Name: 腸神経系ではα-シヌクレインの介在物の強制経口および画像解析を用いたロテノンの経口投与 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 学ぶロテノンの経口投与とα-シヌクレイン蓄積の画像解析による腸神経系の神経毒性研究法。マウスを用いたこの手法は、パーキンソン病の病因解明と予防戦略開発に貢献します。

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ペドロバリーデラマーサ財団は、この作業を支持した。

ロテノンの1）胃内投与<ol><li>動物を秤量する。 </li><li>必要なロテノン/車両溶液の総容量を計算します。動物の重量のグラムあたりこの場合は0.01ミリリットル。 </li><li>以前に計算されたロテノン溶液の体積（0.625 mg / mLのロテノン、4％カルボキシメチルセルロースおよび1.25％のクロロホルム）または車両の溶液（4％カルボキシメチルセルロースおよび1.25％のクロロホルム）で1 mLシリンジを充電してください。このケースでは、5 mg / kgのロテノンの投与量に相当する。 </li><li>マウスをピックアップし、片手でマウスの尾を持って、他の手の最初の二つの指でそれを引いて、首の皮膚を伸ばす。 </li><li>ヘッドは2本の指で固定されると、手のひらに対してそれを傾くと逆さまそれを回す。第四および第五の指を使って尾を修正。 </li><li>背面に向かって頭にしておくと、マウスの口を開くために口蓋を押してください。ゆっくりと口の中で強制経口投与を紹介。強制経口投与針ではなく、通常の針を使用することが重要です。ゆっくりと、十分胃の方向に強制経口投与を移動する。これは、肺になっ物質を避けることができます。 </li><li>優しく塞栓を押して、ロテノンのソリューションや車両を管理する。完了すると、徐々に強制経口投与を抽出する。 </li><li> oneケージからすべての動物が終了するまで戻って別のケージで動物を置きます。 </li></ol> 2）免疫染色の手順<ol><li>治療後、マウスは、ケタミンは100 mg / kgウントXylazin 10 mg / kgをipおよびintracardially PBS中4％パラホルムアルデヒドで灌流を使用して麻酔する。 </li><li>ガッツはその後、解剖によって抽出され、一晩15％ショ糖に配置されます。翌日、組織が30％スクロースに転送し、4で再び一晩インキュベート℃に</li><li>組織は、組織- TEKに配置し、使用するまで-80℃の冷凍庫に保存されます。 </li><li>クライオスタットを用いて、20ミクロンの小腸の断面積はSuperfrostスライドに転送されます。 </li><li>抗βIII-チューブリンと抗α-シヌクレイン抗体を使用してプロシージャをブロックして免疫染色することはその後、前述の9として実行されます。 </li></ol> 3）α-シヌクレインのインクルージョン画像解析それは画像の起源を知らない外部の人が分析を行うことをお勧めします。したがって、データが体系化されるべきである。画像解析は、フィジーのソフトウェアを用いて行った。 <ol><li>共焦点画像ファイルを開きます。それは各チャネル独立に動作させることが可能になるようにし、チャネルを分割する。 </li><li>解析]を使用して選択する&gt;スケールを設定し、1ピクセルサイズを設定するつもりはないそれらのチャネルを閉じます。 0.13（これは使用目的や解像度に依存します）に既知の距離を設定し、グローバルをクリックしてください。画像のサイズは現在、ミクロン単位で表示されます。 </li><li> α-シヌクレインチャンネルを選択して、神経節を選択し、選択はすべてのスライスに神経節を囲むことを確認してください。 </li><li>プレス画像&gt;画像を複製する重複。神経節を選択した状態で、画像のみが神経節の大きさが複製されます。 </li><li>編集&gt;クリア外側を押してください。選択された領域の外側で画像の一部が黒になります。 </li><li>手順が行ったどれだけ後の手順で決定するイメージを再度複製する。バックグラウンド比のノイズへの高い信号を持っている画像は、画像解析には使用しないでください。 </li><li>イメージ&gt;調整&gt;しきい値を選択し、[MaxEntropy]を選択します。その後の手順がうまくいったことを保証するためにトリミングされた画像と元のスライス上に移動。エントロピーのしきい値は、輝度信号レベルの画像のヒストグラムに基づいており、この閾値よりも高い強度を持つピクセルだけが黒の画像の上に白で表示されますを選択します。 </li><li>プロセスを選択して、滑らかにします。このステップでは、滑らかなエッジの画像のpixeledエッジを変換します。 </li><li>プロセスを選択し、[バイナリ]をクリックし、バイナリを作成]を選択します。