高電圧エレクトロポレーションを用いた細菌の調製と形質転換

栄養培地に接種された細菌の入ったチューブから始めます。

細胞が活発に分裂する段階に達するまで、振とうしながらインキュベートします。

遠心分離して細胞を収集し、上清を廃棄します。

氷冷グリセロールで細胞を繰り返し洗浄して塩を除去し、グリセロールに再懸濁して細胞生存率を維持します。

DNA分解を防ぐために、EDTAを含む滅菌水中で抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミドを調製します。

プラスミド溶液を細菌細胞と混合します。

短い高電圧パルスを印加して、細菌膜に一時的に細孔を作ります。

これにより、プラスミドDNAが細胞質に入ることができます。

すぐに細胞を回収培地に移し、振とうしながらインキュベートします。

培地の成分は、膜修復とプラスミドにコードされた抗生物質耐性遺伝子の発現をサポートします。

抗生物質を含む栄養寒天培地に細胞を広げ、コロニーが形成されるまでインキュベートします。

単一のコロニーを選び、それを新しいプレートにストレークして形質転換体を精製します。

実験を開始するには、上位10の大 腸菌 株の電気コンピテント細胞を準備します。

1つのコロニーを1ミリリットルのLB培地に移します。チューブを摂氏37度でインキュベートし、180RPMで振とうします。前培養物を25ミリリットルの新鮮なLB培地で500に希釈し、対数相0.6ODに達するまで培養物を摂氏37度でインキュベートします。細胞懸濁液を5,000 RPMで20分間遠心分離します。

遠心分離後、ペレットを1体積あたり10%の体積の25ミリリットル、氷冷の滅菌グリセロール水に再懸濁し、このステップを4回繰り返し、1.5ミリリットルに達するまで毎回再懸濁量を保ちます。

次に、ペレットを10%グリセロールに再懸濁し、細胞懸濁液を50マイクロリットルのアリコートに分割します。アリコートは摂氏マイナス80度で最大6か月間保管してください。実験を続行するには、目的のプラスミドを0.5ミリモルEDTAを添加した滅菌水に溶解し、電気的有位細胞のアリコートを氷上で解凍します。

2.5〜5ナノグラムのベクターを加え、解凍した細胞を混合します。セルを0.1センチメートルのキュベットに分注します。1.8キロボルトのパルスをセルに印加し、エレクトロポレーションしたセルをすぐに1ミリリットルのSOC培地に移します。

細胞を1時間振とうしながらインキュベートし、100マイクロリットルのアリコートをLB寒天培地と抗生物質を含むシャーレに移し、細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。ペトリ皿に単一のコロニーをストリーキングして、トランスフォーマーを精製します。