Name: 粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場でハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学ぼう、粘着テープサンプリングと蛍光インプレッションシットハイブリダイゼーション（FISH）を組み合わせたSalmonellaの迅速検出法を。生鮮食品の表面からの細菌採取と分子検出技術を統合した食品安全研究手法です。

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この作業のための資金はBFBSに成長アイオワ値基金賞によって提供されていました。

1。滅菌粘着テープで表面のサンプリング<ol><li>サンプリングに使用するテープを選択します。市販のカビ - テープまたはCON -タクト - それはサンプリングのテープは、使いやすさのための滅菌と特別にパッケージされている。しかし、我々は、透明（光学的に透明な）一般的なオフィスのテープも使用できることを見出した。 </li><li>粘着テープの10cmの部分（紙のテンプレートを使用することができる）の非粘着面に1cm 2の正方形を描画するための恒久的なマーカーを使用してください。これは、テープの一部が、食品または環境表面をサンプリングするために使用されている注目のための視覚的なガイドとして機能します。 </li><li>サンプリングする面に対向する粘着面とテープの"C"字型のループを形成。これを行うには、テープの背面に描かれた四角（非粘着面）（図1）に対して、親指と中指と位置と粘着末端の人差し指を保持する。 </li><li>サンプリングされる表面にテープを置き、軽く表面に対してマークされた領域を押してください。テープの端を放出することなく、テープの粘着面は気泡を避け、試料表面と完全に接触することを保証するために人差し指を使う。 </li><li>さらにモーションを使用して、徐々に物理的に表面結合微生物を抽出し、離れてサンプルからテープを引き出します。一般的な透過的なオフィスのテープを使用してガラスの顕微鏡スライド上に、セルチャージャーテープ、粘着面を固定します。フラット、非しわになりやすい面が作成されるよう、テープの適切なテンション/ストレッチングを確認してください。これは変形/ハイブリダイゼーションの間その後の加熱中にテープのカールの問題を最小限に抑えることができます。 </li></ol> 2。固相濃縮および液面Miniculture <ol><li>固体相の濃縮は、サンプリングされた細胞を寒天表面に直接接触して配置されるようにキシロース-リジン-タージトール4（XLT - 4）寒天プレート上に直接フェースダウンテープを置くことによって行われます。テープのテンプレート/サンプルの接触部は、寒天の表面とテープの一端が緩く濃縮に続く寒天表面からテープを簡単に除去を容易にするために、ペトリ皿の側壁に付着さと同じ高さに配置されます。 </li><li>プレートを反転（結露を避けるために）と35℃でインキュベートされる- 37℃のサルモネラの十分な成長を可能にする。検出可能なレベルに細胞を豊かにするために必要な潜伏期間の長さは初期のサルモネラ汚染レベルに依存します。我々は8時間の濃縮後に低い初期接種から優れた微小コロニー形成を観察した。 </li><li>希望の濃縮期間の後、寒天プレートを開きます。テープは、インキュベーション中に、その粘着性を保持します。ゆっくりとテープ寒天界面に形成microcoloniesの最大回収を確実にするために人差し指を使って寒天に対してテープを押してください。ペトリ皿の壁に取り付けられた端からテープをつかみ、ゆっくりと、さらに動きでそれを削除してください。上記のセクション1.5で説明したように顕微鏡スライド上に細胞チャージャーテープ、最大粘着面を、マウントします。以下"固定と脱水"の手順に進みます。 </li><li>液面minicultureの場合、上記のセクション1.5で説明したように顕微鏡スライド上にサンプリングに使用されるテープを固定することから始めます。