DNAフラグメントをElectroeluting

Hi.Today、消化産物やPCR産物などのDNA断片を精製するためにエレクトロリューションがどのように行われるかをご紹介します。クローニングやシーケンシングなどのさらなる目的のために、エレクトロリューションは選択可能な方法の1つとなり得ます。DNAの負の電荷に基づいて、高い細胞障壁が電場内に配置され、フラグメントを落下させ、それらのさらなる移動を防ぎます。

この方法は、さまざまなソースからの幅広いDNAフラグメントサイズの精製を、最大80%の比較的高い効率で低コストで行うことができます。Electro Lutionのもう一つの利点は、カラムやレジンキットなどの他の精製方法と比較した場合です。DNAサンプルは、まず、精製されるべき所望の断片を視覚化し、同定するために、退屈な臭化物染色Arisゲル電気泳動によって可視化され、電気泳動を進めるべきである。

アンダーフラグメントはよく分離されており、小ささは正確に決定できます。電気泳動後。目的のフラグメントは、新品のカミソリの刃を使用してゲルからきれいに切り出され、ゲルスライスを目的のバンドにできるだけ近づけるように注意します。

この手順は、紫外線から適切に保護し、手袋を着用して実行する必要があります。エレクトロリューターに適切な燃焼バッファーを充填し、中央のプラトーの表面にこぼれるように注意した後、ゲルスライスはVチャネルのできるだけ近いホイールの1つの内側に配置されます。vchチャネル内に気泡があってはなりません。

これは、チャネルをバッファでフラッシュして閉じ込められた空気を取り除くことで回避できます。次に、100マイクロリットルの高塩バリアを、近位のサイトから井戸へのVチャネルに慎重に追加します。チャンバーは密閉されており、電極は電源に接続され、100〜120ボルトで電気融解を開始します。

タイムラプスは、最大20 kbsの大きなフラグメントのフラグメントサイズに依存します。50分から1時間で十分であり、小さなフラグメントはUV光で10分ごとに監視して、塩溶液を介して最終成体のバッファーチェーンにさらに浸入しないようにする必要があります。この場合、酵素ND oneとエントリーを使用して560ナノグラムのプラスミドを消化し、フラグメントあたり900塩基(サンプルの84ナノグラムに相当)を放出しました。

したがって、ゲルスライスをウェル内に置いた後、100ボルトで25分間電気リューションが進行します。電気溶液が完成し、DNA断片がVチャネル内の南クッションに閉じ込められると、チャネルから400マイクロリットルの溶液が回収され、レセプタクルの遠位側からマイクロピットに取り付けられた細い先端を用いて1.5マイクロリットルのマイクロチューブに入れられ、2容量の冷たい無水エタノールを加えて渦で混合してアルコール沈殿に進む。さらに、グリコーゲンの2〜3マイクロリットルは、DNA回復の古典的なチューブの収量を改善するために追加することができます マイナス20°Cで1時間、または代わりに、この温度で一晩保存します 摂氏4度で最高速度で25分間。

このカーディオ上清と5〜10分間の最高速度で摂氏4度で70%エタノール遠心分離機の冷たい、70%エタノール遠心分離機の1ミリリットルを追加して洗浄し、上澄みを捨て、逆位置のチューブで室温で乾燥させ、グリースを10〜15マイクロリットルの核フリー水に費やし、サンプルの濃度を決定するに進みます。この場合、精製されたサンプルを10マイクロリットルの水に再懸濁し、260ナノメートルの波長で分光光度計で定量したところ、マイクロリットルあたり6.3ナノグラムの濃度が示され、75%の効率を示しました。貴重な時間の10分だけをキットに投資する方が良いと思っているかもしれません。

ただし、このプロセスに時間がかかるにもかかわらず、自然界のサイズとソースに含まれる幅広いサンプルを精製することを可能にする多くの変数を制御することができます。今回のケースで見たように、75%の効率は、ほとんどのDNA精製キットと同等またはそれ以上であることが観察されました。本日はよろしくお願いいたします。

このプロトコルがあなたの研究プロジェクトに役立つことを願っています。