粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場でハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

この手順の全体的な目標は、粘着テープによる生鮮食品のサンプリングと、魚としても知られるC 2ハイブリダイゼーションの急速蛍光を使用したサルモネラ菌の全細胞分子検出を組み合わせることです。これは、最初に目的の材料に粘着テープを貼り付け、表面結合細胞を抽出することによって達成されます。セル電荷テープは、直接分析することも、固相または液相濃縮にかけることもできます。

手順の2番目のステップは、テープ上で、ブロスに言及または濃縮された細胞のエタノールシリーズでの自己固定および脱水です。第2ステップでは、細胞を懸濁液中で固定し、続いて保存バッファー中での細胞のResus懸濁液を調製します。手順の第3ステップは、サルモネラ菌特異的オリゴヌクレオチドプローブカクテルを使用してテープハイブリダイゼーションステップを迅速に実行し、続いてファックスを介して分析されたサンプルの洗浄バッファーリンスによる過剰なプローブの除去を行うことであり、魚のステップは懸濁状態で行われ、分析前に単純な希釈ステップを使用して余分なプローブを除去してもよい。

手順の最終ステップは、ハイブリダイズされたテープ結合細胞をDPIで対比染色し、蛍光顕微鏡を使用してそれらを検査することです。ファクトベースの分析では、対比染色は必要ありません。最終的に、この方法は、サンプリングされた生鮮食品に存在する可能性のあるサルモネラ菌種を視覚的またはサイトメトリーで検出する手段を提供します。

私が最初にこの方法のアイデアを思いついたのは、ローマのエアロストーン遺物の細菌群集を調べるために同様のアプローチを使用していたイタリアのグループについて読んだときでした。しかし、rと私は、食品微生物学の迅速な方法について教えていたクラスで、この研究についての議論を主導しました。数週間後、生鮮食品に起因するサルモネラ菌の流行が始まり、最終的には43の異なる州で約1500人が病気になりました。

当社の実験的アプローチは、生鮮食品上の特定の細菌タイプを検出するためのタイムリーで実用的な手段を提供する一方で、現場や食品生産環境でのテストを可能にするのに十分な携帯性も備えています。まず、サンプリングに使用するテープを選択します。いくつかのオプションには、市販の菌類テープまたは接触式があり、滅菌されており、使いやすさのためにパッケージ化されています。

油性マーカーを使用して、滅菌アルミニウムテンプレートを使用して、10センチメートルの粘着テープの非病気の側に1センチメートルの正方形を描きます。これは、テープのどの部分が食品または環境表面のサンプリングに使用されたか、粘着面がサンプリングされる表面を向くようにしたテープのCS字型ループを形成するために使用されたことを示す視覚的なガイドとして機能します。これを行うには、親指と中指でスティッキーの端を持ち、人差し指をテープの裏側に描かれた正方形に当てます。

サンプリングする表面にテープを置き、テープの端を離さずに、マークされた領域を表面にそっと押し付けます。人差し指を使用して、テープの粘着性のある面がサンプル表面に完全に接触していることを確認します。均一な動きで泡を避けます。

テープをゆっくりと引き抜きますampファイル。表面に結合した微生物を物理的に抽出すると、細胞の電荷が固定されます。ガラス顕微鏡スライドに粘着性のある面を上にしてテープを貼る一般的な透明なオフィステープを使用して、テープの適切な張力と伸張を確保し、しわのない平らで表面が作られるようにします。

これにより、テープの変形やカールの問題を最小限に抑えることができます。その後の加熱中。ハイブリダイゼーション中は、テープを下にしてキシローススライス三等分4またはXLT4アグリプレートに置き、サンプリングした細胞がアグリ表面に直接接触するようにして、アグリ表面からテープを簡単に取り除きます。

濃縮後、テープのテンプレート化されたサンプル接触部分をアグリ表面と同じ高さに配置し、テープの一端を緩く接着します。ペトリ皿プレートの側壁は、結露を避けるために反転し、摂氏35度でインキュベートされます。サルモネラ菌種を十分に増殖させるためには、細胞を検出可能なレベルまで濃縮するために必要なインキュベーション期間の長さは、初期のサルモネラ菌汚染レベルによって異なります。

