クライオ電子顕微鏡によるHIV - 1キャプシドアセンブリの構造とヘリカル実空間の反復再構成

この手順の全体的な目標は、クライオ電子顕微鏡を使用してヘリ集合分子の三次元構造を取得する方法を提供することです。このプロトコールは、凍結水和EMグリッドを調製する際に塩濃度を一時的に低下させるための急速希釈法と裏面ブロッティング法を使用したクライオEM試料調製から始まります。このプロセスにより、タンパク質の安定性を確保しながら、バックグラウンドノイズを低減し、データ収集に続くクライオEM低線量データ収集中のS/N比を向上させることができます。

回折パターンのヘリカルインデックス作成が完了しました。その後、画像処理が行われ、続いて実空間の3D再構成が行われ、HIVの1つのキャプシドまたはcaチューブの最終的な密度マップが得られます。一般に、この方法に不慣れな個々の人は、最適なデータ収集と分析のためのいくつかの重要なポイントがあるため、苦労します。

例えば、HIVの場合、1つのキャプシド管状集合体は、1つのモル源溶液でのみ形成され、構造に影響を与えることなく塩分濃度を急速に低下させます。高品質のクライオEM画像を取得することが重要です。チューブ画像の場合、重要なチューブにインデックスを付けるために何をすべきか、また、どのソフトウェアが3D再構成を行うと見なすことができるかを学ぶのは非常に困難です。

このビデオでは、物理オブジェクトの3D再構成を取得するための詳細でわかりやすいアプローチを提供し、実験の参考として使用することができます。Dr.Pujaと一緒に手順を実演します。私たちは両方ともDr.Laboratoryのポスドクです クライオエム用のHIV Oneキャプシドタンパク質アセンブリを準備するには、グローで始まり、25ミリアンペア未満の200メッシュ銅グリッドの炭素側を25秒間放電します。

ネブライザーを使用して、自家製の手動重力プランジャーである環境チャンバー内の湿度を80%にします。その間、液体窒素が付いているvitroのbottのプランジャーdoerの液体のエタンを冷却し、手動重力プランジャーにプランジの凍結doerを取付ける。次に、鉗子を使用して、はさみをグリッドの端に閉じて固定します。

2.5マイクロリットルの組み立て済みタンパク質溶液をグリッドのカーボン側に塗布します。次に、グリッドのカーボン側を反対側に向けて、鉗子をプランジャーにロードします。グリッドの裏側に3マイクロリットルの低塩希釈バッファーを追加します。

すぐにグリッドを同じ面の濾紙で拭き取ります。グリッドの裏面全体を濾紙に約6秒間密着させてください。濾紙を取り外した後、すぐにグリッドを液体エタンに突っ込みます。

最後に、プランジャーから鉗子を取り外し、グリッドをグリッド収納ボックスにすばやく移します。凍結した水和グリッドをFEI polar G 2電子顕微鏡にロードして、クライオ電子顕微鏡を開始します。200キロボルトで動作し、gatin 4K by 4K CCDカメラを装備。

低線量検索モードでは、約200 xの倍率を追加し、適切な氷のある領域のグリッド全体をスクリーニングします。これらの領域の位置をステージ・ファイルに保存します。

保存した位置を呼び出し、これらの領域をさらにスクリーニングします。低線量検索モードで3, 900倍の倍率を追加します。データ収集のために、穴の上に吊り下げられた長いチューブを含むことを特徴とする、均一な薄い層の氷がある領域を選択します。

すべての領域を 2 番目のステージ ファイルに保存します。露出モードに切り替えます。59, 000 x の倍率を追加し、100 マイクロメートルの対物レンズ開口部をはめ込みます。

次に、客観的なスティグマとビーム強度を調整して、露光ごとにオングストロームの2乗で約15電子の線量にします。低用量検索モードに戻り、保存した位置に移動します。適切なチューブを特定して中央に配置します。

CCDカメラをフォーカスモードに切り替えて、フォーカスを調整し、通常0.5〜2.5マイクロメートルの焦点ぼけ値を設定します。次に、露光モードに切り替えて、露光時間を0.3〜0.5秒に設定し、オングストロームの2乗あたり15電子の線量を設定します。プレートカメラで画像を収集し、露出が撮影される前にフィルムが10秒間落ち着

画像が収集されたら、次に保存した位置に移動し、このプロセスを繰り返してさらに画像を収集します。フィルムをフルパワーのD 19で12分間現像します。次に、Nikon Super cool scan 9, 000 EDスキャナーを使用して、6.35マイクロメートルのピクセルサイズで画像をデジタル化します。

らせん状の物体は、2つのパラメータでインデックスを付けることができます。らせん状のオブジェクトの表面格子のフォラー変換におけるベッセル次数Nと層線番号L。各レイヤーラインはNとLで特徴付けられ、HインデックスとKインデックスで示される表面格子上の一連のラインに対応します。

