Fcγ受容体媒介食作用を評価するために、単球単層アッセイの使用

このin vitro機能アッセイの全体的な目標は、FC媒介性食作用のさまざまな側面を評価することです。この方法は、赤血球に対する自己抗体および同種抗体の臨床的意義は何かなど、免疫血液学および輸血医学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術は、赤血球に対する抗体があらかじめ形成されている患者の輸血の結果を予測するためにin vitroで実施できる機能生物学的アッセイを提供します。

その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるCindy Tongです。ここで、人間の血液を扱う作業は危険な場合があり、この手順を実行するときは常に保護ガウンや手袋を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。健康なドナーから1〜2個の10ミリリットルの全血サンプルを、静脈穿刺によって酸性クエン酸デキストロースを含むバキュテナーチューブで取得した後、チューブをクラスIIバイオセーフティキャビネットに入れ、血液を温かい完全な培地で1対1の比率で希釈します。

次に、層が混ざらないように注意しながら、遠心チューブの側面から室温の密度勾配に血球をゆっくりとピペットで移します。遠心分離により細胞を分離します。次に、上部のプラズマ層を廃棄し、ガラス製のパスツールピペットを使用して、バフィーコートを含むPBMCを新しい15ミリリットルチューブに移します。

単離したPBMCをPBSで3回洗浄し、3回目の遠心分離後に細胞を3〜7ミリリットルの培地に再懸濁します。カウント後、細胞を完全な培地で1ミリリットルあたり10〜6番目の細胞濃度の1.75倍に希釈し、400マイクロリットルの細胞を8チャンバースライドの各ウェルに播種して、摂氏37度、最大湿度で5%CO2で1時間のインキュベーションを行います。R2R2赤血球をオプソニン化するには、まずPBSで赤血球を3回洗浄します。

3回目の遠心分離後、ヒト血清由来のポリクローナル抗D抗体と1対1の比率でR2R2ペレットを希釈し、摂氏37度で1時間インキュベートし、間欠的に混合します。オプソニン化の最後に、インキュベーターから細胞を取り出し、示したようにPBSでさらに3回洗浄します。ペレットを完全なRPMI培地で1.25%の容量に再懸濁します。

次に、8チャンバースライドの各ウェルからの上清を、400マイクロリットルのオプソニン化R2R2細胞と摂氏37度で2時間交換します。インキュベーションの最後に、スライドアダプターを使用してチャンバーを取り外し、余分なR2R2をペーパータオルで軽くたたきます。次に、100ミリリットルのビーカーにPBSを入れ、各スライドを塩溶液に30〜40回ゆっくりと浸して、未食作用のR2R2の大部分を取り除きます。

乾燥後、スライドを100%メタノールに45秒間固定し、細胞を乾燥させてから、サンプルをカバースリップでマウントします。翌日、各スライドを40倍対物レンズを備えた位相差顕微鏡にロードし、各手に1つのカウンターを使用して、少なくとも200の単球と各単球内の食作用R2R2の数を手動でカウントし、サンプルあたりの単球数と食作用R2R2細胞の数を同時に定量します。静脈内免疫グロブリンは、用量依存的に食作用を阻害するFC受容体に結合してブロックし、1ミリリットルあたり200マイクログラムの静脈内免疫グロブリン濃度からほぼ100%の阻害が観察され、阻害剤の0.5マイクログラム未満の濃度ではほとんど阻害が観察されませんでした。.

食作用指数をR2R2陽性対照に0%阻害として正規化すると、IC 50を3マイクログラム/ミリリットルとする阻害曲線を決定することができる。経験を積むと、位相差顕微鏡を使用して、単球を汚染された赤血球から、また食作用のある赤血球から液胞を区別することができます。R2R2赤血球の定量や過剰オプソニン化の際には、密集した細胞クラスターや破片を避ける必要があります。これは、単球内部を過密にし、正確な食作用分析を妨げる食作用の亢進につながる可能性があります。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば6〜8時間で完了できます。この手順に続いて、共焦点顕微鏡を用いた免疫細胞化学や免疫蛍光などの他の方法を実行して、食作用タンパク質の発現、赤血球の相互作用、および区画化に関する追加の質問に答えることができます。この技術は、初期開発とさらなる最適化により、輸血医学や細胞生物学の分野の研究者がオプソニゼーションシステムを探索する方法に情報を提供します。

このビデオを見れば、食作用を引き起こす抗体相互作用の種類を評価するための単球単層アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。