Name: 胚様体の凍結切片を使用して、多能性幹細胞の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 学ぶ胚様体の凍結切片作成法。多能性幹細胞を用いて細胞・分子レベルで発生過程を解析し、構造保全と分化メカニズムの理解を深める実験手法を紹介します。

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この作品はFundaçãoパコデアンパロによってサポートされていたPesquisaエスタードが行う作業リオデジャネイロ（FAPERJ）、ConselhoナシオナルデDesenvolvimento Científico電子モンテ（CNPq）とセルバンテスナシオナルデCiênciaのe Tecnologia（INCTC）。我々は、ブルーナS.ポールセンやEBの画像のアラインM.フェルナンデスに感謝しています。

1。固定と凍結保存多能性幹細胞がマウス胚性線維芽細胞（MEF）マイトマイシンCで不活化し、20％ノックアウト血清代替（KSR）および線維芽細胞増殖因子の8ng / mLの（FGF - 2）を補充したDMEM/F12で維持に培養した。 EBの形成を誘導するために、H9細胞は非接着性の皿に移し、7日間培養、KSR 8〜15％を補足したDMEM/F12中で維持した。 注（！）：この手法は、任意の胚および誘導多能性幹細胞から派生したEBS用に使用することができます。 <ol><li>ピペットで培養皿からEBSを収集する。 </li><li> 15 mLコニカルチューブにEBSを移し、チューブの底に材料のシンクまで待ちます。 </li><li>培養液を除去し、室温で30分間、PBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液でEBSを修正。 注（！）：in situハイブリダイゼーションの抗原の回復にはPFA 6,7を使用しているため、抗体によるクロスリンク反応を避けるために行われるべき。 </li><li> PFA溶液を除去し、5分間PBSで洗浄する。 </li><li> EBは25から28にPBS -バッファショ糖溶液の段階希釈（シーケンス10、20および30％）に配置する必要があります° Cは、それぞれの解決策は30分ごとに交換する必要があります。材料は、OCTで埋め込むステップまで、4で30％のスクロース溶液° Cに貯蔵することができます。 </li></ol> 2。組織の埋め込み、ガイダンスと凍結<ol start="6"><li>慎重にチューブからEBSを収集する。できるだけ多くの蔗糖液として排出。 注（！）：EBSを収集する前に、ショ糖溶液と先端の内壁を湿らせることが重要です。この手順では、先端に装着されるEBを回避することができます。 </li><li>金型内でEBSを置き、ろ紙で残りのショ糖溶液を取り除く。 注（！）：重複を避けるためにEBSと金型を埋めるためにしないことが重要です。 </li><li> EBSを再中断しないように注意しながら、ゆっくりとOCTで金型を埋める。その後、金型の中心にすべてのEBを配置し、ピペットで泡を取り除く。 </li><li>穏やかに15分間振とうする。 </li><li>サンプルを凍結する砕いたドライアイスを使用して金型を囲みます。 OCTは完全に凍結して下さい。この時点で、ブロックは少なくとも1年間は、-70℃で保存することができます。 </li></ol> 3。 Cryosectioningテクニック<ol start="11"><li> ° Cと以前に-18と-21の間の温度で冷却するクライオスタット上で場所-70℃から凍結したブロックを削除します。 注（！）：この範囲外の温度は、セクション、カーリング溶融やクラックなどのトラブルを引き起こす可能性があります。 </li><li>金型からのOCTブロックを外し、より多くのOCTを追加することにより、クライオスタットのサポートに配置します。 </li><li>それが適切にブロックの向きが重要であるとブレードのエッジには、平行に合わせます。 注（！）：EBSは、他の組織サンプルよりも小さいので、このステップは、材料のロスを最小限に抑えるために極めて重要である。 </li><li>表面の平面が得られるまでのOCTブロックは、表面的に切片化してください。組織標本の薄片（10μm以下）は以前に200ミリグラム/ mLのポリLリジン（スライド当たり10μL）9,10でコートしたスライド採取し、ガラス上にマウントされている必要があります。 注（！）：tornedセクションを避けるためには、ブレードで損害に注意を払う。 </li><li>すべてのセクションでは、でなければ空気乾燥、室温で1時間、次に使用するまで使用または-70℃保存をする。 </li></ol>

