胚様体の凍結切片を使用して、多能性幹細胞の解析

パート1、イントロダクション。こんにちは、私の名前はラファエルです。私はブラジルのリオデジャネイロ連邦大学のスティーブンス・ハンス教授研究室のポスドクです。

こんにちは、私の名前はイスマイルです。私は研究助手であり、教授でもあります。このビデオでは、Android本体のクリアセクションを準備する方法を示します。

それでは始めましょう。パート2、材料と機器。この手順では、凍結標本用の埋め込み媒体が必要になります。

細胞の固定のための4%パラホルムアルデヒド溶液、凍結保護のためのスクロース溶液。先端がわずかに曲がった針、EBSの視認性を高めるための実体顕微鏡、シェーカー。パート3。

ここでは、ヒト胚体が非接着性の培養プレートで培養されています。ピペットを使用して、すべての胚体をできるだけ近づけてグループ化し、15ミリリットルの円錐管に移します。EBSは慎重に収穫され、チューブに移されます。

EBSがデカントされた後、培養培地は慎重に廃棄されます。チューブの底にペレットが見えるはずです。これで、固定手順に進むことができます。

EBS は、PBS またはリン酸緩衝生理食塩水中の 4% パラホルム アルデヒド溶液に固定されます。ペレットをPFA溶液で再懸濁することが重要です。その後、EBSを固定溶液中で30分間固定します。

固定後、PFA溶液を慎重に取り出します。ResusがEBSを懸濁させないように注意し、PBS中の10%スクロース溶液に置き換えてEBSの凍結保護を開始し、材料をこの溶液で30分間保持します。次に、10%ショ糖溶液を慎重に除去し、EBSを20%スクロース溶液に再懸濁します。

ここでも、EBSはこのソリューションで30分間保持されます。最後に、20%スクロース溶液を除去し、PBS中の30%スクロース溶液に置き換えて、さらに30分間保持します。これで、ebsのオリエンテーションとブロッキングに進むことができます。

私たちの研究室では、空のカプセルシェルを型として使用しています。ebsをブロックするには、ebsを収集する前に、先端の内壁をショ糖溶液でコーティングすることが重要です。これで、EBSを慎重に収集し、先端の底にデカントするまで待つことができます。

次に、EBSをブロックの中央に配置します。これは、ブロック内のEBSの最終的な位置である必要があります。実体顕微鏡と細い先端の助けを借りて、できるだけ多くのショ糖溶液を収集して排出します。

ebsを溜めないように常に注意してください。先端がわずかに曲がった針を使用して、すべてのEBSをブロックの中央に配置します。最後に、残りのショ糖溶液を濾紙片で収集します。

ブロック内のEBSの特定の位置は、高品質のスライスを得るために非常に重要です。これは、シェル内のEBポジショニングが不十分な例です。EBSの位置決めとショ糖溶液の除去に続いて、シェルはエッジからOCTで満たされますが、常にResusがebsを懸濁しないように注意します。

残りの気泡をピペットで取り除き、シェルを15分間攪拌します。動揺に続いて。OCTブロックはドライアイスで凍結されています。

この時点で、アルミホイルで包まれたブロックをマイナス80°Cで保管してさらに分析するか、クライオスタットパート4の切断に進むことができます。クライオ切片を作成するには、使い捨てまたは永久ブレード、OCTおよびポリLリジン前処理ガラススライドが必要になります。OCTブロックは冷凍庫から取り出され、摂氏マイナス20度に達するまでクライオスタット内に保持されます。

次に、ブロックをスタンドに配置し、ブレードの端と平行に位置合わせします。EBサンプルは他のほとんどの組織サンプルよりもはるかに小さいため、ブロックの表面全体が同時にブレードに接触し、材料の損失を最小限に抑えることが非常に重要です。位置決め後、ブロックは10マイクロメートルのスライスにカットされ、これらはスライドガラスに直接集められます。

スライドは、好ましくはマイナス70°Cで保存してもよく、または同じ日に使用してもよい。この材料は、免疫組織化学または免疫蛍光法のために染色することができます。結論。本明細書に記載の方法は、ヒトH nineまたはマウスUS P one幹細胞系統の両方から開発された胚体の薄いクライオスタット切片を得るための、合理的に安価で従うことの容易なプロトコルを提供する。

得られたクライオ切片は、タンパク質発現やEB形態を解析するために、さまざまな手順で使用することができます。