使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作

この手順の目的は、子宮内電穿孔法を用いて、マウスの大脳皮質および海馬における樹状突起とスパインを可視化し、遺伝的に操作することです。まず、目的のプラスミドDNA溶液を胎児の子宮内側脳室に注入します。次に、Palo電極の位置を変更して電穿孔を行います。

DNA注入後、大脳皮質または海馬にエレクトロポレーションを行い、その後、目的の生後段階または成体段階まで待機します。マウスを灌流し、脳を回収します。最後に、ビブラトームを用いて脳を切片化します。

最終的に、共焦点顕微鏡を用いて樹状突起とスパインを可視化することができます。単一細胞電極法（unitary electroporation）は、樹状突起やスパインを研究する他の手法と比較して、いくつかの利点があります。実際、この手法を用いることで、これらの側面を直接in vivoで研究することが可能になります。

さらに、ノックアウトマウスの作製と比較して、電極法（エレクトロポレーション）は、特定の細胞構造だけでなく、発生の特定の段階において、遺伝子抑制や遺伝子発現の影響を研究するための迅速な手法です。また、誘導性システムを用いた電極法は、背側神経管および脊髄の発達に関与する遺伝子間の機能的相互作用を特定するための有用なツールとなります。実際に、例えばウイルスベクターとは対照的に、同一の細胞集団に複数のRNAや複数の転写遺伝子を組み合わせることは困難です。まず、DNAを水で目的の濃度まで希釈し、最終濃度が0.05%になるようにファストグリーン染料を加えます。マイクロピペットプラーを使用して、注入用のガラス針を引いて作製します。

妊娠マウスをイソフルランを用いた麻酔導入チャンバーに入れ、酸素を毎分2リットルまで流します。動物の右反射が消失したことを確認後、手術前用マスクに移動させます。両眼にIGELを1滴ずつ点眼し、バリカンを用いて腹部の除毛を行います。

クロルヘキシジンで除毛部位を一度清拭し、浮遊毛を除去します。動物を外科処置エリアにある2つ目のマスクに移し、背中をヒーティングパッドの上に置きます。足底反射が消失したことを確認して、手術を開始します。

マスクと滅菌手袋を着用し、動物を滅菌ドレープで覆います。除毛した部位をクロルヘキシジンで少なくとも3回洗浄します。メスを用いて、皮膚の中央線に沿って垂直に切開します。

はさみを使用して、線状の肘に沿って腹部の筋肉に同様の切開を加えます。最も取り出しやすい胚を選択します。

2つの胚の間にリング鉗子を配置し、胚の連鎖を腹腔から慎重に引き出します。これ以降、胚はあらかじめ温めておいた滅菌PBSで湿らせた状態に保ってください。リング鉗子を使用して、

羊膜嚢内の胚の位置をそっと調整し、リングの間で頭部を固定します。ゆっくりと圧迫して、胚を子宮壁に近づくように押し上げます。もう一方の手でキャピラリーホルダーを持ち、針を半球の中央に慎重に刺入し、側脳室を標的にします。

子宮壁表面での針の動きを最小限に抑え、血管を貫通させないよう注意しながら、ペダルを押して約0.5 µLの緑色DNA溶液を注入します。皮質電極導入を行う場合は、陽極ペダルを注入した脳室と同じ側に、海馬電極導入を行う場合は、注入した脳室の反対側に、胚の頭部の側面に電極を配置します。その後、30 V、50 msの電気パルスを1秒間隔で5回印加します。

胎盤に電流を流すと胚が死滅するため、これを避けてください。生存率を高めるため、すべての胚への注入および電気操作を30分以内に完了させます。その後、PBSで洗浄し、腹腔内でリング鉗子を用いて子宮角を元の位置に戻します。吸収性バイクリル縫合糸を使用して、腹壁と皮膚を縫合します。動物が覚醒するまで、回復室に入れて管理してください。

その後、手術の24時間後および48時間後に、ヒートパッドを敷いたケージに移します。マウスの行動を確認して、痛み、苦痛、またはストレスを評価し、脳を解析するために動物の体重を測定します。出生後の段階では、バイブレーターを用いて、あらかじめ灌流および後固定した脳を切片化し、樹状突起とスパインを画像化するために、切片をaqua poly mountで封入します。

この図は、胎生14.5日（E 14.5）にエレクトロポレーションを施行し、生後14日目に脳を採取してGFP構築物を確認したマウスにおける、大脳皮質、海馬のCA1領域および歯状回のエレクトロポレート細胞の例を示しています。少量のDNA溶液を注入することで、少数の細胞のみが標識され、単離されたGFP陽性細胞の樹状突起の分枝構造や、高倍率でのスパインの可視化が可能になります。この手順を行う際は、少数の細胞のみを標的とし、スパインやエレクトロニューロンの可視化および定量化を可能にするために、DNAを少量注入することが重要です。