次に、底部上を向いて、細胞に帯電したテープから構成されている密封されたチャンバを形成する非無菌シリコン灌流チャンバー（Coverwell、グレースバイオ研究所、（株））とテープのテンプレート化/サンプルの接触部を、カバーしています。しっかりと、かつ慎重に防水シールを確保するためにチャンバーを押してください。 </li><li>柔軟なゲルローディングピペットチップ、室の小さな入口ポートのいずれかを経由して転送≤500μLトリプチケースソイブロスまたは他の適切な増菌培地を使用する。 35 -37で蒸発し、インキュベートするスライドを防ぐために透明なオフィステープで両方のポートを密封° Cに十分な濃縮のために必要に応じて。すべての操作が良好なサンプリングと処理の慣行にしたがって行われるべきですが、ポートシールテープまたは灌流室の無菌性は、液面のminiculture時に必須ではありません。 FISHとフローサイトメトリーの組み合わせは、 サルモネラ属の明確な差別が可能になります。サンプル自体から来ると予想非標的植物の最大の貢献と、存在する可能性がある非標的細菌から。以下"固定と脱水"の手順に進みます。 </li></ol> 3。固定と脱水<ol><li>直接表面のサンプリング用やサルモネラの固相濃縮のための。 XLT - 4寒天上、25℃で30分間細胞を固定、テープの上で実行〜500μLをサンプルの接触面積をカバーすることによりC 10％中性緩衝化ホルマリン。 </li><li>密閉式容器内に固定液を捨て（化学フードの下毒性/刺激性の蒸気への曝露を最小限にするため）。 </li><li>エタノール系列で脱水し（50％、80％、95％、300μL/ 3分ごとに濃度）。下記の"ハイブリダイゼーション"の手順に進みます。 </li><li> 500μLの液面のminicultureのサンプルの固定用の、潅流チャンバーが開封され、かつ柔軟なゲルローディングピペットチップはenrichateを抽出するために使用されます。上下に迅速なピペッティングが、残りのテープ結合細胞の効果的な除去を保証するために使用されます。 </li><li>次に、全体の500μLminiculture量は微量遠心チューブに移し、2,000 × gで（5分）でスピンダウンしています。上清は廃棄され、ペレットは、10％の等量に再懸濁し、30〜60秒間激しくボルテックスれる中性緩衝ホルマリン。細胞を25℃で30分のために固定されています</li><li>次に、固定液が除去され、サンプルは次のように、細胞の保存バッファーに再懸濁する。 60秒、50％非変性エタノール50％の等量に再懸濁し、リン酸 - サンプルは、2,000 × gで（5分、25℃）上清を捨てている、ペレットを30を激しくボルテックスしている時にスピンダウンしている緩衝生理食塩水。固定された細胞は-20℃で（年間）無期限に保存することができます注意：液体が（例えば、固定液または別のバッファを導入する際に）変更されるたびに、それは（ボルテックスで）完全に再懸濁させることが重要である最小限の部分（〜10から20μL）で細胞ペレット"発信"液体のシステムの。これは、凝集を防止し、個々のセルの偶数濁液が得られることを確認するのに役立ちます。下記の"ハイブリダイゼーション"の手順に進みます。 </li></ol> 4。交配<ol><li>材料表に記載されている商用分子生物学グレードのソリューションを用いてハイブリダイゼーション/洗浄バッファーを準備します。最後のバッファ成分の濃度は、0.7MのNaCl、0.1 Mトリスは[pHを8.0]、10mMのEDTA、0.1％ドデシル硫酸ナトリウムは、分子のグレードの水と最終的な目的のボリュームに構成し、0.22μmのシリンジやカップのフィルターを使用してフィルタリングされます。プローブを添加していない同一のバッファは、（下記参照）、洗浄バッファーとして使用されます。 〜55の予熱ハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファー℃の</li><li>蛍光標識追加Sal3（Nordentoft ら、1997;。5' - AAT CAC TTC ACC TAC GTG - 3'）とザルム- 63（クッターら、2006;。