腸神経系ではα-シヌクレインの介在物の強制経口および画像解析を用いたロテノンの経口投与

運動機能障害や言語機能障害などのパーキンソン病の症状は、脳内のドーパミン分泌細胞の活性の低下に起因します。腸管神経系と嗅球は、最も露出した神経構造であり、最初に影響を受けるものです。パーキンソン病は農薬への曝露と関連しています。

農薬の腸内神経系への影響を解析するために、マウスに経口強制経口投与することで殺虫剤ルーンを投与します。次に、マウスに4%パラフォーム、アルデヒド脳、腸神経系を心臓内灌流します。組織を抽出し、調製し、PD関連タンパク質の免疫染色を行います。

共焦点顕微鏡法によって取得されたβ-3チューブリンおよびαシヌクレインの画像は、農薬に曝露された動物の腸神経系ニューロン内にαシヌクレインが蓄積することを示しています。ロテノンの全身投与のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、この技術を使用して、ロテノンの効果が腸管神経系に限定されることが保証されることです。この方法は、パーキンソン病の病因や進行の根底にあるメカニズムなど、パーキンソン病の重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の意味は、タワー療法とパーキンソン病の診断を拡張し、新しい治療標的と診断方法の開発を可能にするためです。この方法は、パーキンソン病の病態生理学に関する洞察を提供しますが、腸管神経系、交感神経系、副交感神経系、および腸壁に対する他の環境毒素の影響の研究など、他のシステムにも適用できます。一般的に、この方法に不慣れな個人は、強制を習得するのに時間がかかるため、苦労します。

私が最初にこれらの方法のアイデアを得たのは、農薬とパーキンソン病との関連性について読んだときでした。また、2005年にベルリンで開催された世界パーキンソン学会で高CORA会議が開催されたことも参考になりました。この方法を平和的に実証することが必要である。

マウスは反対側の人間とは異なる解剖学的構造を持っているため、強制経口投与の方法は困難であり、画像分析はこれらの画像に対してカスタマイズされた手順で行われました。動物の体重を量ることからプロトコルを開始します。ロテノンの適切な量を計算します。

動物の体重1グラムあたり0.01ミリリットルが必要で、これは1キログラムあたり5ミリグラムに相当します。1ミリリットルのシリンジをルーン溶液で充電し、次に2番目のシリンジをビヒクル溶液で充電します。.マウスを手に取り、片手でマウスの尻尾を持ちます。

もう一方の手の最初の2本の指で首の皮膚を引っ張って伸ばします。頭を2本の指の間に固定したら、手のひらに立てかけて逆さまにします。尻尾を固定します。

4本目と5本目の指を使って、頭を後ろに向けて、口蓋を押してマウスの口を開きます。強制品をやさしく口の中に入れます。強制猶予を胃の方向にゆっくりと動かし、全長が挿入されるまで

物質が肺に入るのを防ぐために、塞栓を静かに押してルーン溶液またはビヒクルを投与します。.完了したら、強制牛をゆっくりと取り出し、1つのケージからすべての動物が終了するまで動物を別のケージに戻します。治療後、マウスは心臓内に 4% パラホルムアルデヒドを大量に投与されます。

PBSでは、次に腸を解剖によって抽出し、15%スクロースに一晩置く。翌日、組織を30%スクロースに移し、再び摂氏4度で一晩インキュベートします。その後、組織をマイナス80°Cの冷凍庫に入れ、クライオスタット20ミクロンの腸を使用して使用するまで保存します。

断面はロストスライドに移され、ブロッキングおよび免疫染色の手順が行われます。次に、抗ベータ抗体を使用して、3つのチューブリン抗体と抗ファシヌクレイン抗体を行います。外部の人がデータのブラインド分析を実行することをお勧めします。

分析を開始するには、フィジーソフトウェアを開きます。共焦点画像ファイルを開きます。次に、チャネルを分割して、各チャネルで可能な限り独立して作業できるようにします。

使用しないチャネルを閉じ、選択、分析、設定、スケーリング、およびピクセルサイズを1に設定します。既知の距離を0.13に設定し、globalをクリックします。画像のサイズがミクロン単位で表示されるようになります。

αシヌクレインチャネルを選択し、神経節を選択します。選択範囲がすべてのスライスで神経節を囲むことを確認します。ガングリオンを選択した状態で画像を複製すると、ガングリオンのサイズの画像のみが複製されます。

編集クリアを押すと、選択した領域の外側の画像の一部が黒くなります。画像を再度複製して、手順がどの程度うまくいったかを判断します。S/BACKGROUND ノイズ比が低い画像は、画像解析に使用しないでください。

画像調整のしきい値を選択します。次に、最大エントロピーを選択します。次に、トリミングされた画像と元の画像のスライスの上を移動して、手順がうまくいったことを確認します。

