クライオ電子顕微鏡によるHIV - 1キャプシドアセンブリの構造とヘリカル実空間の反復再構成

この手順の全体的な目的は、クライオ電子顕微鏡を用いて、ヘリカルに構築された分子の三次元構造を得るための手法を提供することです。プロトコールは、凍結水和EMグリッドを調製する際に、急速希釈およびバックサイドブロッティング法を用いて塩濃度を一時的に低下させるクライオEM試料調製から始まります。このプロセスにより、タンパク質の安定性を確保しつつ、背景ノイズを低減し、その後のデータ収集におけるクライオEM低線量データ収集のSN比を向上させることができます。

回折パターンの螺旋インデキシングを完了させます。続いて画像処理を行い、実空間での3D再構成を行うことで、HIVの単一カプシドまたはcaチューブの最終的な密度マップが得られます。一般的に、この手法に不慣れな方は、最適データ収集と解析におけるいくつかの重要なポイントがあるため、苦労することが予想されます。

例えば、HIVの場合、あるモル濃度のソース溶液中でのみ形成されるカプシド管状アセンブリがあり、構造に影響を与えることなく塩濃度を急速に低下させることができます。高品質なクライオ電子顕微鏡（cryo EM）画像を得ることが極めて重要です。チューブの画像がある場合、どのチューブを指標としてインデックス化すべきか、また3D再構成を行うためにどのソフトウェアを検討すべきかを習得することは非常に困難です。

このビデオでは、物理的オブジェクトの3D再構築を行うための詳細かつ簡潔なアプローチを提示しており、実験の参考として活用いただけます。ここでは、Puja博士と共に手順を実演します。私たちは共にDr.Laboratoryのポストドクターです。クライオ電子顕微鏡（cryo-EM）用にHIV-1カプシドタンパク質複合体を調製するには、まず200メッシュの銅グリッドのカーボン側を、25 mAで25秒間グロー放電させます。

ネブライザーを使用して、手製のマニュアル重力プランジャーである環境チャンバー内の湿度を80%に調整します。同時に、液体窒素を用いてvitro bottプランジャードゥー内の液体エタンを冷却し、プランジ凍結ドゥーをマニュアル重力プランジャーに取り付けます。次に、ピンセットを使用してグリッドの端を挟んで固定します。

あらかじめ調製したタンパク質溶液2.5 µLを、グリッドのカーボン側に滴下します。次に、グリッドのカーボン側を上に向けた状態で、ピンセットをプランジャーに載せます。グリッドの裏側に低塩濃度希釈緩衝液3 µLを加えます。

フィルターペーパーを用いて、グリッドの同じ面をすぐにブロッティングします。グリッドの裏面全体をフィルターペーパーに密着させたまま、約6秒間保持します。フィルターペーパーを取り除いた後、直ちにグリッドを液体エタンにプランジします。

最後に、プランジャーからピンセットを外し、速やかにグリッドをグリッド保管ボックスに移します。凍結水和させたグリッドをFEI Polar G2電子顕微鏡にロードし、クライオ電子顕微鏡観察を開始します。加速電圧は200 kilovoltsで、Gatan 4K by 4K CCDカメラを搭載した状態で操作します。

低線量検索モード（low dose search mode）で、約 200 x の倍率に設定します。グリッド全体を走査し、適切な氷がある領域を探します。これらの領域の座標をステージファイルに保存します。

保存した位置を呼び出し、これらの領域をさらにスクリーニングします。低線量検索モードで、3,900倍の倍率を追加します。孔の上に吊り下げられた長いチューブが含まれていることが特徴である、データ収集に適した均一な薄い氷の層を持つ領域を選択します。

すべての領域を第2ステージファイルに保存します。露光モードに切り替えます。倍率を59,000 xに設定し、100 µmの対物絞りを挿入します。

次に、1回あたりの照射量がおよそ15 electrons per angstrom squaredになるように、対物レンズのスティグマータとビーム強度を調整します。低線量検索モードに戻り、保存した位置に移動します。適切なチューブを特定し、中心に合わせます。

CCDカメラを使用してフォーカスモードに切り替え、ピントを調整し、通常0.5から2.5 µmの間でデフォーカス値を設定します。次に、露光モードに切り替え、1 Å⁻²あたり15電子の線量となるように、露光時間を0.3から0.5秒に設定します。プレートカメラで画像を収集し、露光前にフィルムを10秒間静置させます。

画像の収集後、次に保存された位置に移動し、同様の操作を繰り返してさらに画像を収集します。フィルムを原液のD 19で12分間現像します。その後、Nikon Super cool scan 9, 000 EDスキャナーを用い、画素サイズ 6.35 µmで画像をデジタル化します。

らせん状の物体は、2つのパラメータによってインデックス化できます。それは、らせん状物体の表面格子のフーリエ変換におけるベッセル次数 N とレイヤーライン番号 L です。各レイヤーラインは N と L によって特徴付けられ、H および K インデックスで表される表面格子上の線群に対応します。

