単位があるかもしれませんompleteになります。 <ol><li> EMANのプログラム12 helixboxerを使用して均一な直径を持つ比較的まっすぐで長いチューブ外箱とMRCの形式で画像を保存する。 </li><li> MRCのパッケージ13のような"imgccf"として相互相関ベースのプログラムを使用してヘリカルリピート距離、cを 、、、決定する。 </li><li>繰り返し距離、cの積分である新しいボックスの長さでフーリエ変換を計算する。 </li><li>二つの基本的な表面の格子ベクトル（1,0）を定義し、（0,1）は、2つの主要な層の行を選択してください。 </li><li>それぞれ、R 01 L 10、R 10、L 01、管の半径、r、およびフーリエ変換の2つの主要な層の線の高さと半径を測定する（図1）。 </li><li>式（1）にしたがってnを 10とN 01を計算する。 </li><li> n個の値しか推定なので、nを 10とN 01のいくつかの組み合わせがプログラムパッケージIHRSRを使用して、正しいらせん対称性を見つけるために（ステップ4.2を参照）後のステップでテストされています。 </li><li>サブユニット間のローテーション（Δφ）と一つ星のらせん（N = 1）の軸方向の上昇（ΔZ）：2つの実数で記述されたネジの対称性を計算する。 L 10、L 01、N 10、N 01の値を与え、uとtは、選択規則に従ってm個の値の範囲（例えば、-50 &lt;M &lt;50）をテストすることによって得ることができます。最後に、ΔφとΔZはΔφ= 360 T / UとΔZ= C / Uを使用して計算されます。 </li></ol> 4。三次元再構築<ol><li>粒子のセグメンテーション<ol><li> EMANのパッケージ内のプログラムのグラフィカルプログラムのボクサーを、使用して、らせん状粒子を含む顕微鏡写真を開きます。 </li><li>重複するセグメントにヘリカル粒子をカット。ボクサーのコントロールパネルでは、Helixのモードを選択し、ボクシング​​のパラメータを設定する：箱の大きさは粒子の直径よりも大きくする必要があり、"OLAP"の値は、ボックスの大きさの〜90％でなければならない。 </li><li>ヘリカル粒子のいずれかの端を左クリックした後、ボクサーは自動的にらせんの長さに沿って粒子の一連のボックスを生成します。 </li><li>箱入りのセグメントだけでなく、それらの座標を保存します。 </li></ol></li><li> IHRSRプログラムを使用して初期の三次元再構成<ol><li>低温電子顕微鏡像のコントラストを反転し、反復ヘリカル実空間の再構成法（IHRSR）で処理する前に14（オプション）ローパスフィルタリングを適用する。 </li><li> "ジェネレータ"と入力してIHRSRプログラムのグラフィカルインタフェースを開きます。スタックの名前とパスを含む箱入り粒子のスタックのすべての情報、とグラフィカルインタフェース、スタック内の画像の数を提供する、対称性のパラメータなどの値は、再建のスクリプトを作成するためのボタン"Finish"をクリックして、 b25.spi。 </li><li>初期のリファレンスとして実又は中空の円筒を使用し、通常は数サイクル後に発生する定義されているネジの対称性、に変更がないまで、サイクルへの手続きを可能にする。右ヘリカル対称性は、安定的に収束の再建を与える必要があります。最後のサイクルで生成された再建は、さらなる改良のための最初の基準として使用されます。 IHRSRはSPIDERプログラムを使用して三次元再構成を実行します。 </li></ol></li><li>反復改良15との再建はIHRSRによって生成された3D再構築は、現在追加の改良のための最初の基準として使用されます。洗練された中に、ヘリカル対称性は、ΔφとIHRSRの手順から決定されるΔZ、に固定されています。 <ol><li>プログラムCTFFIND3とCTFTILT 16を使用して顕微鏡でデフォーカスと非点収差の存在を決定する。 </li><li> SPIDERプログラム17を使用してCTFによる粒子のセグメントを掛けます。 SPIDERのスイートでFTと呼ばれる操作は、2次元画像のフーリエ変換（FFT）を計算するために使用されます。その後、FFTはSPIDERスイート内のMUと呼ばれる操作を使用して、前の手順で決定した、CTFの値が乗算されます。得られた値は、再び、SPIDERの操作を使用して実空間でのFTを新しいイメージを（CTF補正）を形成する逆変換、逆です。 </li><li>マルチリファレンスアラインメントを使用して、CTF -補正画像と参照量の予測を比較することによって、投影のマッチングを行います。面外傾斜角の変化は、+ / -10 °に制限し、1 °ステップでサンプリングされます。このような各セグメントのアラインメントパラメータの0 °または180 °、およびX -シフト限定、近くに高い相関係数、面内の角度などの制約を導入する。制約を満たす再建のみのセグメントに含まれています。 </li><li>それぞれが洗練サイクルを反復した後、3D再構築は、CTFにわたって合計で逆投影を使用して生成され、分割されています2。 </li><li>対称化ボリュームを生成するらせん対称性を課す。新しい3D復元の解決にはさらなる改善が発生していないときに反復改良は終了します。 </li><li>画像処理パッケージSPIDERは、洗練されたステップのほとんどに使用されます。一連の操作は、操作とパラメータ値の配列を含むユーザが作成したバッチコントロールファイルであるSPIDERのスクリプトによって制御されます。最終的な再建は、SPIDERスイートでプログラムを使用して計算されます。 </li></ol></li></ol> 5。代表的な結果： 単一のHIV - 1 CA A92Eチューブ（図1a）は、箱入りの出であり、そのフーリエ変換（図1b）はヘリカルインデックス作成のために算出した。レイヤの線（1,0）と（0,1）に対して、L 10 = 28、L 01 = 37、R 10 = 55、R 01 = 44。 211.57Åのチューブの半径を考えると、我々は、N 10 =- 12、nは 01 = 11（ここで、利き手が所定した）近似。 5195.48Åの繰り返しの距離で、管のねじの対称性は、ΔZのように決定された= 6.8093Å、Δφ= 328.88 °。 ΔZ、Δφは7.1321Åと328.86に洗練°でIHRSR（図2a）と初期の再建を使用することは図に示されています。図2b。最終的な復興（図3）、反復改良した後、IHRSR（図2b）で計算された初期のモデルから大幅に密度マップを改善。 <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1 HIV - 1 CAヘリカルチューブのインデックス作成。 （A）、単一のHIV - 1 CA A92Eチューブの画像を。スケールバー、30nmの。 （B）フーリエ変換（A）に示すようにチューブの変換。ヘリカル指数（N 10 =- 12、nは 01 = 11）が示されています。 23Aの解像度でレイヤーの線に矢印をポイントします。 <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。IHRSRを使用して初期の再建。各反復サイクルのための（A）スクリューの対称性の決定。 10は改良のサイクルを反復した後、ΔφとΔZは、初期値から開始し、安定した値に収束する。 （B）10、反復サイクル後の最初の3次元密度マップ。 <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。反復改良後の3次元密度マップ。 （AC）CAチューブの密度マップは、3つの直交スライスとして表示されます。チューブ軸に平行して管軸（B）に対して垂直に、表面（）に近い、と平行管軸（C）へと経由。スケールバーは10nm。 （D）3次元密度マップの表面のレンダリングには、100％の体積を囲む1.8sで輪郭。

