Name: DNAフラグメントをElectroeluting (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: 学ぶエレクトロエルーション法によるDNAフラグメントの精製技術。ゲル電気泳動後の切り出し、高塩バリアによる捕捉、アルコール沈殿を含む完全なプロトコルで、最大80%の高効率回収を実現します。

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博士ベルムデス研究室での作業はConacyt（グラント＃82622）によって賄われていた。我々はelectroleutionの手順を記録するビデオのガブリエラグティ-ソーサ、Eliuthレイエス-マルティネスとXimenaロドリゲス-トーレスに感謝。

<ol><li>精製される、目的のDNA断片を選択するために、これらは、アガロースまたはアクリルアミドゲル中で解決されるべきである1時間120ボルトで0.5 × TBEバッファー（トリスホウ酸、EDTA）を用いて電気泳動により臭化エチジウムで染色したゲル。このためには、〜700 ngの前にNdeIとHindIIIで消化したプラスミドpProEx - GdMre11S（6000 - bp）を900 bpの断片を（断片のプ​​ラスミドおよび84 ngの560 ng）を解放するために使用されていました。 </li><li> electroeluterタンク（図1）は中間台地上にこぼさないでの世話をして同様に中間台地の両側に分布する0.5X TBEで埋めなくてはなりません。 </li><li>選択されたバンド（またはバンド）をゲルから切り出し、そしてできるだけ近いVチャネル（ウェルあたりつのスライス）にとして、試料室に配置されます。実行中のバッファは、各チャンバーに追加する必要があります。ゲルスライスをカバーするだけの十分な。 </li><li>使用される各Vチャネルが捕捉された任意の気泡を除去するためにパスツールピペットを用いてフラッシュする必要があります。 </li><li>その後、10 M NH 4酢酸100μlのは、（ちょうど足りるだけのそれに色を付けるために、ブロモフェノールブルーの少量が追加される可視化を容易にするために）優しくVチャネルの内部に追加されます。 </li><li>高塩クッションのいずれかの再懸濁を防止するために蓋を静かに閉じる必要があります。 </li><li>電気溶出を25分間100ボルトで開始されます。 </li><li> electrolutionは、400 ulを完了すると4℃（DNAの回収を向上させるために推奨）V -チャネルから削除し、冷エタノールとグリコーゲンの2容量を析出させる遠心チューブ内に配置されます℃で1時間または一晩Cを。 </li><li> 20分間遠心分離、上清を除去し、70％エタノールで洗う。 </li><li>乾燥管とOD 260 nmでDNAを定量化する。 </li><li>得られた回収は75％（63 ngは84 ngのがV -チャネル上に配置されたときに復旧）であった。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2136/2136fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。Electroeluter図。カソードは、タンクのそれぞれの側に示されているAnod、（黒い四角として示される）スライスしたゲルに含まれるDNAは、その負電荷により陰極に向かって移行されます。それは塩のクッションの中に閉じ込め（逆黒い三角形として表される）V -チャネルに配置されます。

<ol><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

テストの実行時間は1時間まで20キロバイト50分までフラグメントのために、通常、フラグメントのサイズに大きく左右される小さな断片のために10分ごとに監視してUV光が通過するフラグメントを防止するために必要とされる一方、十分です。塩のクッション、結果的に回復を減少させる陽極バッファー槽に。あなたが100ボルトで、電源装置を設定すると、現在少なくとも10のMAMPあることを確認することが重要です。 DNAバンドは、UV -ハンドランプを使用して監視し、これをゲルスライスを放棄したことを検出することができます。クッションの塩は、3 M酢酸ナトリウムで行うこともできます。 この手順では、良好な回収率（〜80％）で異なるサイズのDNAまたはRNA断片の精製は修飾酵素などによって処理、制限酵素による消化、放射性標識することができます

<table><tbody><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 酢酸塩</td><td>JT Baker</td><td>0596</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>バイオフォトメーター</td><td>Eppendorf</td><td>6131 000 020</td><td></td></tr><tr><td>電極&amp;#8211;ルーター</td><td>心拍間隔（IBI）</td><td>UEA CAT 46000</td><td></td></tr></tbody></table>

dnaフラグメントをelectroeluting

Electroeluting DNA Fragments

精製されたDNA断片は、分子生物学で異なる目的で使用されますと、それらはいくつかの手順によって調製することができる。それらのほとんどは、目的のバンドを分離するために、DNA断片の前の電気泳動を必要とする。その後、このバンドは、アガロースまたはアクリルアミドゲルから切り出し、いずれかの方法で精製さ：、DEAE -セルロース膜、ガラスまたはシリカ粒子から結合および溶出は、&quot;メソッドを粉砕し、ソーク&quot;、非常に多くの場合、電気溶出したり、高価な商用の精製キット。このように、方法を選択すると、実験室で使用可能かどうかを主に依存します。電気溶出の手順では、1つは、多数のアプリケーション（シーケンス、放射能標識、酵素的制限、酵素的修飾、クローニングなど）で使用される非常にきれいなDNAを精製することができます。この手順では、DNAバンドを含むelectroeluterのサンプルウェルにアガロースまたはアクリルアミドのスライスを配置することで構成され、その後現在の適用は、アガロースを残すためにDNA断片を行いますので、エタノール沈殿により、後で回収されるクッションの塩で閉じ込められる。