<ol><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-117 (1998).</li>
<li>Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+compromising+the+three+embryonic+germ+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers.</a> Mol Med. 6, 88-95 (2000).</li>
<li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+inducing+embryoid+body+formation%3A+in+vitro+differentiation+system+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells.</a> J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).</li>
<li>Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+propagation+and+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).</li>
<li>Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+combined+fluorescence+in+situ+hybridization+and+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cells%22%5BJournal%5D)">A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry.</a> Mol Cells. 24, 76-82 (2007).</li>
<li>Daneshtalab, N., Doré, J. J., Smeda, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection%3A+Procedures+in+immunohistochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).</li>
<li>Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval+for+immunohistochemical+reactions+in+routinely+processed+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections.</a> Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).</li>
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<li>Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+of+specific+relaxin-binding+cells+in+thecervix%2C+mammary+glands%2C+and+nipples+of+pregnant+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats.</a> Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

方法は、免疫蛍光およびin situハイブリダイゼーションアッセイに有用な胚様体のPFA固定薄凍結切片を得るためにわかりやすいプロトコルを提供するここで説明する。集合体としての構造や組織を維持しながら、結果として凍結切片は、ヒト胚性幹細胞の分化の細胞および分子的側面の研究を可能にする。

<table><tbody><tr><td>D (+) スクロース</td><td>試薬</td><td>Vetec</td><td>228</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>試薬</td><td>Rieden-de Ha&amp;#235;n</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>PBS溶液</td><td>試薬</td><td>LGC Biotecnology</td><td>13-30259.05</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リシン臭化水素酸塩</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>水に溶解 200mg/mL</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. コンパウンド</td><td>試薬</td><td>Sakura Finetek</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>スクロース溶液</td><td>試薬</td><td></td><td></td><td>PBS中 10% w/v スクロース溶液</td></tr><tr><td>スクロース溶液</td><td>試薬</td><td></td><td></td><td>PBS中 20% w/v スクロース溶液</td></tr><tr><td>スクロース溶液</td><td>試薬</td><td></td><td></td><td>PBS中 30% w/v スクロース溶液</td></tr><tr><td>コニカルチューブ</td><td>器具</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td>15mL コニカルチューブ</td></tr><tr><td>プレートシェーカー</td><td>器具</td><td>Biomixer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>器具</td><td>Leica Microsystems</td><td>CM 1850</td><td></td></tr><tr><td>OCTプラットフォーム用型</td><td>器具</td><td></td><td></td><td>プラスチック製型プラットフォーム</td></tr></tbody></table>

胚様体の凍結切片を使用して、多能性幹細胞の解析

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

胚性幹（ES）細胞は胚盤胞段階の初期の哺乳類の胚1の内部細胞塊に由来する多能性細胞である。 ES細胞の分化に重要な段階は、胚様体（EB）を集約2,3の形成である。 ES細胞は非接着プレートで培養されているときにEBの形成が自発的凝集に基づいています。外胚葉、中胚葉と内胚葉4：三次元EBの反復するには、多くの初期の哺乳類の胚発生の側面とは、三胚葉に分化する。 免疫蛍光法およびin situハイブリダイゼーションは、広く組織部5、6、7の細胞に存在する標的蛋白質とmRNAの検出のための技術を使用している。ここでは、胚様体の高品質の凍結切片を生成する単純な手法を提示する。このアプローチは、凍結切片法に続いて、OCTで埋め込むEBの空間的な向きに依存しています。結果のセクションは、特定のタンパク質、RNAまたはDNAを含む細胞集団を特徴づけるために、分析的手続の多種多様に供することができる。この意味で、EB凍結切片の準備（10μm以下）は組織学的染色の解析に必須のツール（例えば、ヘマトキシリンとエオシン、DAPI）、免疫蛍光（例えばOct4の、ネスチン）またはin situハイブリダイゼーションである。また、この手法は、EBの三次元球状構造の維持にに関してと胚の側面を理解するのに役立ちます。

懸濁液中で成長して多能性幹細胞は胚様体（EB）に分化する。集合体としての組織を維持しながら、ここでは、胚発生の細胞および分子的側面を研究するための有用な高品質のEBの凍結切片を取得する方法を示します。