<ol><li>Frank, J., Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+negatively+stained+or+in+vitreous+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of single particles negatively stained or in vitreous ice.</a> Ultramicroscopy. 46, 241-262 (1992).</li>
<li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Purple+Membrane+from+Halobacterium-Halobium+-+Analysis+of+X-Ray-Diffraction+Pattern%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of Purple Membrane from Halobacterium-Halobium - Analysis of X-Ray-Diffraction Pattern.</a> J Mol Biol. 93, 123-128 (1975).</li>
<li>Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iterative+helical+real+space+reconstruction+method%3A+surmounting+the+problems+posed+by+real+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers.</a> J Struct Biol. 157, 83-94 (2007).</li>
<li>Egelman, E. H., Francis, N., Derosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-Actin+Is+a+Helix+with+a+Random+Variable+Twist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">F-Actin Is a Helix with a Random Variable Twist.</a> Nature. 298, 131-135 (1982).</li>
<li>Nogales, E., Whittaker, M., Milligan, R. A., Downing, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+model+of+the+microtubule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution model of the microtubule.</a> Cell. 96, 79-88 (1999).</li>
<li>Jimenez, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+structure+of+an+SH3+amyloid+fibril+and+model+of+the+molecular+packing%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy structure of an SH3 amyloid fibril and model of the molecular packing.</a> Embo J. 18, 815-821 (1999).</li>
<li>Butler, P. J., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+particle+of+tobacco+mosaic+virus+from+RNA+and+disks+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+New+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of the particle of tobacco mosaic virus from RNA and disks of protein.</a> Nat New Biol. 229, 47-50 (1971).</li>
<li>Namba, K., Yamashita, I., Vonderviszt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+core+and+central+channel+of+bacterial+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the core and central channel of bacterial flagella.</a> Nature. 342, 648-654 (1989).</li>
<li>Byeon, I. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Convergence+between+Cryo-EM+and+NMR+Reveals+Intersubunit+Interactions+Critical+for+HIV-1+Capsid+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural Convergence between Cryo-EM and NMR Reveals Intersubunit Interactions Critical for HIV-1 Capsid Function.</a> Cell. 139, 780-790 (2009).</li>
<li>Toyoshima, C., Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+the+acetylcholine+receptor+by+cryoelectron+microscopy+and+helical+image+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of the acetylcholine receptor by cryoelectron microscopy and helical image reconstruction.</a> J Cell Biol. 111, 2623-2635 (1990).</li>
<li>Toyoshima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+determination+of+tubular+crystals+of+membrane+proteins.+I.+Indexing+of+diffraction+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. I. Indexing of diffraction patterns.</a> Ultramicroscopy. 84, 1-14 (2000).</li>
<li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN%3A+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li>
<li>Yonekura, K., Toyoshima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+determination+of+tubular+crystals+of+membrane+proteins.+IV.+Distortion+correction+and+its+combined+application+with+real-space+averaging+and+solvent+flattening%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. IV. Distortion correction and its combined application with real-space averaging and solvent flattening.</a> Ultramicroscopy. 107, 1141-1158 (2007).</li>
<li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+electron+cryo-microscopy%3A+towards+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution.</a> Q Rev Biophys. 33, 307-369 (2000).</li>
<li>Sachse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+electron+microscopy+of+helical+specimens%3A+A+fresh+look+at+Tobacco+Mosaic+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution electron microscopy of helical specimens: A fresh look at Tobacco Mosaic Virus.</a> J Mol Biol. 371, 812-835 (2007).</li>
<li>Mindell, J. A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+local+defocus+and+specimen+tilt+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy.</a> J Struct Biol. 142, 334-347 (2003).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+Processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Zhang, P. J., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+dynamin+in+the+constricted+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of dynamin in the constricted state.</a> Nat Cell Biol. 3, 922-926 (2001).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は、螺旋状物体の3次元構造を取得するためのわかりやすいアプローチを提供する一連のプロトコルを提示する。記載された手順を使用して、我々は、シングルチューブのイメージ（176セグメント）からHIV - 1キャプシドアセンブリの3D構造を取得しました。高分解能構造は、より多くの画像データを含むことによって達成することができます。 最適なデータ収集と分析のためのいくつかの重要なポイントがあります：まず、低温電子顕微鏡の試料の準備中に、試料溶液はサンプルのサイズよりもやや厚くなるソリューションの均一な、薄い層を残して、ブロットされるべきである。サンプルをブロットにいくつかの異なる方法があります。このようなHIV - 1 CAアセンブリとして細菌細胞および管状試験片については、特に背面側から、片側からブロッティング、最も適切です。 第二に、らせんの利き手は、これがヘリカルインデックス作成または再構築によって行うことができないとして、決定する必要がある。一般的な方法は、利き手を判断するために18をシャドウイングロータリー続いて、凍結エッチングを使用することです。密度マップの解像度が十分に高い場合に利き手は、ポスト再建を決定することができます。正しい利き手が想定される場合、個々の成分の3次元原子モデルは、密度マップによく適合している必要があります。そうでなければ、反対の利き手を仮定する必要があります。 第三に、ウィーナーフィルタは、ノイズの増幅を低減するため、位相と振幅補正の両方に対して、画像処理中に使用する必要があります。単一のイメージからCTFは常にゼロ交差を持っているので、逆格子空間内の情報の一部は失われます。したがって、それは別のデフォーカス値で3次元再構成、各画像形成されたために含まれる複数の投影データをセット持っていることが必要である。