画像は白画像上に黒として表示されます。 </li><li>重複した画像上で次のステップを実行するためにイメージを複製する。 </li><li>解析&gt;粒子を分析をクリックしてください。 [表示]を選択します：アウトラインをし、集計]をクリックしてください。残りの設定は、デフォルトで葉のはずです。この関数は、信号と一緒にグループ化されているものを持つピクセルの合計数を認識します。信号に加えてピクセルのグループの数と平均サイズと画素の全表面が報告されています。 </li><li>うまく調整する最大のスライスを比較して選択します。スライスがマークされます。 </li><li>トータルα-シヌクレインの表面、介在物の数と、平均粒径を持つデータテーブルをコピーします。他のExcelスプレッドシートまたは注釈付きにデータを貼り付けます。 </li><li>フィジーに戻るとβ-チューブリンのチャンネルで以前に選択したスライスを見つけ、そしてそれを選択します。 </li><li>神経節の領域を選択して、測定を選択し、[分析]をクリックします。別のテーブルが表示されます神経節の全表面。 </li><li> α-シヌクレインの測定の近くにExcelシートにテーブルからデータを抽出したり、他の場所にそれをコピーします。 </li><li>エクセルを使用して、総α-シヌクレインの表面と神経節の大きさで正規化された包接数を取得するために神経節の表面からα-シヌクレインの測定で得られたさまざまなパラメータを分割。 </li></ol> 4）代表者の結果強制経口投与プロトコルが正しく実行されると動物のための不便は最小限です。ロテノンのこの濃度を使って治療は、血液中のロテノン濃度なしENS上ロテノンの局所効果を可能にし、筋肉や脳ミトコンドリア複合体の阻害、私も治療の1.5ヶ月（図1参照）の後。画像解析が正しく行われている場合、α-シヌクレインのパターンの厳密な分析が可能なはずです。それは、α-シヌクレイン（合計面）、α-シヌクレインのセルのパターン（封入体の数）とα-シヌクレイン封入体の存在（介在物寸法）（図2）の合計額に信頼性の高いデータを提供します。 <img src="/files/ftp_upload/2123/2123fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。ロテノンの運動機能障害は、血液や中枢神経系におけるロテノンの検出なしでマウスを処理した。 、標準（50 ng / mL）を、20、10および5 mg / kgを投与したマウスの脳試料からのクロマトグラム。BとC、ロテノンの血中濃度（B）およびCNS（C）の定量化。B、血中レベル1 、治療後の2と3時間。マウスは3つのグループ（N = 3）に分割し、2.5、5、10、20 mg / kgのロテノン（N = 3）で処理した、血液300μLのはロテノン投与後1、2、3時間を抽出し、一緒にプールしたHPLC分析。C、マウスは5（N = 3）、10（N = 3）および20（N = 1）mg / kgのロテノン、脳や脳幹で一日一回一週間の治療を受けていた1と2時間後に抽出した最後の管理およびHPLC分析。D、1.5カ月治療したマウスの筋肉および脳のサンプル中のミトコンドリア複合体I活性のために準備。 <img src="/files/ftp_upload/2123/2123fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。ローカルで管理さロテノンは、ENS神経節における神経膠症とα-シヌクレインのリン酸化、蓄積して凝集を誘導する。（スケールバーは20μm）。、B、C、抗βIII-チューブリン、α-シヌクレインと十二指腸のDAPI染色（B）と回腸（は、C）のセクション。 3ヶ月のコントロール（）と比較するとBの矢印は、1.5ヶ月の治療は、腸神経系の神経節内の増加、α-シヌクレイン斑点状のパターンを誘発した。 Cの矢印、3ヶ月の治療は、より大きなα-シヌクレインのインクルージョン（ø&gt; 6μm）の形成を誘導した。D、抗α-シヌクレイン、チオフラビンSとDAPIを用いて免疫蛍光染色。 Dの矢印、わずか3ヵ月投与したマウスは、これらの大規模なα-シヌクレインの蓄積の凝集を示した。E、E'、E ''、画像解析の定量化の手順。E、ENSの神経節を示す定量化に使用される画像の例は、示すαシヌクレインに対する免疫染色別のインクルージョン。E'、画像解析のプロトコルの後に得られた画像の例。E ''、オリジナルのインクルージョン（緑）とプロトコル（黄色の線）を実行後に得られる表現の一部との間のオーバーラップ。FG、に示すように実験の定量化ACは、自動セグメンテーションとエントロピーベースのスレッシュホールド法を用いて行った。シングルアスタリスク、P &lt;0.05、および二重アスタリスク、P &lt;0.01。F、各列が総α-シヌクレインの面/神経節面を表す。G、各列には、α-シヌクレイン封入体/神経節面の数の合計を表します。すべてのグラフは、平均± SEMを示す

