オプソナイズド赤血球を用いた補体媒介食噬のモデル化

細胞表面抗原に結合したIgM抗体を持つIgMオプソニ化された羊赤血球(SRBC)を例に取る。

C5を除く補体タンパク質を含む血清を追加してください。

C1複合体は抗体に結合し活性化します。

活性化したC1はC4とC2を切断し、C3コンバーターゼを形成し、C3はC3を切断してSRBCにC3bを沈着させます。

C5がなければ、C3bはC3biに分解されます。

SRBCをマクロファージ培養に加えます。

C3biはマクロファージ受容体に結合し、SRBCの食細胞作用を引き起こします。

低張性溶液を加えて溶解し、非内化SRBCを除去します。

細胞を溶解するために溶解バッファーを加え、SRBCヘモグロビンを放出します。

検出試薬を導入してください。

尿素が存在する場合、ヘモグロビンはジアミノフルオレンを過酸化水素によって酸化させ、着色生成物を生成します。

着色生成物の吸収度を測定し、これはSRBCが食う量に比例します。

このアッセイは、オプソニゼーションSRBCを用いて抗体標的菌の食細胞作用をモデル化しています。

オプソニゼーションアッセイでは、羊赤血球(SRBC)を2×10の8分の1に、ウサギ抗SRBC免疫グロブリンMまたはIgM50マイクロリットルを室温で30分間インキュベートします。

次に、オプソニタイズされたSRBCをC5欠損ヒト血清50マイクロリットルと37度の環境で30分間インキュベートし、IgM被覆SRBC上のC3bおよびC3b阻害因子補体断片を固定します。

次に培地を吸引し、培地1ミリリットルあたり7個のオプソニ化SRBCに1×10の10マイクロリットルを、1枚×10の4番目の一晩培養マウスマクロファージを含む96ウェルプレートの各ウェルに追加します。

SRBCマウス用マクロファージ共培養を37度の温度で1時間培養し、その後、塩化アンモニウム-カリウム溶解バッファー100マイクロリットルで1分間洗浄して、結合していないSRBCを除去します。

結合していないSRBCを除去した後、100マイクロリットルの培地で洗い流します。残りの細胞は0.1%のドデシル硫酸ナトリウムで溶解し、溶解液には2,7-ジアミノフルオレン50マイクロリットルに3%過酸化水素と6モル尿素を補足して処理します。

次に、ヘモグロビン触媒によるフルオレンブルー形成の吸収を分光光度計で620ナノメートルで測定します。

620ナノメートルの吸収率値の標準曲線を用いて、既知のSRBC数を用いて、食いが施されたオプソニズム化されたSRBCの数を決定します。