<table border="1"><tbody><tr><td> の名前 </td><td> 元 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 100Xグロー放電装置</td><td> 100Xグロー放電装置</td><td></td></tr><tr><td> Tecnai Polaraフィールドエミッション銃を持つF30顕微鏡</td><td> FEI、オレゴン州ヒルズボロ</td><td></td></tr><tr><td>ガタン4K X 4K CCDカメラ</td><td>ガタン、プレザントン、カリフォルニア州</td><td></td></tr><tr><td>プランジ​​凍結装置</td><td></td><td>自家製マニュアル重力のプランジャー</td></tr><tr><td> Quantifoil R2 / 1 200メッシュholely炭素銅グリッド</td><td> Quantifoilマイクロツール、Jena、ドイツ</td><td></td></tr><tr><td> EMソフトウェアEMAN </td><td> <a href="http://blake.bcm.edu/EMAN/">http://blake.bcm.edu/EMAN/</a> </td><td></td></tr><tr><td> EMソフトウェアIHRSR </td><td> <a href="http://people.virginia.edu/~ehe2n/">http://people.virginia.edu/〜ehe2n /</a> </td><td>エドワードH. Egelmanから利用できるプログラム</td></tr><tr><td> EMソフトウェアスパイダー</td><td> <a href="http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a> </td><td></td></tr><tr><td> MRCによるヘリカル加工ソフト</td><td> <a href="http://www.riken.jp/biostrmech/index.html">http://www.riken.jp/biostrmech/index.html</a> </td><td>浩二米倉から利用できるプログラム</td></tr><tr><td> CTFFIND3/CTFTILTと実空間ヘリカル洗練ソフトウェア</td><td> <a href="http://emlab.rose2.brandeis.edu/software">http://emlab.rose2.brandeis.edu/software</a> </td><td></td></tr></tbody></table>