5' - TCG ACT GAC TTC AGC TCC - 3'予熱したハイブリダイゼーションバッファーに）オリゴヌクレオチドプローブ（材料表）。 5 ngのμL-1の合計プローブ濃度は、（;碧砂とブレーム-ステッチャー、2009A 2.5 ngのμL-1各プローブなど）が使用されます。 </li><li>直接テープへと固相濃縮サンプルについては、プローブのカクテルを含むハイブリダイゼーション緩衝液300μlでテープのテンプレート化サンプルの接触面積をオーバーレイし、55℃に設定されて湿った、密封されたインキュベーションチャンバーにテープ結合細胞をハイブリダイズスライドモート機器（材料表）などの直接接触インキュベーターが使用されている場合、サンプルは15分間ハイブリダイズされ、&gt; 20枚のスライドを同時に処理することができます。このようなバンビーノ機器（材料表）のような回転式のハイブリダイゼーションオーブンを使用している場合、スライドはハイブリダイゼーション用の50 mLのポリプロピレン遠心チューブ、チューブごとにスライドに配置されます。熱伝達が直接ではないため、これらのサンプルは、より長い期間（最長30分）にハイブリダイズさせる。 </li><li>ハイブリダイゼーション後、スライドが削除され、プローブを含むハイブリダイゼーションバッファーのオーバーレイは破棄されます。スライドは、予熱した洗浄バッファのオーバーレイまたはいずれかとし（最大30分）のどちらか簡潔に、ゆっくりと傾斜スライド（300μL、それぞれの3リンス）を介してバッファの小さなボリュームをピペッティングすることにより予熱洗浄バッファーですすぎ、または正式に洗浄しています予熱した洗浄バッファーを含む50 mLポリプロピレン製遠心チューブに浸漬。我々の経験では、正式な洗浄が改善された結果を（非連結プローブから以下ヘイズ）を提供しますが、簡単なリンスはサルモネラ属の明確な検出に適しています。次に、スライドの下に"検出"のステップに移る前に空気乾燥する。 </li><li>液面のminicultureサンプルのハイブリダイゼーションは、積極的なペレットのボルテックスとを含む100μL予熱したハイブリダイゼーションバッファーに再懸濁し、続いて2000 × gで5分間（-20℃でたての固定または記憶バッファに保持されている）サンプルをスピンダウンして実行されます。プローブのカクテル。サンプルは55℃でハイブリダイズしている500℃μL予熱した洗浄バッファーを添加し、続いてヒートブロックまたは他の適切なインキュベーションの駅（材料表）、上で30分間。テープバウンドサンプルと同様に、これらのサンプルは、正式に断続的にボルテックスしながら55℃でさらに培養して30 minでこの洗浄バッファーでC、にのためにまで洗浄することができる。また、サンプルは徹底的に分析するための即時の収穫（下）に続いて、500μL予熱した洗浄緩衝液の添加後ボルテックスすることができます。 </li><li> サルモネラ属菌を検出するための準備に。フローサイトメトリーを経由して、液面のminicultureのサンプルは5分2,000 xgでスピンダウンしている、上清を捨て、サンプルは300μL室温に再懸濁している（〜25℃）PBS。サンプルは遠い施設への輸送が必要な場合は遅延がハイブリダイゼーションと解析との間で期待されている場合、または、サンプルは前のANAに冷蔵または氷の上で開催することができる溶解。また、サンプルは、細胞の保存バッファー（PBSと無水エタノールの50:50混合物）に転送し、でかなりの損失のない週までは-20℃で保持することができるプローブ与え蛍光（碧砂とブレーム - ステッチャー、2009B） 。 </li></ol> 5。検出<ol><li> サルモネラ属の上にテープを検出するため。蛍光顕微鏡を介して、テープに直接または固相濃縮サンプルは、核の対比4を含む〜10μLVectashield H - 1200封入剤'、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）、カバースリップをマウントした、と重ねてその後、10分間暗所でインキュベートした。 </li><li>液浸油は、カバースリップ上に配置され、そしてサンプルは、高倍率の油浸対物（63xまたは100倍）を用いて検討されています。 DAPIフィルターが焦点に試料をもたらすために使用されている、顕微鏡は、適切なフィルターに切り替えられます（緑または赤、エンドラベルプローブするために使用される染料に応じて）およびサルモネラの細胞は、それらの蛍光（図にしたがって視覚的に採点されます2と3）。 </li><li>液面のminicultureサンプルのサイトメトリー検出のために、様々な楽器がローカル可用性に応じて、使用することができます。私たちの研究室では、PBSに懸濁した検体を5 mLの丸底サンプリングチューブ（BDファルコン）に移し、647 nmの（材料表）で励起したFACSCantoフローサイトメーターを用いて検討している。合計細菌の高い数字を含む豊かなサンプルについては、"低流量"の設定は（10μL分-1）が使用されますと5,000-50,000イベントが収集されます。データはFlowJoソフトウェア（バージョン8.8.6、ツリースター社、オレゴン州アッシュランド）または他の適切な解析ソフトウェア（図4、パネルAおよびB）を用いて分析されています。 </li></ol> 6。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 サルモネラ属菌のサンプリングのために粘着テープを使用してください。人為的に汚染されたトマトの表面から。 <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。直接テープへのサンプリングとトマトの表面（100 Xの油浸対物）からネズミチフス菌 ATCC 14028の魚群探知のための典型的な結果。テキサスレッドでラベルされたプローブ（Sal3/Salm-63）の2プローブのカクテルが使用されたこれらの細胞を標識する。 <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。キシロースリジンタージトール- 4（XLT - 4）37℃8時間のオンテープ濃縮℃、後の寒天の表面に形成されたネズミチフス菌 ATCC 14028のMicrocoloniesは初期接種は人工的に汚染されたトマトの表面から採取した。固相濃縮、検出のために利用可能な細胞数が増加し、また、細胞rRNAの内容を向上させます。 <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。 S.のサンプリングのための粘着テープの使用FISHとフローサイトメトリー（パネル）を介して、または500μLのトリプチケースソイブロス（パネルBで満たされた灌流チャンバ内で5時間の非選択的液面minicultureの濃縮後に直接分析に続いて人工的に汚染されたトマトの表面からenterica血清型ネズミチフス菌、 ）。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

農産物表面の病原体の検出のための簡単​​かつ迅速な方法は、タイムリーで実用的なデータを提供することにより、食品媒介疾患の軽減に役立つことがあります。粘着テープベースのサンプリング方法は1950年代から、環境への臨床的および食品微生物学で使用され、直接顕微鏡検査またはのための固体培地に付着した微生物の移転に続いて、微生物の除去のために表面に&quot;スコッチ&quot;スタイルのテープを押す含まれています成長（Barnetson氏＆ミルン、1973;エドワーズ＆ハートマン、1952; Evancho ら、2001;。鳳ら、1980;。Lakshmanan＆シャフナー、2005; Langvad、1980）。最近の変更は、石のモニュメントの表面に定着微生物の培養に依存しない分析（ラCono＆C. Urzì、2003）のためのin situハイブリダイゼーション（FISH） の蛍光とテープベースのサンプリングの組み合わせを説明した。我々は、急速なサンプリングとトマト、ほうれん草とハラペーニョピーマン（碧砂とブレーム-ステッチャー、2009A）を含む新鮮な農産物、上に存在...