この手順では、高収率でDNA断片の精製を可能にする。

DNAフラグメントをElectroeluting

精製されたDNA断片は、分子生物学においてさまざまな目的に使用され、いくつかの手順で調製することができます。そのほとんどの手順では、...

こんにちは。本日は、制限酵素消化産物やPCR産物などのDNA断片を精製するために行われるエレクトロルーション（電気溶出）の手法をご紹介します。クローニングやシーケンシングなどの後続の目的において、エレクトロルーションは有効な手法の一つです。DNAが負に帯電している性質に基づき、電場内に高密度の障壁を設けることで、断片を停滞させ、それ以上の移動を防ぎます。この手法により、さまざまなソースから幅広いサイズのDNA断片を、最大80%という比較的高い効率で精製することが可能です。他の精製方法（カラムやレジンキットなど）と比較して、低コストであることも電気溶出の利点です。まず、精製したい目的の断片を可視化し特定するために、臭化エチジウム染色したアガロースゲル電気泳動によってDNAサンプルを可視化し、電気泳動を行います。断片が十分に分離されていれば、サイズが小さい断片でも正確に決定できます。電気泳動後、新品のカミソリ刃を用いて、目的のバンドにできるだけ近づけてゲルスライスを切り出し、目的の断片を丁寧に回収します。この手順は、適切な紫外線遮断対策を講じ、手袋を着用して行ってください。電解溶出装置に適切な溶出バッファーを満たし、中央プラトーの表面に液体が行き渡るように注意した後、ゲルスライスをホイールの1つに入れ、Vチャンネルにできるだけ近づけて配置します。Vチャンネル内に気泡がないことを確認してください。バッファーでチャネルを洗浄して閉じ込められた気泡を除去することで、これを回避できます。次に、ウェルに近い側からVチャネルに100 µLの高塩濃度バリアを注意深く加えます。チャンバーを密閉し、電極を電源に接続して、100～120 Vで電気溶出を開始します。タイムラプス時間はフラグメントのサイズに依存し、最大 20 kb までの大きなフラグメントの場合は 50 分から 1 時間で十分であると考えられます。小さなフラグメントの場合は、塩溶液を通過して最終的なバッファーチェーンへさらに溶出することを避けるため、UV ライトを用いて 10 分ごとにモニタリングする必要があります。本例では、ND one および entry の酵素を用いて 560 ng のプラスミドを消化し、900 bp のフラグメントを遊離させました。これは、サンプル 84 ng に相当します。したがって、ゲルのスライスをウェル内に配置した後、100 Vで25分間電気溶出を行います。電気溶出が完了し、DNA断片がVチャネル内のサウスクッションに捕捉されたら、レセプタクロの遠位側からチャネル内の溶液400 µLを回収し、マイクロピペットに取り付けたファインチップを用いて1.5 mLマイクロチューブに移します。そこに2倍量の冷絶対エタノールを加えてボルテックスで混合し、アルコール沈殿を行います。さらに、DNA回収率を向上させるために2〜3 µLのグリコーゲンを添加しても構いません。チューブを-20 °Cで1時間、あるいは一晩保存した後、4 °Cで最大速度にて25分間遠心分離します。この上清および洗浄液に、冷やした70% ethanolを1 mL加え、4 °Cで最大速度にて5〜10分間遠心分離します。上清を捨て、チューブを逆さまにした状態で室温で乾燥させます。その後、nuclease-free water 10〜15 µLで再懸濁し、サンプルの濃度測定に進みます。本例では、精製したサンプルを水10 µLで再懸濁し、分光光度計を用いて波長260 nmで定量した結果、濃度は6.3 ng/µLであり、回収率は75%でした。貴重な時間をわずか10分だけ投資して、キットを使用した方が効率的だと考えるかもしれません。しかしながら、このプロセスに時間を要するものの、多くの変数を制御できるため、サイズや由来が異なるより広範なサンプルを精製することが可能になります。本例でご覧いただいたように、ほとんどのDNA精製キットと同等またはそれ以上の75%という回収率が確認されました。本日はご視聴いただきありがとうございました。このプロトコルが皆様の研究プロジェクトに役立つことを願っております。

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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