<ol><li>Braak, H., de Vos, R. A., Bohl, J., Del Tredici, K., K, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+alpha-synuclein+immunoreactive+inclusions+in+Meissner%27s+and+Auerbach%27s+plexuses+in+cases+staged+for+Parkinson%27s+disease-related+brain+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Gastric alpha-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology.</a> Neurosci Lett. 396, 67-72 (2006).</li>
<li>Wakabayashi, K., Takahashi, H., Ohama, E., Ikuta, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%3A+an+immunohistochemical+study+of+Lewy+body-containing+neurons+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease: an immunohistochemical study of Lewy body-containing neurons in the enteric nervous system.</a> Acta Neuropathol. 79, 581-583 (1990).</li>
<li>Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+occurrence+of+Lewy+bodies+in+the+dorsal+vagal+nucleus+in+a+patient+with+late-onset+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Restricted occurrence of Lewy bodies in the dorsal vagal nucleus in a patient with late-onset parkinsonism.</a> J Neurol Sci. 165, 188-191 (1999).</li>
<li>Braak, H., Sastre, M., Bohl, J. R., de Vos, R. A., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%3A+lesions+in+dorsal+horn+layer+I%2C+involvement+of+parasympathetic+and+sympathetic+pre-+and+postganglionic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease: lesions in dorsal horn layer I, involvement of parasympathetic and sympathetic pre- and postganglionic neurons.</a> Acta Neuropathol. 113, 421-429 (2007).</li>
<li>Braak, H., Ghebremedhin, E., Rub, U., Bratzke, H., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+in+the+development+of+Parkinson%27s+disease-related+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Stages in the development of Parkinson's disease-related pathology.</a> Cell Tissue Res. 318, 121-134 (2004).</li>
<li>Gorell, J. M., Johnson, C. C., Rybicki, B. A., Peterson, E. L., Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+risk+of+Parkinson%27s+disease+with+exposure+to+pesticides%2C+farming%2C+well+water%2C+and+rural+living%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">The risk of Parkinson's disease with exposure to pesticides, farming, well water, and rural living.</a> Neurology. 50, 1346-1350 (1998).</li>
<li>Semchuk, K. M., Love, E. J., Lee, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+exposure+to+agricultural+work+and+pesticide+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and exposure to agricultural work and pesticide chemicals.</a> Neurology. 42, 1328-1335 (1992).</li>
<li>Butterfield, P. G., Valanis, B. G., Spencer, P. S., Lindeman, C. A., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+antecedents+of+young-onset+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Environmental antecedents of young-onset Parkinson's disease.</a> Neurology. 43, 1150-1158 (1993).</li>
<li>Pan-Montojo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+Parkinson%27s+disease+pathology+is+reproduced+by+intragastric+administration+of+rotenone+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Progression of Parkinson's disease pathology is reproduced by intragastric administration of rotenone in mice.</a> PLoS One. 5, e8762-e8762 (2010).</li>
<li>Sherer, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+toxicity+in+rotenone+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease.</a> J Neurosci. 23, 10756-10764 (2003).</li>
<li>Bove, J., Prou, D., Perier, C., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-induced+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Toxin-induced models of Parkinson's disease.</a> NeuroRx. 2, 484-494 (2005).</li>
<li>Inden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+of+mouse+nigrostriatal+dopaminergic+system+induced+by+repeated+oral+administration+of+rotenone+is+prevented+by+4-phenylbutyrate%2C+a+chemical+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration of mouse nigrostriatal dopaminergic system induced by repeated oral administration of rotenone is prevented by 4-phenylbutyrate, a chemical chaperone.</a> J Neurochem. 101, 1491-1504 (2007).</li>
</ol>