ヘリカルインデックス付けを開始するには、ImanのプログラムであるHelix boxerを使用して、直径が均一で、比較的長く直線的なチューブをボックスアウトし、画像をMRC形式で保存します。次に、Imanのプログラムboxerを使用してチューブの半径を測定します。MRCパッケージのI-M-G-C-C-Fなどの相互相関ベースのプログラムを使用して、HEL繰り返し距離を決定します。

次に、フォイヤーを計算します。繰り返し距離の整数倍となる新しいボックス長で変換を行います。次に、FFTピクセル単位で1 0および0 1の2つの基本表面格子ベクトルを定義する、2つの主層線を設定します。

フーリエ変換における2つの主レイヤーラインのレイヤーライン番号および最大振幅の半径を決定します。2つの主レイヤーラインのレイヤーライン番号とベッセル関数の次数が分かれば、記述された手順に記載されている選択則を用いて、サブユニット間の回転角と1回星型らせんの軸方向の立ち上がり（axial rise）を求めることができます。これら2つの実数は、チューブのらせん対称性を記述するものです。

3D再構成は、ImanプログラムのBoxerを用いた粒子セグメンテーションから始まります。ヘリックス粒子を含むマイクログラフを開いた後、Boxerのコントロールパネルで粒子をオーバーラップするセグメントに分割します。ヘリックスモードを選択し、ボクシングのパラメータを設定してください。

ボックスのサイズは粒子の直径よりも大きく設定し、OLAの値はボックスサイズの約90%にしてください。その後、粒子ボックスの両端のいずれかをクリックすると、ヘリックスの長さに沿って一連の粒子ボックスが自動的に生成され、ボックス化されたセグメントとその座標が保存されます。次のステップは、I-H-R-S-Rによる処理に先立ち、反復的ヘリカル実空間再構成法（I-H-R-S-R）を用いて初期3D再構成を行うことです。

cryo-EM画像のコントラストを反転させ、LOWPASSフィルタリングを適用します。次に、「generator」と入力してI-H-R-S-Rプログラムのグラフィカルインターフェースを開きます。スタックの名前とパス、スタック内の画像数、および対称性パラメータの値を含む、ボックス化されたパーティクルスタックに関するすべての情報をグラフィカルインターフェースに入力してください。

「finish」ボタンをクリックして、再構成スクリプトを作成します。B 25 SP.Iでは、初期リファレンスとして中実または中空のシリンダーを使用し、定義されたスクリュー対称性に変化が見られなくなるまで（通常は数サイクル後）手順を繰り返します。右ねじ対称性を用いることで、安定して収束した再構成が得られます。

前サイクルで生成された再構成結果を、さらなる精緻化のための初期リファレンスとして使用します。最終的に、I-H-R-S-Rによって生成された3D密度マップを精緻化工程中の追加リファレンスとして用い、反復的な精緻化による3D再構成を行います。らせん対称性は、I-H-R-S-Rの手順で決定されたサブユニット間の回転角および軸方向のピッチ（axial rise）で固定します。

次に、CTFFIND3およびSPIDERプログラムのCTF tiltを用いて、マイクログラフに存在するデフォーカスと非点収差を決定します。その後、FTおよびmuを用いて、粒子セグメントにコントラスト伝達関数（CTF）を乗じます。CTF補正後の画像と参照ボリュームの投影図をマルチリファレンスアライメントで比較し、投影マッチングを行います。面外傾斜角の変動範囲は±10度以内に制限し、1度刻みでサンプリングします。また、面内角度が0度または180度付近で高い相関係数を持つことや、X方向のシフトを制限するといった制約を導入します。

各セグメントのアライメントパラメータについて、制約を満たすセグメントのみを再構成に含めます。反復的なリファインメントサイクルの後、逆投影を用いて3D再構成を生成し、CTFの2乗で除算して、らせん対称性を適用することで対称化ボリュームを生成します。新しい3D再構成の分解能にさらなる改善が見られなくなった時点で、反復リファインメントを終了します。

単一のHIV-1カプシドアセンブリである92Eチューブをボックスアウトし、ヘリックスインデックス作成のためにフーリエ変換を計算しました。2つの半径、レイヤーライン番号、およびレイヤーライン10と01の最大振幅半径を決定しました。その後、繰り返し距離5195.48 Åに対し、10および01についてそれぞれ-12および11の端値を算出しました。チューブのねじれ対称性はΔZ = 6.81 Å、Δφ = 328.88°と決定され、I-H-R-S-Rを用いてΔZとΔφを7.13 Åおよび328.86°に精緻化し、10回の反復サイクルの後に初期再構成を生成しました。

反復的な精緻化後の最終再構成により、I-H-R-S-Rで計算された初期モデルから密度マップが大幅に改善されました。カプシド組立チューブの密度マップは、チューブ軸に平行で表面に近い3つの直交スライス、チューブ軸に垂直なスライス、およびチューブ軸に平行で軸を通るスライスとして表示されています。表示されている構造は、100%の体積を包含する1.8 Sigmaで等高線処理した3D密度マップのサーフェスレンダリングによるものです。

このビデオを視聴することで、クライオ電子顕微鏡を用いてアセンブルされた分子の3D構造を得る方法について、深く理解することができます。