クライオ電子顕微鏡によるhiv - 1キャプシドアセンブリの構造とヘリカル実空間の反復再構成

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

画像処理と組み合わせることで低温電子顕微鏡（クライオEM）は、高分子タンパク質複合体とアセンブリの構造決定のため、ますます強力なツールです。実際には、単一粒子の電子顕微鏡1と2次元（2D）電子線結晶学2は比較的日常的方法論となっていると構造物の多数はこれらのメソッドを使用して解決されている。それと同時に、画像処理とヘリカルのオブジェクトの3次元（3D）再構成は急速に、特に、ヘリカル対称性と併せて単粒子解析ツールを使用してヘリカル実空間の再構築（IHRSR）方法3を 、反復開発しました。アクチンフィラメント4、微小管5、アミロイド繊維6、タバコモザイクウィルス7、及びバクテリアの鞭毛8、および、を含む糸状またはらせんの形態、の多くの生物学的実体の機能ヘリカルエンティティの3D密度マップは、単一の投影から達成することができるので、画像は、非ヘリカルオブジェクトの3D再構成するために必要な多くの画像と比較して、IHRSRメソッドを使用して、このような柔軟性と不規則ヘリカルアセンブリの構造解析は、現在達成可能です。 このビデオの記事では、我々はクライオ- EMによるクライオEMの試料作製、低用量のデータ収集のためのプロトコルを含むヘリカルタンパク質のアセンブリの3D密度マップ（HIV - 1キャプシド9は私たちの例です）、、インデックス作成をobtainingための詳細なプロトコルを提供ヘリカル回折パターン、およびIHRSRを使用して画像処理と3次元再構成の。他の技術に比べ、低温電子顕微鏡は、ほぼネイティブ条件下での最適な標本の保全を提供しています。サンプルは、急速冷凍により、硝子体、氷の薄層に埋め込まれており、放射線損傷を最小限に抑えるために低用量の条件下で、液体窒素温度で電子顕微鏡で画像化されています。サンプル画像は低信号と記録された顕微鏡の低コントラストを犠牲にしてほぼネイティブ条件下で得られる。幸いなことに、ヘリカル再建のプロセスは、主にらせん状の回折パターンのインデックスを作成するのを除いて、自動化されています。ここでは、インデックスらせん構造へのアプローチを説明し、デジタル化された顕微鏡写真から3次元ヘリカル再構成のための不可欠なステップをヘリカル対称性を（ヘリカルパラメータ）を決定します。簡単に言えば、我々はIHRSR法を適用して初期の3次元密度マップを得る。この初期マップは、反復的にこのように自由の学位を制御し、各セグメントの位置合わせパラメータの制約を導入することにより洗練されている。さらなる改善が電子顕微鏡のコントラスト伝達関数（CTF）（振幅と位相の補正）のために補正することにより、組立のらせん対称性を最適化することによって達成されます。

この記事では、低温電子顕微鏡を用いて螺旋状に組み立てられた分子の3次元（3D）構造を取得する方法を説明します。このプロトコルでは、我々は反復ヘリカル実空間再構成法による密度地図を達成するための詳細な3次元再構成の手順を説明するために、HIV - 1キャプシドアセンブリを使用してください。