<table><tbody><tr><td>Fungi-Tapeサンプリングテープ</td><td>科学機器研究室</td><td>745</td><td>http://www.scientificdevice.com/</td></tr><tr><td>Con-Tact-Itサンプリングテープ</td><td>Birko Corporation（コロラド州デンバー）</td><td></td><td>http://www.birkocorp.com/</td></tr><tr><td>透明オフィス用テープ（汎用品）</td><td>多様な</td><td></td><td>光学的に透明であり、固有蛍光が低いこと。</td></tr><tr><td>食品表面</td><td>地元の食料品店</td><td></td><td>トマト&amp;#8211;s（赤トマト）&amp;#8211;ここで使用した（ワックスやオイルを塗布せず、蔓についたままの）</td></tr><tr><td>トリプチケース大豆必要培地</td><td>Difco Laboratories</td><td>211768</td><td>非選択的液体表面ミニカルチャー濃縮法について</td></tr><tr><td>キシロース・リシン・テルギトール4寒天培地ベース</td><td>Difco Laboratories</td><td>223420</td><td>～のために（または、～用） &lt;電子顕微鏡（EM）&gt;サルモネラ属菌&lt;/em&gt;選択肢アガー (XLT-4)</td></tr><tr><td>キシロース-リシン-Tergitol 4 寒天培地添加物</td><td>Difco Laboratories</td><td>235310</td><td>～のための&lt;電子顕微鏡（EM）&gt; サルモネラ属菌&lt;/em&gt;選択肢寒天培地 (XLT-4)</td></tr><tr><td>ホルマリン溶液 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5011</td><td>10%中性緩衝溶液（細胞固定液）</td></tr><tr><td>無水エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>分子生物学グレード（ハイブリダイゼーション前脱水用）</td></tr><tr><td>1.5 ml マイクロ遠心チューブ</td><td>各種</td><td></td><td>RNaseおよびDNaseフリー</td></tr><tr><td>顕微鏡スライドガラスおよびカバーガラス</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>分子生物学グレード、5M溶液（ハイブリダイゼーションバッファー成分）</td></tr><tr><td>Tris-EDTA緩衝液（100倍濃縮液）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>1M Tris [pH 8.0]、0.1M EDTA（ハイブリダイゼーション緩衝液成分）</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td>18メガオーム超純水による10%溶液（ハイブリダイゼーションバッファー成分）</td></tr><tr><td>Sal3およびSalm-63オリゴヌクレオチドプローブ</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&amp;rsquo;6-カルボキシフルオレセイン (FAM) または Texas Red (顕微鏡観察用)、あるいは Cy5 (サイトメトリー用) で標識済み、HPLC精製済み</td></tr><tr><td>可変速マイクロ遠心機</td><td>多様な</td><td></td><td>プロトコルに記載されているRCF値に必要なRPMを算出するために、ローター径を使用してください。</td></tr><tr><td>CoverWell灌流チャンバー </td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td>PC1R-2.0</td><td>非滅菌</td></tr><tr><td>ゲルロード用ピペットチップ (FS MultiFlex)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>05-408-151</td><td>小さなサンプリングポートへの容易なアクセスとチャンバー内での操作性を実現する、細長いチップ</td></tr><tr><td>アルミニウム製ヒートブロックまたは精密制御加熱ステーション</td><td>各種</td><td></td><td>本研究では、Eppendorf Thermomixer R ドライブロック加熱・冷却シェーカーを使用した。