フランシスコパン- Montojoは、この動物モデル（出願番号PCT / EP 2009/005688）の保留中の特許出願しています。

胃内投与は、以前は12を行われている。しかし、印伝の原稿によると、ロテノンは、0.5％カルボキシメチルセルロースのナトリウム塩（CMSS）単独で溶解投与した。ロテノンは高いliphophylic物質です。したがって、ロテノンは、単独で0.5％のCMSSに溶解することができないので、行えば沈殿する。クロロホルムを使用すると、沈殿を避ける均等に分散さロテノン懸濁液を作成します。また、CMSSの農薬の高濃度のために、投与溶液の最終容積も大幅に減少しています。このように、行政の合併症を減らすことができます。 私たちは、ストレートgavagesの使用をお勧めします。マウスの食道は、直接胃の片側に終わる、まっすぐです。したがって、ストレートgavagesはこのタスクのためのより適切です。 共焦点画像の画像解析は、フィジーのソフトウェアを使用して行われました。このソフトウェアのプラグインがオンラインでダウンロードすることができます。画像解析のための免疫蛍光染色は、前述の9として実施した。画像は、L...

<table><tbody><tr><td>ロテノン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>ドイツ</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3313.1</td><td>ドイツ</td></tr><tr><td>カルボキシメチルセルロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5678</td><td>ドイツ</td></tr><tr><td>経口投与用ゾンデ 1,2 mm x 60 mm</td><td>Unimed</td><td></td><td>スイス</td></tr><tr><td>LSM 510</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>http://pacific.mpi-cbg.de</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

腸神経系ではα-シヌクレインの介在物の強制経口および画像解析を用いたロテノンの経口投与

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

パーキンソン病（PD）患者では、関連する病理学は、腸神経系（ENS）1,2、嗅球（OB）、迷走神経背側運動核（DMV）3、中間外側とりわけ関与する特徴的なパターンに従います。脊髄の4と黒質の核、4,5病の神経病理学的ステージングの基礎を提供する。 ENSとOBが最も露出神経の構造と影響を受ける最初のものです。興味深いことに、PDは、農薬暴露6-8関係している。ここでは詳細に私たちの以前の研究9で使用される2つの方法を示しています。 ENSで局所的に作用するロテノンの影響を分析するために、我々は1歳C57/BL6マウスに強制経口投与を使用してロテノンを投与。ロテノンは強くミトコンドリア複合体のI 10を阻害する広く使用されている農薬です。それは非常に親油性と胃腸管11に吸収される。我々の結果は、ロテノンの5 mg / kgの投与は、筋肉や脳内のミトコンドリア複合体Iの活性を阻害しなかったこと。示したしたがって、我々の投与方法のロテノンを使用すると、肝門脈のシステムを横断しておらず、もっぱらENSに作用していたことを示唆している。ここでは、ENSにおけるα-シヌクレインの蓄積で、農薬の効果を分析するために使用される強制経口投与し、画像解析のプロトコルを使用して農薬を管理する方法を示しています。最初の部分は、目的の正確な濃度で殺虫剤（ロテノン）の胃内投与を可能にする方法を示しています。第二の方法は、画像解析ソフトウェアを使用してENSにα-シヌクレインの蓄積を分析するために半自動画像解析のプロトコルを示しています。

パーキンソン病は、農薬への暴露に関係している。ここでは、所望の濃度と腸神経系ではα-シヌクレインの蓄積で、その効果を分析する方法で胃管を使って殺虫剤を提供する方法を示しています。

パーキンソン病（PD）患者において、関連する病理は、とりわけ腸管神経系（ENS）を含む特徴的なパターンをたどります 1,2, ...

