使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作子宮内でエレクトロポレーション

この手順の目的は、マウスの大脳皮質と海馬の樹状突起と脊椎を視覚化し、遺伝的に操作するために、子宮内でエレクトロポレーションを使用することです。これは、まず、所望のプラスミドであるDNA溶液を子宮内の胚の側脳室に注入することによって達成されます。次に、パロ電極のさまざまな位置を使用します。

DNA注射によれば、大脳皮質または海馬がエレクトロポレーションされ、次に出生後または成人の望ましい段階になります。マウスを灌流し、脳を採取します。最後に、脳はビブラムで切片化されます。

最終的に、樹状突起とスパインは共焦点顕微鏡を使用して視覚化できます。ユニタリーエレクトロポレーションの技術は、非右および脊椎を研究する方法と比較していくつかの利点を提示する。実際、この技術により、まずこの側面を生体内で直接研究することができます。

さらに、電気操作におけるノックアウトマウスの作製と比較して、遺伝子抑制または遺伝子発現の影響を研究するための迅速なアプローチであり、特定の細胞構造だけでなく、特定の発達のポンでも、白と背骨を着用します。また、電気間操作に誘導システムを使用することは、ドンライトと脊椎の発達に関与する遺伝子間の機能的相互作用を特定するための有用なツールでもあります。確かに、ウイルスとは対照的に、例えば、それは私たちにとって厳しいです 細胞の同じ集団で複数のHNAまたは複数のトン遺伝子を組み合わせる DNAを水で目的の濃度に希釈し始め、0.05%の最終濃度に高速緑色染料を追加します マイクロパーペットプーラーを使用して、注射用のガラス針を引っ張ります。

妊娠中のマウスをイソフッ素を使用した麻酔導入チャンバーに入れ、酸素を毎分最大2リットル開きます。動物が筆記反射を失ったら、手術前のマスクに移します。両目にIGELを一滴垂らし、電気カミソリを使って腹部の毛を剃ります。

剃った部分をクロルヘキシジンで一度きれいにして、飛んでいる髪を集めます。動物を手術部位の2つ目のマスクに移し、動物を温熱パッドに背を向けます。花弁反射が失われたときに手術を開始します。

マスクと滅菌手袋を着用し、動物を滅菌ドレープで覆います。剃った部分をクロルヘキシジンで少なくとも3回きれいにします。メスを使用して、皮膚の正中線に沿って垂直に切開します。

ハサミを使う。線形肘に沿って腹部の筋肉に同様の切開を行います。最もアクセスしやすい胚を選択します。

リング鉗子を2つの胚の間に置き、胚鎖を腹腔から慎重に引き出します。この時点から、胚を滅菌した温熱済みPBSで水分補給してください。リング鉗子を使用します。

羊水嚢内の胚の位置を優しく操作し、リング間の頭部を安定させます。胚を子宮壁に近づけるために、そっと絞る。もう一方の手で、毛細血管ホルダーを取り、針を半球の中央に慎重に挿入して、側脳室をターゲットにします。

子宮壁の表面での針の動きを最小限に抑え、血管を突き刺さないように注意しながら、ペダルを踏んで約0.5マイクロリットルの緑色のDNA溶液を注入します。電極を胚の頭の側面に配置し、プラスペダルを注入された心室と同じ側に置いて皮質エレクトロポレーションを行うか、注入した心室の反対側に海馬エレクトロポレーションを配置します。次に、50ミリ秒間隔の30ボルト電気パルスを5つ印加します。

胎盤に電流を流すことは避けてください 生存の可能性を高めるために、腹腔であるPBSで完了した場合は、すべての胚を30分以内に注入して電気操作し、腹腔内を装着し、リング鉗子を使用して子宮角を元の位置で交換します。ビクリル吸収性縫合糸を使用して、腹部、壁、皮膚を閉じます。動物が目を覚ますまで、動物を回復室に入れます。

その後、手術の24時間後と48時間後に、加熱パッドのケージに移します。マウスの行動をチェックして痛み、苦しみ、または苦痛を評価し、動物の体重を量って脳を分析します。出生後の段階では、バイブレーターを使用して以前に灌流したセクションを切断し、ポストフィックスブレインはアクアポリマウントでセクションをマウントして、樹状突起と棘を画像化します。

この図は、大脳皮質、海馬のca回および歯状回におけるエレクトロポレーション細胞の例を示しており、タイプマウスはE14.5でエレクトロポレーションされ、GFP構築物および脳は出生後14日目に採取された。少量のDNA溶液を注入することにより、いくつかの細胞が標識され、単離されたGFP陽性細胞の樹状突起分枝化とそれらのスパインをより高い倍率で視覚化できます。この手順を試みる際には、少数の細胞のみを標的とするために少量のDNAを注入すること、および脊椎や電気神経に書き込まれていないものを視覚化および定量化できることを覚えておくことが重要です。