</td></tr><tr><td>Bambino ミニハイブリダイゼーションオーブン</td><td>Boekel Scientific</td><td>モデル 230300</td><td>ハイブリダイゼーションのため、スライドを50 mlポリプロピレン製遠心チューブに入れる。熱伝導は間接的に行う。</td></tr><tr><td>スライドモート・スライドハイブリダイザー</td><td>Boekel Scientific</td><td>モデル 240000</td><td>ガラススライドを介して、迅速かつ直接的に熱を伝導させます。</td></tr><tr><td>4% DAPI含有Vectashield H-1200封入剤&amp;rsquo;,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>顕微鏡観察中の蛍光消光を最小限に抑え、DAPIによるカウンターステイン（対比染色）を可能にする</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>多様な</td><td></td><td>ここではLeitz Laborlux Sを使用しています。</td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>各種</td><td></td><td>本手順では、Canon PowerShot A640カメラを使用しています。</td></tr><tr><td>画像取得ソフトウェア</td><td>各種</td><td></td><td>Axiovisionソフトウェア v. 4.6 (Carl Zeiss)を使用</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>画像の最小限の処理（異なるチャネルで撮影された画像のオーバーレイ）のため</td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>各種</td><td></td><td>赤色（647 nm）励起光源を備えたFACSCantoフローサイトメーター（BD Biosciences、カリフォルニア州サンノゼ）を使用した</td></tr><tr><td>フローサイトメトリー解析ソフトウェア</td><td>多様な</td><td></td><td>FlowJoソフトウェア v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) を使用</td></tr></tbody></table>

粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場で</emの迅速検出のための>ハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

このプロトコルは、 サルモネラの迅速なカルチャに依存しない検出のためのin situハイブリダイゼーション（FISH） でオンテープ蛍光続いてトマトや他の生鮮食品の表面の粘着テープベースのサンプリングのためのシンプルなアプローチを、説明します。セル充電されたテープは、検出前に固相濃縮のための選択寒天培地に直接フェースダウンに配置することができます。また、少量の液体富化（液面のminiculture）はフローサイトメトリーを経由してFISHと分析に続いて、非選択培養液中のテープの表面に行うことができます。開始するには、無菌の粘着テープが新鮮な農産物と接触させ、物理的にこれらの表面上に存在する微生物を抽出し、穏やかな圧力が適用され、テープが削除されます。テープは、顕微鏡用スライドガラスの上にまで粘着側にマウントされ、サンプリングされた細胞を、10ホルマリン％（30分）と段階的エタノールシリーズを用いて脱水（50、80、および95％、3分ごとの濃度）で固定されています。次に、細胞に帯電したテープは、 サルモネラをターゲットとしたDNAプローブのカクテルを含むバッファーでスポットし、15でハイブリダイズさせる- 55℃で30分間、非結合プローブを除去するための洗浄バッファーでリンス短いが続く。接着、FISH -標識細胞は、蛍光顕微鏡を使用して表示しているDNA色素4&#39;,6 -ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）との結果で対比されています。固相濃縮するために、細胞に帯電したテープは、適当な選択寒天の表面に直接フェースダウン配置され、 サルモネラ microcoloniesのその場成長に許可するようにインキュベートし、上記のようFISHと顕微鏡が続きます。液面minicultureの場合は、セルに帯電したテープは、粘着面を上に配置され、シリコン灌流チャンバーが適用されているので、テープや顕微鏡のスライドの形防水チャンバー内の底部トリプチケースソイの小さい容積（≤500μL）ブロス（TSB）が導入されています。入口ポートは封印されており、チャンバーを35℃でインキュベートされる - 37 ° C、テープ抽出した微生物の増殖ベースの増幅を可能にする。インキュベーション後、入口ポートが開封され、細胞が分離し、混合精力的なバックで前後にピペッティング、遠心分離を介して収穫し、10％で固定されている中性緩衝ホルマリン。最後に、サンプルをハイブリダイズし、 サルモネラ属菌の存在を明らかにするためにフローサイトメトリーを介して検査されます。ここで説明したように、私たちの&quot;テープ- FISH&quot;のアプローチは、シンプルかつ迅速なサンプリングとトマトの表面のサルモネラの検出を提供することができます。我々はまた、ほうれん草とハラペーニョペッパーを含む生鮮食品の他のタイプを、サンプリングするためのこのアプローチを使用している。