運動機能および言語機能の障害を含むパーキンソン病の症状は、脳内のドパミン分泌細胞の活性低下によって引き起こされます。腸管神経系と嗅球は最も外部に曝露されている神経構造であり、最初に影響を受ける部位です。パーキンソン病は、農薬への曝露との関連が指摘されています。農薬が腸管神経系に及ぼす影響を解析するため、マウスに農薬rooneを経口投与します。その後、マウスの心臓内灌流に4%パラホルムアルデヒドを用い、脳および腸管神経系を固定します。組織を摘出し、調製後、PD関連タンパク質について免疫染色を行います。共焦点顕微鏡によって得られたBeta three tubulinおよびalpha synucleinの画像は、農薬に曝露した動物の腸管神経系ニューロン内にalpha synucleinが蓄積していることを示しています。rotenoneの全身投与などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、rotenoneの効果が腸管神経系に限定されることが保証される点にあります。この手法は、パーキンソン病の病因や進行のメカニズムなど、重要な疑問を解明するのに役立ちます。本手法の意義は、新たな治療標的や診断法の開発を可能にすることから、パーキンソン病の治療および診断へと広がります。この方法はパーキンソン病の病態生理に関する知見を提供しますが、他の環境毒素が腸管、交感神経系、副交感神経系、および腸壁に及ぼす影響の研究など、他のシステムにも応用可能です。一般的に、この手法に不慣れな人は、ゾンド投与（gavage）を習得するまでに時間がかかるため、苦労することがあります。私は、農薬とパーキンソン病の関連性についての記述を読んだとき、初めてこれらの手法を考案しました。また、2005年にベルリンで開催された世界パーキンソン病大会におけるCORAsの高レベルなカンファレンスを視察できたことも有益でした。この手法の穏やかな実証が必要です。マウスの解剖学的構造はヒトとは異なるため、ゾンデ（gavage）によるolの投与は困難です。一方で、これらの画像解析にはカスタマイズされた手順が用いられました。まず、動物の体重を量ることからプロトコルを開始します。次に、ロテノン（rotenone）の適切な投与量を算出します。動物の体重1gあたり0.01mL必要であり、これはrooneの投与量5mg/kgに相当します。1mLシリンジにroone溶液を充填し、次に2本目のシリンジに溶媒を充填します。マウスを手に取り、片手でマウスの尾を保持します。もう一方の手の人差し指と中指で、首の皮膚を引っ張って伸ばします。頭部を2本の指で固定したら、手のひらに押し当てて反転させます。その後、尾部を固定します。薬指と小指を使用して、頭部を後方に保持したまま口蓋を押し、マウスの口を開けます。胃管を口の中にゆっくりと挿入します。胃管の全長が挿入されるまで、胃の方向へゆっくりと進めてください。物質が肺に入り込むのを避けるため、エンボラスをゆっくりと押しながら、roone溶液または溶媒を投与します。完了後、ゾンデをゆっくりと抜き、1つのケージ内のすべての個体の処置が終わるまで、動物を別のケージに戻します。処置後、マウスに4%パラホルムアルデヒドを心腔内投与して灌流固定します。PBS中で腸管を解剖により摘出し、15% sucroseに一晩浸します。翌日、組織を30% sucroseに移し、4°Cで再び一晩インキュベートします。その後、組織を-80°Cのフリーザーに入れて使用時まで保存します。クライオスタットを用いて、腸管を20 micronの厚さで切片化します。切片をfrostスライドに転写し、ブロッキングおよび免疫染色の手順を行います。次に、抗β3-tubulin抗体および抗α-synuclein抗体を用いて染色を行います。なお、データの解析は、外部の第三者が盲検法で行うことを推奨します。解析を開始するために、Fijiソフトウェアを開きます。共焦点画像ファイルを開いてください。次に、各チャネルを個別に処理できるように、チャネルを分割します。使用しないチャネルを閉じ、選択、解析、設定、スケール調整を行い、ピクセルサイズを1に設定します。既知の距離を0.13に設定し、「global」をクリックします。これで、画像のサイズがマイクロメートルで表示されます。alpha synucleinチャネルを選択し、神経節を選択します。その際、すべてのスライスにおいて選択範囲が神経節を囲んでいることを確認してください。神経節のみが選択された状態で画像を複製すると、神経節と同じサイズの画像が複製されます。編集（edit）を押し、クリア（clear）を選択すると、選択領域外の画像部分が黒くなります。手順が適切に完了したかを確認するために、再度画像を複製してください。S/N比（信号対背景ノイズ比）が低い画像は、画像解析に使用しないでください。「Image」から「Adjust Threshold」を選択します。次に「Max Entropy」を選択します。その後、クロップ後の画像と元の画像の各スライスを確認し、処理が適切に行われたかを確認してください。tropic thresholdにより、画像ヒストグラムに基づいた強度信号レベルを選択します。これにより、この閾値よりも強度の高いピクセルのみが、黒背景に白で表示される画像選択プロセスに抽出されます。次に、「smooth」をクリックします。このステップにより、画像のピクセル化されたエッジが滑らかなエッジに変換される画像選択プロセスが行われます。