使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作子宮内でエレクトロポレーション
2012年7月26日
この資料では詳細に子宮内で大脳皮質およびマウスのE14.5における海馬をエレクトロポためのプロトコルについて説明します。また、このこれらの2つの脳領域で樹状突起と棘を研究する貴重な方法であることを示している。
この手順の目的は、マウスの大脳皮質と海馬の樹状突起と脊椎を視覚化し、遺伝的に操作するために、子宮内でエレクトロポレーションを使用することです。これは、まず、所望のプラスミドであるDNA溶液を子宮内の胚の側脳室に注入することによって達成されます。次に、パロ電極のさまざまな位置を使用します。
DNA注射によれば、大脳皮質または海馬がエレクトロポレーションされ、次に出生後または成人の望ましい段階になります。マウスを灌流し、脳を採取します。最後に、脳はビブラムで切片化されます。
最終的に、樹状突起とスパインは共焦点顕微鏡を使用して視覚化できます。ユニタリーエレクトロポレーションの技術は、非右および脊椎を研究する方法と比較していくつかの利点を提示する。実際、この技術により、まずこの側面を生体内で直接研究することができます。
さらに、電気操作におけるノックアウトマウスの作製と比較して、遺伝子抑制または遺伝子発現の影響を研究するための迅速なアプローチであり、特定の細胞構造だけでなく、特定の発達のポンでも、白と背骨を着用します。また、電気間操作に誘導システムを使用することは、ドンライトと脊椎の発達に関与する遺伝子間の機能的相互作用を特定するための有用なツールでもあります。確かに、ウイルスとは対照的に、例えば、それは私たちにとって厳しいです 細胞の同じ集団で複数のHNAまたは複数のトン遺伝子を組み合わせる DNAを水で目的の濃度に希釈し始め、0.05%の最終濃度に高速緑色染料を追加します マイクロパーペットプーラーを使用して、注射用のガラス針を引っ張ります。
妊娠中のマウスをイソフッ素を使用した麻酔導入チャンバーに入れ、酸素を毎分最大2リットル開きます。動物が筆記反射を失ったら、手術前のマスクに移します。両目にIGELを一滴垂らし、電気カミソリを使って腹部の毛を剃ります。
剃った部分をクロルヘキシジンで一度きれいにして、飛んでいる髪を集めます。動物を手術部位の2つ目のマスクに移し、動物を温熱パッドに背を向けます。花弁反射が失われたときに手術を開始します。
マスクと滅菌手袋を着用し、動物を滅菌ドレープで覆います。剃った部分をクロルヘキシジンで少なくとも3回きれいにします。メスを使用して、皮膚の正中線に沿って垂直に切開します。
ハサミを使う。線形肘に沿って腹部の筋肉に同様の切開を行います。最もアクセスしやすい胚を選択します。
リング鉗子を2つの胚の間に置き、胚鎖を腹腔から慎重に引き出します。この時点から、胚を滅菌した温熱済みPBSで水分補給してください。リング鉗子を使用します。
羊水嚢内の胚の位置を優しく操作し、リング間の頭部を安定させます。胚を子宮壁に近づけるために、そっと絞る。もう一方の手で、毛細血管ホルダーを取り、針を半球の中央に慎重に挿入して、側脳室をターゲットにします。
子宮壁の表面での針の動きを最小限に抑え、血管を突き刺さないように注意しながら、ペダルを踏んで約0.5マイクロリットルの緑色のDNA溶液を注入します。電極を胚の頭の側面に配置し、プラスペダルを注入された心室と同じ側に置いて皮質エレクトロポレーションを行うか、注入した心室の反対側に海馬エレクトロポレーションを配置します。次に、50ミリ秒間隔の30ボルト電気パルスを5つ印加します。
胎盤に電流を流すことは避けてください 生存の可能性を高めるために、腹腔であるPBSで完了した場合は、すべての胚を30分以内に注入して電気操作し、腹腔内を装着し、リング鉗子を使用して子宮角を元の位置で交換します。ビクリル吸収性縫合糸を使用して、腹部、壁、皮膚を閉じます。動物が目を覚ますまで、動物を回復室に入れます。
その後、手術の24時間後と48時間後に、加熱パッドのケージに移します。マウスの行動をチェックして痛み、苦しみ、または苦痛を評価し、動物の体重を量って脳を分析します。出生後の段階では、バイブレーターを使用して以前に灌流したセクションを切断し、ポストフィックスブレインはアクアポリマウントでセクションをマウントして、樹状突起と棘を画像化します。
この図は、大脳皮質、海馬のca回および歯状回におけるエレクトロポレーション細胞の例を示しており、タイプマウスはE14.5でエレクトロポレーションされ、GFP構築物および脳は出生後14日目に採取された。少量のDNA溶液を注入することにより、いくつかの細胞が標識され、単離されたGFP陽性細胞の樹状突起分枝化とそれらのスパインをより高い倍率で視覚化できます。この手順を試みる際には、少数の細胞のみを標的とするために少量のDNAを注入すること、および脊椎や電気神経に書き込まれていないものを視覚化および定量化できることを覚えておくことが重要です。
概要
この記事では、E14.5のマウスの脳皮質と海馬の体内電気穿孔のプロトコルについて詳しく説明します。この方法は、これらの脳領域の樹状突起と樹突棘を研究するのに有用です。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 発生生物学
- 遺伝子操作
背景
- 電気穿孔により、ニューロンの可視化と遺伝的操作が可能になります。
- この技術は胚発生中の特定の脳領域を標的とします。
- 従来のノックアウトマウスモデルに比べて利点があります。
- 体内研究により、樹状突起と樹突棘の発達に影響を与える遺伝子相互作用を明らかにすることができます。
研究の目的
- マウス脳の樹状突起と樹突棘を可視化し、操作すること。
- 遺伝子発現と抑制の影響を評価すること。
- 神経構造を研究するための迅速なアプローチを開発すること。
使用された方法
- 胚の側脳室へのプラスミドDNAの注入。
- 電気パルスを送達するための電極を使用した電気穿孔。
- 出生後の脳構造と機能の評価。
- コンフォカル顕微鏡を用いた樹状突起と樹突棘の可視化。
主な結果
- 脳皮質と海馬の電気穿孔の成功。
- GFP陽性細胞における樹状突起の分枝と樹突棘の可視化。
- 体内研究におけるこの技術の有効性の実証。
- 神経発達に関与する遺伝子相互作用の同定。
結論
- 体内電気穿孔は神経構造を研究するための強力なツールです。
- この方法により、特定の脳領域での標的化された遺伝子操作が可能になります。
- 従来の遺伝子改変技術に代わる迅速な方法を提供します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