このプロトコルは、急速な細胞全体の検出に続いてトマトや他の生鮮食品の表面のサンプリングのための簡単​​な粘着テープベースのアプローチを、説明して<em&gt;サルモネラ</em&gt;蛍光を使用して<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）。

本プロトコルでは、トマトおよびその他の生鮮農産物の表面から粘着テープを用いてサンプリングを行い、続いてテープ上で蛍光...を行う簡便な手法について解説します。

この手順の全体的な目的は、生鮮農産物の粘着テープによるサンプリングと、迅速蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）を用いたサルモネラ属菌の全細胞分子検出を組み合わせることにあります。これは、まず目的の材料に粘着テープを貼付して表面に付着した細胞を採取することで達成されます。細胞が付着したテープは、そのまま直接分析するか、あるいは固相または液相での増菌処理に供することができます。手順の第2段階は、液体培地中で導入または濃縮された細胞を対象とした、テープ上での固定およびエタノール系列による脱水です。第2段階では、懸濁状態での細胞固定を行い、続いて保存バッファーで細胞を再懸濁させます。手順の第3段階では、サルモネラ特異的なオリゴヌクレオチドプローブカクテルを用いてテープ上での迅速なハイブリダイゼーションを行い、次いで洗浄バッファーでのリンスにより過剰なプローブを除去します。FISH法で解析するサンプルの場合、FISHステップは懸濁状態で実施し、解析前に単純な希釈操作によって過剰なプローブを除去することが可能です。本手順の最終ステップは、ハイブリダイゼーション後のテープ捕捉細胞をDPIで対比染色し、蛍光顕微鏡で観察することです。事実に基づく解析を行う場合は、対比染色は不要です。最終的に、この手法は、採取した生鮮農産物に存在する可能性のあるサルモネラ属種を、視覚的またはサイトメトリー的に検出するための手段を提供します。この手法を最初に思いついたのは、ローマ時代のエアロストーンの遺物上の細菌コミュニティを調査するために同様のアプローチを用いていたイタリアの研究グループについての論文を読んだときでした。その後、私とrは、私が担当していた食品微生物学の迅速法に関する講義でこの研究について議論しました。それから数週間後、生鮮農産物が原因とされるサルモネラ菌の集団感染が発生し、最終的に43州で約1500人が罹患しました。本実験手法は、生鮮農産物上の特定の細菌種を検出するためのタイムリーかつ実用的な手段を提供するだけでなく、ポータブルであるため、フィールドや食品生産環境での検査も可能です。まず、サンプリングに使用するテープを選択します。市販の菌類用テープやコンタクトテープなど、滅菌済みで使いやすくパッケージ化された選択肢があります。滅菌済みのアルミニウム製テンプレートを使用し、10 cmの粘着テープの非粘着側に、油性マジックで1 cm四方の正方形を描きます。これは、テープのどの部分が食品または環境表面のサンプリングに使用されたかを記録するための視覚的なガイドとして機能します。粘着面をサンプリング対象の表面に向けたC字型のテープループを作成します。具体的には、親指と中指で粘着端を持ち、人差し指をテープ背面にある描いた正方形に当てて固定します。サンプリングする表面にテープを置き、テープの端を離さないように、印を付けた部分を表面にそっと押し付けます。人差し指を使用して、テープの粘着面がサンプル表面に完全に密着するようにします。均一に動かし、気泡が入らないようにしてください。サンプルからゆっくりとテープを引き剥がします。表面に結合した微生物を物理的に抽出することで、細胞の捕捉を確実に行います。一般的な透明な事務用テープを使用し、テープに適切な張りと伸びを持たせて、しわのない平坦な表面になるようにしてガラス製顕微鏡スライドの上に粘着面を上にして貼り付けます。これにより、その後の加熱工程におけるテープの変形や丸まりによる問題を最小限に抑えることができます。ハイブリダイゼーションの間は、サンプリングした細胞がアガロース表面に直接接触し、後でテープをアガロース表面から簡単に剥がせるように、テープを裏返してxylose slicing tertile fourまたはXLT fourアガロースプレートの上に置いてください。