クライオ電子顕微鏡によるHIV - 1キャプシドアセンブリの構造とヘリカル実空間の反復再構成

クライオ電子顕微鏡法（cryo-EM）は、画像処理技術と組み合わせることで、高分子タンパク質の構造決定においてますます強力なツールとなっています。

この手順の全体的な目的は、クライオ電子顕微鏡を用いて、ヘリカルに組み立てられた分子の三次元構造を得るための手法を提供することです。プロトコルは、凍結水和EMグリッドを調製する際に、急速希釈およびバックサイドブロッティング法を用いて塩濃度を一時的に低下させるクライオEM試料調製から始まります。このプロセスにより、タンパク質の安定性を確保しつつ、バックグラウンドノイズを低減させ、その後のデータ収集におけるクライオEM低線量データ収集の信号対雑音比を向上させることができます。回折パターンのヘリカルインデックス付けが完了します。その後、画像処理を行い、続いて実空間での3D再構成を行うことで、最終的なHIVカプシドまたはcaチューブの密度マップが得られます。一般的に、この手法に不慣れな方は、最適なデータ収集と解析のためにいくつかの重要な注意点があるため、習得に苦労することがあります。例えばHIVの場合、1モルのソース溶液中でしか形成されないカプシド管状アセンブリがあり、構造に影響を与えることなく塩濃度を急速に低下させることができます。高品質なcryo EM画像を得ることは極めて重要です。チューブの画像が与えられたとき、重要なチューブをインデックス化するために何をすべきか、また3D再構成を行うためにどのソフトウェアを検討すべきかを習得することは非常に困難です。このビデオでは、物理的オブジェクトの3D再構成を得るための詳細かつ簡潔なアプローチを解説しており、実験の参考として活用いただけます。Puja博士と共に手順を実演します。私たちは二人ともDr.Laboratoryのポストドクターです。cryo-EM用のHIV-1カプシドタンパク質複合体を調製するために、まず200メッシュの銅グリッドのカーボン側を25 mAで25秒間グロー放電させます。ネブライザーを使用して、自作の手動重力プランジャーである環境チャンバー内の湿度を80%に調整します。その間、液体窒素を用いてvitroボトルのプランジャードゥー内の液体エタンを冷却し、プランジ凍結ドゥーを手動重力プランジャーに取り付けます。次に、ピンセットを使用してグリッドの端を挟んで固定します。あらかじめ調製したタンパク質溶液2.5 µLをグリッドのカーボン側に滴下します。次に、グリッドのカーボン側を外側に向けて、プランジャーにピンセットをセットします。グリッドの裏側に低塩濃度希釈バッファーを3 µL加えます。直ちにフィルターペーパーでグリッドの同じ面を吸い取ります。グリッドの背面全体をフィルターペーパーに密着させたまま、約6秒間保持してください。フィルターペーパーを取り除いた後、すぐにグリッドを液体エタンにプランジします。最後に、プランジャーからピンセットを取り外し、速やかにグリッドをグリッド保存ボックスに移します。凍結水和グリッドをFEI polar G two電子顕微鏡にロードし、クライオ電子顕微鏡観察を開始します。加速電圧200 kilovoltsで動作し、Gatan 4K by 4K CCDカメラを搭載した装置を使用します。低線量サーチモードで、倍率を約 200 x に設定します。グリッド全体を走査し、適切な氷がある領域を確認します。これらの領域の位置をステージファイルに保存します。保存した位置を呼び出し、これらの領域をさらにスクリーニングします。低線量サーチモードで、3,900 xの倍率を追加してください。ホールの上に長いチューブが懸垂していることを特徴とする、データ収集に適した均一な薄い氷の層がある領域を選択します。すべての領域を第2ステージファイルに保存します。露光モードに切り替えます。倍率を 59,000 x に設定し、100 micrometer の対物絞りを挿入します。次に、1回の露光あたり約15 electrons/Å²の線量になるよう、対物レンズのスティグマータとビーム強度を調整します。低線量探索モードに戻り、保存した位置へ移動します。適切なチューブを同定し、中心に合わせます。CCDカメラを使用してフォーカスモードに切り替え、ピントを調整し、通常0.5から2.5 µmのデフォーカス値を設定します。次に、露光モードに切り替え、線量15 electrons/Å²となるよう露光時間を0.3から0.5秒に設定します。プレートカメラで画像を収集し、露光を開始する前にフィルムを10秒間静置させてください。画像の収集後、次の保存位置に移動し、このプロセスを繰り返してさらに画像を収集します。フィルムを原液のD 19で12分間現像します。その後、Nikon Super cool scan 9, 000 EDスキャナーを用い、ピクセルサイズ6.35 micrometersで画像をデジタル化します。らせん状の物体は、2つのパラメータによって指標化できます。それは、らせん状物体の表面格子のフーリエ変換におけるベッセル次数Nとレイヤーライン番号Lです。各レイヤーラインはNとLによって特徴付けられ、HおよびK指数で表される表面格子上の線群に対応しています。ヘリカルインデックス付けを開始するには、ImanのプログラムHelix boxerを使用して、直径が均一で比較的長くまっすぐなチューブをボックスアウトし、画像をMRC形式で保存します。