In utero electroporation (IUE) enables rapid, in vivo genetic manipulation and visualization of neuronal structures in the developing mouse brain, directly addressing the need for physiologically relevant models in early CNS drug discovery. This approach supports mechanistic de-risking and target validation by allowing precise temporal and spatial gene modulation in the cerebral cortex and hippocampus. IUE's flexibility accelerates hypothesis testing and portfolio triage for neurodevelopmental and synaptic function targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in neuronal development within native tissue environments.
- Supports functional target validation by permitting gain- and loss-of-function studies in specific brain regions and developmental windows.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing combinatorial gene manipulation in vivo.
- Accelerates predictive confidence for CNS target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares physiologically relevant neuronal systems for downstream phenotypic screening and quantitative imaging.
- Enables reproducible labeling of sparse neuronal populations for high-resolution dendrite and spine analysis.
- Supports assay standardization by providing consistent genetic delivery and expression in targeted brain regions.
- Improves screening readiness for compounds affecting synaptic structure or function.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant neuronal architecture and gene expression patterns.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting inducible gene modulation at defined developmental stages.
- Provides a platform for evaluating translational biomarkers of dendritic and synaptic integrity.
- Reduces risk of late-stage attrition by modeling gene function in vivo.
Pipeline & Workflow Integration
IUE integrates at the interface of early discovery and preclinical research, bridging in vitro findings with in vivo validation for CNS targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for genes regulating dendrite and spine development.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis of genetic or pharmacological interventions.
- Analytics: Enables high-content measurement of dendritic arborization and spine density in genetically defined neuronal populations.
- Translational Research: Facilitates alignment of preclinical models with human disease mechanisms by enabling precise temporal gene modulation.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable platform for rapid evaluation of multiple gene targets or combinations in the same experimental system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Offers rapid, scalable, and standardized genetic manipulation compared to traditional knockout models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling early in vivo functional assessment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS programs based on robust in vivo data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic surgery, genetic construct design, and confocal imaging.
- Demands access to specialized instrumentation for microinjection, electroporation, and high-resolution microscopy.
- Necessitates cross-team standardization of DNA delivery, electroporation parameters, and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different mouse strains or developmental stages.
- Limited to accessible brain regions and developmental windows as supported by the protocol.