ヘリカルインデックスを開始するには、ImanのプログラムHelixボクサーを使用して、均一な直径の比較的長くまっすぐなチューブをボックスアウトし、画像をMRC形式で保存します。次に、イマンのプログラムボクサーを使用してチューブの半径を測定します。MRCパッケージのI-M-G-C-C-Fなどの相互相関ベースのプログラムを使用して、HELのリピート距離を決定します。

次に、ホワイエを計算します。リピート距離の積分である新しいボックスの長さで変換します。次に、FFTピクセル単位でゼロとゼロの2つの基本表面格子ベクトルを定義する2つの主層線を選択します。

フーリエ変換の 2 つの主層線の最大振幅の半径だけでなく、層の線番号も決定します。層の線番号と 2 つの主層線のベッセル次数の値を考えると、サブユニット間の回転と 1 つの星のらせんの軸方向の上昇は、書かれた手順で説明されている選択規則を使用して取得できます。これらの 2 つの実数は、チューブのスクリュー対称性を表します。

3D再構成は、Imanプログラムを使用した粒子のセグメンテーションから始まります。ボクサー。らせん粒子を含む顕微鏡写真を開いた後、ボクサーのコントロールパネルで粒子を重なり合うセグメントにカットします。らせんモードを選択し、ボックス化のパラメータを設定します。

ボックスのサイズはパーティクルの直径よりも大きく、OLA の値はボックス サイズの約 90% にする必要があります。左にすると、パーティクルボクサーの両端をクリックすると、らせんの長さに沿って一連のパーティクルボックスが自動的に生成され、ボックス化されたセグメントとその座標が保存されます。次のステップは、I-H-R-S-Rで処理する前に、反復ヘリカル実空間再構成法I-H-R-S-Rを使用して初期3D再構成を実行することです。

クライオ電子顕微鏡画像のコントラストを反転し、LOWPASSフィルタリングを適用します。次に、「generator」と入力して、I-H-R-S-Rプログラムのグラフィカルインターフェイスを開きます。ボックス化されたパーティクルスタックのすべての情報(スタックの名前とパス、スタック内の画像の数、対称パラメータの値など)をグラフィカルインターフェースに提供します。

[完了] ボタンをクリックして、再構築スクリプトを作成します。B 25 SP。私は最初の基準として中実または中空のシリンダーを使用し、定義されたスクリュー対称性(通常は数サイクル後に発生します)に変化がなくなるまで手順を循環させます。右らせん対称性は、安定して収束した再構成をもたらすはずです。

最後のサイクルで生成された再構成は、さらなる改良のための初期参照として使用されます。最後に、I-H-R-S-R によって生成された 3D 密度マップを、リファインメント中の追加のリファインメントの初期参照として使用して、反復的なリファインメントによる 3D リコンストラクションを実行します。らせん対称性は、サブユニット間の回転と軸方向の上昇に固定され、I-H-R-S-R手順から決定されます。

次に、プログラムを使用して顕微鏡写真に存在する焦点ぼけと乱視を決定します CTF find three と CTF 傾斜 と呼ばれるスパイダー プログラムを使用して FT と mu は、粒子セグメントをコントラスト伝達関数で乗算します。略称CTFは、マルチリファレンスアライメントを使用して、参照ボリュームの投影とCTF補正画像を比較することにより、投影マッチングを実行します。アウト・オブ・プレーンの傾斜角度の変動はプラスマイナス10度に制限され、1度ステップでサンプリングすると、ゼロ度または180度に近いプレーン角度での高い相関係数や制限されたXシフトなどの制約が導入されます。

各セグメントの整列パラメータには、制約を満たすセグメントのみを再構成に含めます。各反復的な細分化サイクルの後、後方投影を使用して3D再構成が生成され、CTFの2乗で一部で除算され、らせん対称性が課せられて対称性ボリュームが生成されます。反復的なリファインメントは、新しい 3D リコンストラクションの解像度がこれ以上向上しない場合に終了します。

単一のHIV 1キャプシドアセンブリである92 eチューブをボックスアウトし、そのフーリエ変換をヘリックインデックスとして計算し、2つの半径、層線番号、および層線1のゼロとゼロ1の最大振幅の半径を決定しました。次に、負の 12 と 11 の終了値を、それぞれ 1 つの 0 と 0 1 に対して計算し、リピート距離は 5195.48 オングストロームでした。チューブのスクリュー対称性は、デルタZが6.81オングストロームに等しく、デルタ5が328.88度に等しいと決定され、デルタZとデルタ5はI-H-R-S-Rを使用して7.13オングストロームと328.86度に精製され、10回の反復サイクル後に初期再構成が生成されました。

反復的な改良後の最終的な再構成により、I-H-R-S-Rで計算された初期モデルから密度マップが大幅に改善されました。キャプシドアセンブリチューブの密度マップは、チューブ軸に平行で表面に近い、チューブ軸に垂直でチューブ軸に平行でチューブ軸を通る3つの直交スライスとして表示されます。表示される構造は、1.8シグマで等高線化された3D密度マップの表面レンダリングから得られ、100%の体積を囲んでいます。

このビデオを見れば、クロウ電子顕微鏡を使用して味方集合分子の3D構造を取得する方法について非常によく理解できるはずです。