次に、Imanのプログラムboxerを使用してチューブの半径を測定します。MRCパッケージに含まれるI-M-G-C-C-Fなどの相互相関ベースのプログラムを使用して、HELリピート距離を決定します。次に、フォワイエ計算を行います。繰り返し距離の整数倍となる新しいボックス長を用いて変換します。次に、FFTピクセル単位で(1, 0)および(0, 1)の2つの基本表面格子ベクトルを定義する、2本の主層線を選択します。フーリエ変換における2本の主要なレイヤーラインのレイヤーライン番号および最大振幅半径を決定します。2本の主要なレイヤーラインのレイヤーライン番号とベッセル関数の次数がわかれば、記載の手順に詳述されている選択則を用いて、サブユニット間の回転角と1本鎖ヘリックスの軸方向の進み（axial rise）を求めることができます。これら2つの実数は、チューブのらせん対称性を記述するものです。3D再構成は、ImanプログラムのBoxerを用いた粒子のセグメンテーションから始まります。helices粒子を含む電子顕微鏡写真を開いた後、Boxerのコントロールパネルで粒子をオーバーラップするセグメントに切り出します。helixモードを選択し、ボクシングのパラメータを設定してください。ボックスのサイズは粒子の直径よりも大きく、OLAの値はボックスサイズの約90%にする必要があります。左側を決定した後、粒子ボックスの両端のいずれかをクリックすると、ヘリックスの長さに沿って一連の粒子ボックスが自動的に生成され、ボックス化されたセグメントとその座標が保存されます。次のステップは、I-H-R-S-Rによる処理を行う前に、反復的ヘリカル実空間再構成法（I-H-R-S-R）を用いて初期3D再構成を行うことです。クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）画像のコントラストを反転させ、ローパスフィルタ（LOWPASS filtering）を適用します。次に、generatorと入力してI-H-R-S-Rプログラムのグラフィカルインターフェースを開きます。スタックの名前とパス、スタック内の画像数、および対称性パラメータの値を含む、ボックス処理済み粒子スタックに関するすべての情報をグラフィカルインターフェースに入力してください。完了ボタンをクリックして再構成スクリプトを作成します。B 25 SP.Iでは、初期参照として中実または中空のシリンダーを使用し、定義されたらせん対称性に変化がなくなるまで手順をサイクルさせます。通常、これは数サイクル後に発生します。右ねじ対称性を用いれば、安定的に収束した再構成が得られるはずです。前サイクルで生成された再構成結果を、さらなる精緻化のための初期リファレンスとして使用します。最後に、I-H-R-S-Rによって生成された3D密度マップを、精緻化工程における追加リファレンスとして用いて、反復的精緻化を伴う3D再構成を行います。らせん対称性は、I-H-R-S-Rの手順で決定されたサブユニット間の回転および軸方向の立ち上がり（axial rise）で固定します。次に、CTF find、CTF tiltなどのSpiderプログラムを用いて、マイクログラフに存在するデフォーカスと非点収差を決定し、FTおよびmuを用いて粒子セグメントにコントラスト伝達関数（CTF）を乗じます。マルチリファレンスアライメントを用いて、参照ボリュームの投影図とCTF補正済み画像を比較し、投影マッチングを行います。面外傾斜角の変動範囲は±10度に制限し、1度刻みでサンプリングします。また、0度または180度付近の面内角度における高い相関係数や、X方向のシフト量への制限などの制約を導入します。各セグメントのアライメントパラメータについて、制約を満たすセグメントのみを再構成に含めます。各反復精緻化サイクル後、逆投影を用いて3D再構成を生成し、CTFの2乗で除算して、らせん対称性を適用して対称平均化ボリュームを生成します。新しい3D再構成の分解能にそれ以上の改善が見られなくなった時点で、反復精緻化を終了します。単一のHIV-1カプシドアセンブリである92eチューブをボックスアウトし、ヘリックスインデックス作成のためにフーリエ変換を計算した。2つの半径、層線番号、および層線10および01の最大振幅半径を決定した。その後、繰り返し距離5195.48 angstromsに対し、10および01についてそれぞれ-12および11の端値を算出した。このチューブの螺旋対称性は、delta Z = 6.81 angstromsおよびdelta five = 328.88 degreesと決定された。I-H-R-S-Rを用いてdelta Zとdelta fiveを7.13 angstromsおよび328.86 degreesに精緻化し、10回の反復サイクルの後に初期再構成を生成した。反復的な精緻化後の最終的な再構成により、I-H-R-S-Rを用いて算出された初期モデルから密度マップが大幅に改善されました。カプシド集合管の密度マップは、管軸に平行で表面に近い3つの直交スライス、管軸に垂直なスライス、および管軸に平行で管軸を通るスライスとして表示されています。表示されている構造は、100%の体積を囲む1.8 Sigmaで等高線処理された3D密度マップのサーフェスレンダリングによるものです。このビデオを視聴することで、クライオ電子顕微鏡を用いてアセンブリされた分子の3D構造を得る方法について、十分な理解を深めることができます。