所望の濃縮期間の後、寒天プレートを開くと、テープはインキュベーション中にその粘着性を保持します。人差し指を使用してテープを寒天にそっと押し付けて、形成されたマイクロコロニーの最大回復を確保します テープ寒天インターフェースで、ペトリ皿の壁に取り付けられた端からテープをつかみ、ゆっくりと均一な動きで取り外します。一般的な透明なオフィステープを使用して、セルチャージテープの粘着面を上にして顕微鏡スライドに取り付け、しわのない平らで表面を作成します。

サンプル接触領域を500マイクロリットルの10%中性緩衝ホルミンで覆うことにより、摂氏25度で30分間テープ細胞固定を行います。固定剤を化学フードの下の密閉可能な容器に廃棄して、刺激性または有毒な蒸気への曝露を最小限に抑え、テープを1 x リン酸緩衝生理食塩水またはPBSで一度洗浄し、テープ表面にPBSを静かに浸してサンプルを脱水します。プログレッシブエタノールシリーズを使用して、市販の分子生物学グレードの溶液フィルターを使用してプレハイブリダイゼーションハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファーを調製し、ポイント22マイクロメートルシリンジを使用し、ハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファーを摂氏55度に予熱します。

蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブを予熱されたハイブリダイゼーションバッファーに添加して、最終プローブ濃度がマイクロリットルあたり5ナノグラムになるようにし、プローブカクテルとハイブリダイズテープ結合細胞を含む300マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーを含むテープのテンプレートサンプル接触領域を、直接接触インキュベーター用に摂氏55度に設定された湿った密閉インキュベーションチャンバーで覆い、 スライドモード装置を15分間ハイブリダイズするなど。ハイブリダイゼーションに続いて、スライドを除去し、ハイブリダイゼーションバッファーオーバーレイを含むプローブを廃棄します。ピペッティングにより、予熱した洗浄バッファーで短時間かつ穏やかにすすぎます。

傾斜したスライド上に少量のバッファーを載せることで、スライドを風乾させ、蛍光顕微鏡によるサルモネラ菌種のオナップ検出を行うことができます。スライドに約10マイクロリットルのベクターシールドH1200を重ね合わせ、dpiを含む封入剤を、核対比染色を暗所で10分間インキュベートする。カバーに液浸油を敷き、高倍率の対物レンズを使用してサンプルを滑り込ませて検査します。

DPIフィルターは、サンプルにピントを合わせるために使用されます。次に、顕微鏡を適切なフィルターに切り替え、サルモネラ菌細胞を、プローブの標識に使用される色素に応じて、緑色または赤色の蛍光に従って視覚的にスコアリングします。フォアサイト検出では、PBS懸濁サンプルを5ミリリットルの丸底サンプリングチューブに移し、647ナノメートルの励起でフローサイトメーターを使用して検査します。

FlowJoソフトウェアを使用してデータを分析します。人工的に汚染されたトマトの表面からterica serovar、Ty Murium の粘着テープサンプリングは、顕微鏡法またはフローサイトメトリー細胞電荷による魚類の直接分析を容易にします。テープは、サルモネラ菌特異的DNAプローブの組み合わせを使用してC 2ハイブリダイゼーションで迅速な蛍光を発するように処理し、テープ上のサルモネラ細胞の初期局所濃度に応じてTexas Redで標識しました。

固相濃縮により、単離されたマイクロコロニーからコンフルエントな増殖まで、さまざまな結果が得られました。テープでサンプリングした細胞は、フィッシュサイトメトリーとフローサイトメトリーを組み合わせて、サンプリング直後または5時間の液面観察後に解析することができました。摂氏35度でのミニカルチャーエンリッチメント。

食品安全のためのテープフィッシュ技術の使用について説明しましたが、この方法は、環境微生物学、植物病理学、臨床微生物学などの他の分野でも使用できる可能性が十分にあります。この手順と並行して、テープ抽出サンプルからの固相または液相濃縮に対して、生化学的試験やPCRなどの追加の実験を行うことができます。テストは、存在する可能性のあるサルモネラ菌に関する質問、魚の手順の範囲を超えた質問に答えるために使用できます。