次に、「binary」をクリックし、「Make binary」を選択します。画像が白地に黒の画像として表示されます。複製された画像を用いて次のステップを行うには、「analyze」をクリックし、「analyze particles」を選択します。その後、「show outlines」を選択し、「summarize」をクリックしてください。その他の設定はデフォルトのままにしてください。この機能では、シグナルを持つ全ピクセル数と、それらが集まって構成されるシグナルを持つピクセルの総表面積を認識します。さらに、ピクセルのグループ数と平均サイズが報告されます。適切に調整されており、総面積が最大のスライスを比較して選択します。そのスライスにマークを付けます。総alpha synuclein表面積、インクルージョン数、および平均粒子サイズのデータテーブルをコピーしてください。データをExcelスプレッドシートに貼り付けるか、別の場所にメモしてください。Fijiに戻ります。beta tubulinチャネルで previously selected slice を探し、それを選択します。神経節領域を選択し、[analyze]（解析）をクリックします。次に [measure]（測定）を選択してください。神経節の総表面積を示す別の表が表示されます。表からデータをExcelスプレッドシートに抽出し、α-synucleinの測定値付近に配置するか、Excelを使用して別の場所にコピーします。α-synucleinの測定で得られた各パラメータを神経節の表面積で除し、神経節サイズで正規化した総α-synuclein表面積および封入体数を算出します。腸管神経系に局所的に作用するrotenoneの効果を分析するため、1歳のC57BL/6マウスに殺虫剤rotenoneを5 mg/kgの用量で経口投与しました。ここに示すクロマトグラムは、投与1時間後にrotenoneのピークが存在することを示しています。対照群として、rotenoneを20 mg/kgおよび5 mg/kg投与したマウスを用いました。血液、脳および脳幹抽出液中のロテノン濃度を、ここに示すようにHPLCで測定しました。ロテノンを5 mg/kgで経口投与しても、HPLCによる測定では、投与1、2、または3時間後の血液中に測定可能な濃度は認められませんでした。このグラフは、投与したマウスの脳および脳幹におけるロテノン濃度を示しています。10 mg/kg以下のロテノン抽出物を投与して1時間後、脳および脳幹サンプル中にロテノンは検出されませんでした。投与1時間後、1.5ヶ月間処置したマウスの筋肉および脳サンプルにおいて、ミトコンドリア複合体Iの活性を評価しました。群間に有意な差はなく、ミトコンドリア複合体Iの抑制も見られなかったため、これらの領域にロテノンが存在しなかったことが確認されました。rone投与後のパーキンソン病のレビー小体成分であるalpha synucleinの解析により、alpha synucleinの総表面量、alpha synuclein封入体の存在、および細胞内におけるalpha synucleinのパターンの確実な決定が可能になります。この図は、ここに見られるように、十二指腸および回腸切片におけるanti beta three tubulin、alpha synuclein、およびDAPI染色の結果を示しています。roach knownによる1.5ヶ月間の処置により、3ヶ月間のコントロール群と比較して、腸管神経系神経節内のalpha synucleinの点状パターンの増加が誘導されました。このパターンは回腸と十二指腸の両方で観察できます。3ヶ月間の治療後、抗alpha synuclein抗体を用いた免疫蛍光染色により、より大きなalpha synuclein封入体の形成が確認されます。また、theof、flavin、およびDPIを用いた解析では、3ヶ月時点で初めてより大きなalpha synuclein凝集体の集積が認められます。この実験では、自動セグメンテーションおよびエントロピーベースの閾値処理法を用いて解析を行いました。左側のグラフでは、各列は神経節表面に対する総alpha synuclein表面積を表しています。右側のグラフでは、各列は採取された神経節表面あたりの総alpha synuclein封入体数を表しています。これらのデータから、ロテノンを局所投与することで、腸管神経系神経節においてグリオシスを伴うalpha synucleinのリン酸化、蓄積、および凝集が誘導されることが示唆されます。この手法に習熟し、正しく実施できれば、動物1匹あたり1分で完了させることができます。本手順を実施する際は、ゾンデをゆっくりと挿入させることが重要であり、もし抵抗がある場合は、一度抜いてから再度これらの手順に従って挿入してください。また、HPLC、免疫染色、画像解析などの他の手法も併用可能です。これにより、他の領域の解析や、物質の効果、あるいは投与後の血液中における物質の存在を確認することができます。この手法により、神経科学者が腸管神経系に対する環境神経毒の影響を調査する道が開かれました。このビデオを視聴後、ゲージを正しく適用し、免疫化学によって得られた画像を解析できるようになるはずです。腐敗したものを取り扱う際は非常に危険であることを忘れないでください。したがって、本手順の実施中は手袋およびマスクを着用することを推奨します。