濃縮後、テープのテンプレートサンプル接触部分をagri表面に密着させ、テープの一端を軽く貼り付けます。結露を防ぐため、シャーレの側壁を逆さまにして35 °Cで培養します。Salmonella属の十分な増殖を可能にするため、細胞を検出可能なレベルまで濃縮するために必要な培養期間は、初期のSalmonella汚染レベルによって異なります。所定の濃縮期間後、アガロースプレートを開けます。テープは培養中も粘着性を保持しています。テープとアガロースの界面に形成されたマイクロコロニーを最大限に回収するため、人差し指でテープをアガロースに軽く押し付けます。ペトリ皿の壁面に固定されている端からテープを掴み、ゆっくりと均一な動作で剥がします。一般的な透明オフィス用テープを使用して、セルチャージテープの粘着面を上にして顕微鏡スライドに貼り付け、しわのない平坦な表面を作成します。サンプルの接触領域を500 µLの10%中性緩衝ホルマリンで覆い、25 °Cで30分間、テープ上の細胞固定を行います。刺激性または毒性のある蒸気への曝露を最小限に抑えるため、固定液は化学フード内で密閉容器に廃棄し、テープ表面に1 x リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を穏やかに注いで1回洗浄し、サンプルを脱水させます。段階的なエタノール系列を用いて、市販の分子生物学グレードの溶液を使用してプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄バッファーを調製し、0.22 µmのシリンジフィルターでろ過した後、ハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファーを55 °Cに予熱します。あらかじめ加熱したハイブリダイゼーションバッファーに蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを加え、最終プローブ濃度を5 ng/µLにします。プローブカクテルを含むハイブリダイゼーションバッファー300 µLを、テープ上のテンプレートサンプル接触領域に重なるように加えます。ハイブリダイズさせたテープ結合細胞を、55 °Cに設定した湿潤密閉インキュベーションチャンバーに入れ、スライドモード搭載機器などの直接接触式インキュベーターで15分間ハイブリダイゼーションを行います。ハイブリダイゼーション後、スライドを取り出し、プローブを含むハイブリダイゼーションバッファーのオーバーレイを除去します。ピペッティングにより、あらかじめ加熱した洗浄バッファーで短時間かつ穏やかにすすぎます。傾斜させたスライド上の少量のバッファーにより、スライドを自然乾燥させ、蛍光顕微鏡を用いてSalmonella属菌を検出します。DPI（核対比染色剤）を含む封入剤のVector Shield H 1200を約10 µLスライドに滴下し、暗所で10分間インキュベートします。カバーガラスに浸油を滴下し、高倍率の油浸対物レンズを用いてサンプルを観察します。サンプルのフォーカス合わせにはDPIフィルターを使用します。その後、顕微鏡を適切なフィルターに切り替え、プローブの標識に使用した染料に応じて、サルモネラ細胞の緑色または赤色の蛍光に基づいて視覚的にカウントします。フローサイトメトリーによる検出を行う場合は、PBS懸濁サンプルを5 mLのラウンドボトムサンプリングチューブに移し、励起波長 647 nm のフローサイトメーターを用いて解析します。FlowJoソフトウェアを用いてデータを解析します。人工的に汚染させたトマトの表面から、terica serovar, Ty Muriumを粘着テープでサンプリングすることで、顕微鏡観察またはフローサイトメトリーによる細胞充填を用いた直接的な事後解析が容易になります。テープは、Salmonella特異的DNAプローブとTexas Redで標識したものの組み合わせを用い、テープ上のSalmonella細胞の初期局所濃度に応じて、迅速な蛍光in situハイブリダイゼーションのために処理されました。固相濃縮の結果は、単離されたマイクロコロニーからコンフルエントな増殖まで多岐にわたりました。テープでサンプリングした細胞は、サンプリング直後、または5時間の液体表面培養後に、FISHとフローサイトメトリーを組み合わせて解析することができました。35 °Cでミニカルチャー濃縮を行いました。食品安全におけるテープフィッシュ法の利用について記述しましたが、本手法は環境微生物学、植物病理学、または臨床微生物学を含む他の分野でも活用できる高いポテンシャルを有しています。本手順と並行して、テープで抽出したサンプルの固相または液相増菌物を用いて、生化学的試験やPCRなどの追加実験を行うことができます。これらの試験を用いることで、フィッシュ法の手順では範囲外となる、存在し得るsalmonellaに関する疑問を解決することが可能です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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