トロピック閾値は、画像ヒストグラムに基づいて強度信号レベルを選択し、この閾値よりも高い強度のピクセルのみが、黒地に白の画像選択プロセスで表示されます。次に、[スムーズ]をクリックします。この手順では、画像のピクセル化されたエッジを滑らかなエッジ選択プロセスに変換します。

次に、バイナリをクリックして、[バイナリ化]を選択します。画像は白地に黒の画像の複製画像として表示され、複製された画像に対して次のステップを実行し、[分析]、[粒子の分析]をクリックします。次に、[アウトラインを表示]を選択し、[要約]をクリックします。

残りの設定はデフォルトのままにしておく必要があります。この関数は、信号を持つピクセルの総数と、信号を持つピクセルの合計サーフェスでグループ化されたピクセルの総数を認識します。さらに、ピクセルのグループの数と平均サイズが報告されます。

よく調整される最大の合計面積を持つスライスを比較して選択します。スライスにマークが付けられます。αシヌクレインの総表面、介在物の数、および平均粒子サイズのデータテーブルをコピーします。

データをExcelスプレッドシートに貼り付けるか、別の場所に注釈を付けます。フィジーに戻ります。ベータチューブリンチャネルで以前に選択したスライスを見つけて選択します。

神経節領域を選択し、分析をクリックします。次に、[測定] を選択します。神経節の全表面を示す別の表が表示されます。

テーブルからアルファシヌクレイン測定値の近くにあるExcelスプレッドシートにデータを抽出するか、Excelを使用して別の場所にコピーします。αシヌクレイン測定で得られたさまざまなパラメータを神経節表面で割って、総α-シヌクレイン表面と包含数を求め、神経節サイズで正規化した封入数を求め、腸神経系に局所的に作用するルーンの影響を分析するために、既知の農薬腐敗のキログラムあたり5ミリグラムを1歳のC 57ブラックシックスマウスに経口強制経口投与しました。ここに示すクロマトグラムは、20ミリグラム/キログラムのロテノン10および5ミリグラム/キログラムのロテノンで処理した対照マウスの投与後1時間後に、ロタンの既知のピークの存在を示しています。

ロテノンレベルは、ここに示すように、HPLCによる血液および脳および脳幹抽出について決定されました。経口強制経口投与による腐病のキログラムあたり5ミリグラムの投与は、H plcによって決定されたように、治療後1時間、2時間、または3時間の血液中の測定可能なレベルをもたらさない。このグラフは、治療を受けたマウスの脳と脳幹の腐敗レベルを示しています。

抽出投与の1時間後10ミリグラム/キログラム以下のロテノンは、脳または脳幹サンプルにロトンレベルがないことを示しています。投与の1時間後、ミトコンドリア複合体を1.5ヶ月で治療したマウスの筋肉および脳サンプルで1つの活動を評価しました。ミトコンドリア複合体の阻害を示さなかったグループ間で有意差はなく、したがって、これらの領域にロンがなかったことが確認されました。

パーキンソン病、ロン投与後のレビー小体体型成分αシヌクレインの解析により、αシヌクレインの総表面量、αシヌクレイン封入体の存在、および細胞内のαシヌクレインパターンを確実に測定できます。この図は、ここで見られるように、十二指腸切片と回腸切片における抗β3チューブリン、αシヌクレイン、およびDAPI染色を示しています。ゴキブリによる1.5ヶ月の治療は、腸神経系神経節内のアルファシヌクレイン点状パターンの増加を誘発し、3ヶ月のコントロールと比較しても1つでした。

このパターンは、回腸と十二指腸の両方で見られます。3ヶ月後の治療後、抗αシヌクレイン、theof、フラビン、およびDPIを用いた免疫蛍光染色では、より大きなαシヌクレイン封入体の形成が見られ、3ヶ月後にのみより大きなαシヌクレイン蓄積の凝集が明らかになりました。この実験は、自動セグメンテーションとエントロピーベースの閾値法を使用して分析されました。

左のグラフでは、各列はαシヌクレイン表面から神経節表面までの合計を表しています。右側のグラフでは、各列は、採取した神経節表面あたりのαシヌクレイン封入体の総数を表しています。まとめると、これらのデータは、ロテノンの局所投与が腸神経系神経節における神経膠症を伴うアルファシヌクレインのリン酸化、蓄積、および凝集を誘導することを示唆しています。

この処置を試みる際には、強制器を優しく導入することが大切で、障害物が見つかった場合は、これらの手順に沿って取り出して再度導入するのが良いでしょう。HPLC、免疫染色、画像解析などの他の方法も実行できます。これにより、他の領域、物質の影響、さらにはその発生後の血液中の物質の存在を分析することができます。

この技術は、神経科学者が環境神経毒が腸神経系に及ぼす影響を調査する道を開きました。このビデオを見た後、ゲージを正しく適用し、免疫化学から得られる画像を分析できるようになるはずです。腐ったものを扱う作業は非常に危険であることを忘れないでください。

したがって、この手順を実行するときは、手袋とマスクの使用をお勧めします。ザ。