胚性幹（ES）細胞は、哺乳類の胚盤胞期における初期胚の内細胞塊に由来する多能性細胞である1。...における重要な段階は、

パート1、はじめに。こんにちは、ラファエルです。私はブラジルのリオデジャネイロ連邦大学にあるStevens Hans教授の研究室のポストドクターです。こんにちは、イスマイルです。私はリサーチアシスタントであり、教授も務めております。このビデオでは、Android bodiesの透過切片の作製方法について解説します。それでは始めましょう。パート2では、材料と器具について説明します。この手順では、凍結標本用の包埋剤が必要です。細胞固定用の4%パラホルムアルデヒド溶液、および凍結保護用のスクロース溶液。先端がわずかに曲がった針、EBSをより詳細に観察するための実体顕微鏡、およびシェーカー。パート3。ここでは、ヒト胚体（embryo bodies）を非 adhere 培養プレートで培養しています。ピペットを用いて、15 mL コニカルチューブに回収するため、すべての胚体をできるだけ密集させます。その後、EBSを注意深く回収し、チューブに移します。材料の量が少ないため、すべてのebsを回収することが重要です。EBSをデカンテーションした後、培地を慎重に廃棄します。チューブの底にペレットが確認できるはずです。これで、固定の手順に進むことができます。EBSは、PBSまたはリン酸緩衝生理食塩水中の4%パラホルムアルデヒド溶液で固定します。ペレットをPFA溶液で再懸濁させることが重要です。その後、EBSを固定液で30分間固定します。固定後、PFA溶液を慎重に取り除きます。EBSを再懸濁させないよう注意しながら、EBSの凍結保護を開始するためにPBSによる10% sucrose溶液に置換し、この溶液中で30分間保持します。次に、10% sucrose溶液を慎重に取り除き、EBSを20% sucrose溶液に再懸濁させます。再び、EBSをこの溶液中で30分間保持します。最後に、20% sucrose溶液を除去し、PBSで調製した30% sucrose溶液に交換し、さらに30分間保持します。これで、EBSの方向付けおよびブロッキング工程に進むことができます。当研究室では、空のカプセルシェルを型として使用しています。ebsのブロッキングには、ebsを回収する前にチップの内壁をスクロース溶液でコーティングすることが重要です。これで、慎重にEBSを回収し、それらがチップの底に沈殿するまで待機することができます。次に、EBSをブロックの中央に配置します。これがブロック内におけるEBSの最終的な位置となります。実体顕微鏡と細いチップを用いて、ショ糖溶液を可能な限り回収し、排出します。常にebsを回収しないように注意します。先端をわずかに曲げた針を用いて、すべてのEBSをブロックの中央に配置します。最後に、残ったショ糖溶液をフィルターペーパーで吸収して回収します。高品質な切片を得るためには、ブロック内におけるEBSの正確な位置が非常に重要です。以下は、シェル内でのEBの配置が不適切な例です。EBSを配置し、ショ糖溶液を除去した後、EBSが再懸濁されないよう細心の注意を払いながら、シェルの端からOCTを充填します。残った気泡をピペットで取り除き、シェルを15分間攪拌します。攪拌後、OCTブロックをドライアイスで凍結させます。この時点で、ブロックをアルミホイルで包んで−80 °Cで保存し後日解析するか、またはクライオスタットのパート4「切片作成」に進みます。凍結切片を作成するには、使い捨てまたは永続的なブレード、OCT化合物、およびポリL-リシン処理済みのガラススライドが必要です。OCTブロックを冷凍庫から取り出し、−20 °Cに達するまでクライオスタット内に保持します。次に、ブロックをスタンドに設置し、ブレードのエッジと平行に合わせます。EBサンプルは他の多くの組織サンプルよりも格段に小さいため、材料の損失を最小限に抑えるために、ブロックの全表面が同時にブレードに接触していることを確認することが非常に重要です。設置後、ブロックを10 µmの厚さで薄切し、これらの切片を直接ガラススライド上に回収します。スライドは、好ましくは-70°Cで保存するか、または当日に使用してください。得られた材料は、免疫組織化学染色または免疫蛍光染色に用いることができます。結論として、本手法で述べた方法は、ヒトH9またはマウスUSP1幹細胞株から分化した胚体の薄いクリオスタット切片を得るための、比較的安価で簡便なプロトコルを提供します。得られた凍結切片は、タンパク質発現やEB形態を解析するための幅広い手順に使用できます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、開発中の主要な造血器官として胎盤を同定した。我々はその造血幹細胞（HSC）が生成され、ユニークな微環境のニッチの胎盤で展開されている両方とも発見。ここで、我々はマウス胎盤における造血幹細胞の分離と可視化に必要な実験手法を説明します。...