structure-hiv-1-capsid-assemblies-cryo-electron-microscopy-iterative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

によるHIV - 1 V3ループクラウンR2シーケンスの免疫学的に関連する動的第三紀の構造的特徴の評価第一原理折りたたみ

プロトコルは、低温電子トモグラフィーと三次元画像処理を用いた膜タンパク質の構造を決定するためにハイスループットなアプローチを説明します。それは、試料の準備の詳細、データ収集、データ処理や解釈をカバーし、アプローチの代表的なターゲット、HIV -...

低温電子断層撮影と自動化されたサブ断層アベレージングを使用して、HIVエンベロープ糖タンパク質の分子構造の決定

我々は高速3D生細胞の蛍光顕微鏡および高分解能低温電子断層撮影法を組み合わせた相関顕微鏡法を記載している。我々はダイナミックイメージング、宿主HeLa細胞との相互作用小HIV-1粒子による相関法の能力を実証する。...

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

電子クライオトモグラフィーとサブトモグラム平均化の組み合わせを使用して、ウイルス膜糖タンパク質複合体の構造を決定するためのアプローチが提示されています。...

Jsubtomoを用いた電子Cryotomography再建からのウイルスのエンベロープ糖タンパク質スパイクの平均化

この論文は、高分子のほぼネイティブな状態の高品質な顕微鏡画像を取得するために使用されるクライオ電子顕微鏡法について説明しています。この方法は、高分子の3D再構成を生成するために考案された単一粒子アプローチを使用したさらなるコンピュータ化された処理に適した画像を生成します。...

高分子の3次元再構成のための試料調製のプライマーおよび高品質データ収集：クライオ電子顕微鏡ののいいことといけないことをやる

本稿では、ソフトウェアスイートSPHIREを使用して低温EM画像を処理するためのプロトコルを紹介します。現在のプロトコルは、ほぼ原子分解能を目標とするほぼすべての単一粒子EMプロジェクトに適用することができます。...

SPHIREを用いた電子冷凍顕微鏡画像からの高分解能単一粒子解析

この記事では、3 つのクライオ EM 処理プラットフォーム (cryoSPARC v3、RELION-3、Scipion 3)...

クライオスパーク、リオン、サイピオンによる堅牢な単一粒子クライオ電子顕微鏡(クライオEM)処理ワークフロー

ここでは、透過型電子顕微鏡を使用してナノスケールでの液体EMおよびクライオEM分析に適したウイルスアセンブリを調製するためのプロトコルについて説明します。...

液体および氷中のウイルス集合体の高解像度イメージングの進歩

この記事では、クライオ電子断層撮影法とそれに続く血球凝集素糖タンパク質のサブトモグラム平均を使用して画像化されたインフルエンザウイルスのデータ処理のためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、画像の前処理から最終的なモデルの改良まで、段階的なデータ処理をカバーします。...

インフルエンザウイルスのクライオ電子断層撮影法による赤血球凝集素のサブナノメートル分解能構造決定

HIV指向性は、ウイルスエンベロープのV3領域から推測することができます。 V3は、PCRには、ネストされたRT -...

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

学ぼう、ヘリカル実空間反復再構成法を用いてHIV-1キャプシドアセンブリの三次元構造を解明する方法を。低温電子顕微鏡による高密度マップ生成の詳細プロトコルです。

クライオ電子顕微鏡によるHIV - 1キャプシドアセンブリの構造とヘリカル実空間の反復再構成

さらに動画を探す