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このビデオは、α-シヌクレインフィブリルをマウスに注入して神経炎症を誘発する方法を示しています。このフィブリルは、変異したα-シヌクレインタンパク質を発現するトランスジェニックマウスに腹腔内に注入されます。中枢神経系に到達すると、原線維はニューロンに入り、変異したタンパク質の凝集を誘導します。凝集体は、隣接するニューロン、ミクログリア、およびアストロサイトに広がります。凝集体の認識は、ミクログリアが神経炎症を誘発し、ニューロンを損傷する引き金となります。...

α-シヌクレイン線維の注射によるマウスの神経炎症の誘導

ELISAが新しい定量的アプローチを提供することが説明されています。それは、シヌクレイノパシーのマウスモデル（M83）において、Ser129リン酸化されたα-シヌクレイン（αSD）またはタンパク質のC末端部分に対する抗体を用いて、疾患に関連するα-シヌクレインを特異的に検出します。...

人間A53T変異αシヌクレインを過剰発現するトランスジェニックマウスの脳における強化ELISAによる疾患関連αシヌクレインの検出

この原稿は、ウイルスベクターを介した局所遺伝子送達が、中枢神経系における導入遺伝子の発現にどのように魅力的な方法を提供するかを説明しています。...

組換えアデノ随伴ウイルスベクターの定位注射を介して、パーキンソン病のα-シヌクレインベースのラットモデルの開発

α-シヌクレイン線維の末梢接種後のトランスジェニックマウスにおける神経炎症の生物発光イメージング

ここでは、ラットの実質的なニグラ・パルス・コンパクでのドーパミン作動性ニューロン数の半定量的決定のための自動化された方法を提示する。...

自動画像解析を用いたげっ歯類モデルのサブスタチングニグラにおけるドーパミン作動性ニューロン密度の半定量的決定

この記事では、7点スコアリングシステムを使用して 、C.エレガンスにおけるドーパミン作動性ニューロンデンドライト形態の変化を一貫して定量化する方法を紹介します。このシステムは、神経変性疾患の遺伝的、化学的、および年齢ベースのモデルを利用したドーパミン作動性神経変性アッセイの分析を目的としています。...

カエノハブディティス・エレガンスにおけるドーパミン作動性ニューロン形態変化と変性の定量化

この研究は、パーキンソン病の前臨床モデルにおける神経炎症、神経変性、および運動障害を誘発するのに必要なベクター用量および曝露時間を解析する。ヒトα−シヌクレインをコードするこれらのベクターは、パーキンソン病に関連するシヌクレイン病理を再現するために黒質に送達される。...

ヒトα-シヌクレインをコードするアデノ随伴ウイルスベクターにより誘導されるパーキンソン病マウスモデルの解析

マウス中枢神経系の組織学的分析のための便利な重力供給灌流法が提示される。リン酸化α-シヌクレインの免疫蛍光検出は、パーキンソン病のマウスモデルにおいて実証されている。この研究はまた、経心経灌流、解剖、組織凍結/埋め込み、および凍結切片化ステップを包括的に記述している。...

マウス中枢神経系の組織学的解析のための重力供給経心筋灌流法

本プロトコルは、α−シヌクレイン凝集体の鼻腔内投与の方法を記載している。この手法は、パーキンソン病における嗅粘膜から嗅球へのα-シヌクレインの伝播に関する知見を提供します。...

α-Synuclein凝集体の鼻腔内投与技術

この資料では詳細に子宮内で大脳皮質およびマウスのE14.5における海馬をエレクトロポためのプロトコルについて説明します。また、このこれらの2つの脳領域で樹状突起と棘を研究する貴重な方法であることを示している。...

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーション

学ぶロテノンの経口投与とα-シヌクレイン蓄積の画像解析による腸神経系の神経毒性研究法。マウスを用いたこの手法は、パーキンソン病の病因解明と予防戦略開発に貢献します。

腸神経系ではα-シヌクレインの介在物の強制経口および画像解析を用いたロテノンの経口投与

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