プラセンタから造血幹細胞の単離と解析

細胞表面マーカー（SSEA-3/SSEA-4）のためのヒト多能性幹細胞（hPSCs）の懸濁液を免疫細胞化学染色を観察し、定量化のための細胞の単層を作成するために自作サイトスピン装置の使用に基づいて達成された。...

セルフメイドサイトスピン装置を用いてヒト多能性幹細胞の免疫細胞化学的解析

このビデオでは、人工多能性幹細胞(iPSC)から脳オルガノイドを生成するアッセイを実演しています。ヒトiPS細胞は、胚様体(EB)を形成するように誘導されます。EBは、誘導媒体を使用してポリマー足場上で培養され、神経幹細胞、前駆細胞、未成熟ニューロンへの分化を促進します。最後に、EBはマトリックスに埋め込まれ、脳オルガノイド形成のための維持培地に移されます。...

人工多能性幹細胞由来脳オルガノイドの作製

単一細胞の遺伝子発現アッセイは、幹細胞の不均質性を理解するために必要とされる。...

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

このプロトコルは、マウス着床前胚において系統の仕様を研究するために、タンパク質発現のin situ分析 、定量的、単一のセルを実行するための方法を提示します。胚盤胞のコレクションのために必要な手順、全マウント免疫蛍光タンパク質の検出、共焦点顕微鏡での試料の画像化、および核分割及び画像解析について説明します。...

マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

我々は2人のまたは3次元の胚様体を生成するために、マウスの胚性幹細胞を使用するためのテクニックを説明します。私たちは、その後、レチノイン酸によって胚様体細胞の神経分化を誘導する方法を説明し、どのように前駆細胞マーカーの免疫蛍光およびイムノブロッティングによりそれらの分化の状態を分析します。...

2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

ここでは、無血清胚様体（SFEB）と呼ばれるヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）から3次元（3-D）システムを開発するためのプロトコールを報告する。この3-Dモデルは、器質型のスライス培養のように、ヒトの皮質の発達をモデル化するため、および神経回路を発達させる生理学的な質問のために使用することができる。...

生理学的に関連性のあるアッセイを用いた3-D幹細胞培養物の調査のためのHiPSC由来の無血清胚様体の開発

始原生殖細胞 (PGCs) 精子と卵の両方の共通の前駆体であります。人間の胚の始原生殖は、サイトカインとの相互作用を通じて多能性胚盤葉上層の細胞から指定されます。ここでは、プライミング多能性誘導多能性幹細胞からの胚様体の表面で孵卵に似たひと細胞 transcriptomally を誘導する 13...

プライミング多能性胚様体の表面で人間の始原生殖細胞のような細胞の生成誘導多能性幹細胞

吊り下げドロップ法を用いて、マウス胚性幹細胞を神経細胞に分化する手順について説明する。また、RT-qPCR、免疫蛍光、RNA-seq、フローサイトメトリーを通して包括的なフェノミック解析を行っています。...

マウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞とニューロンの分化と特徴付け

我々は、新皮質発生の2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)ベースのモデルの生成および特性評価のための詳細なプロトコル、ならびに初代繊毛(PC)生合成および機能の定性的および定量的分析を可能にする補完的方法論を提示する。...

2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞ベースのモデルにより、新皮質発生中の原発性繊毛の関与を解剖

ここでは、単一細胞および単一核RNAシーケンシングを使用したヒト脳オルガノイドの生成およびダウンストリーム解析のための包括的なプロトコールを紹介します。...

脳オルガノイドにおけるシングルセルおよびシングル核トランスクリプトームの生成とダウンストリーム解析

学ぶ胚様体の凍結切片作成法。多能性幹細胞を用いて細胞・分子レベルで発生過程を解析し、構造保全と分化メカニズムの理解を深める実験手法を紹介します。

胚様体の凍結切片を使用して、多能性幹細胞の解析

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