Name: Fcγ受容体媒介食作用を評価するために、単球単層アッセイの使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 学ぶ単球単層アッセイによるFcγ受容体媒介食作用の評価法。ヒト血液由来単球を用いたin vitro機能アッセイで、輸血医学における抗体の臨床的意義を解明し、輸血予測に貢献します。

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著者は、カナダの血液サービスからT.N.T.への大学院フェローシッププログラム賞に感謝します。この研究は、連邦政府(Health Canada)と州および準州の保健省が資金提供するCanadian Blood Services' Centre for Innovationから資金援助を受けました。ここに記載されている見解は、カナダの連邦政府、州政府、または準州政府の見解を反映したものではありません。

研究倫理委員会/機関審査委員会によるヒト試料の使用の承認を取得し、すべてのヒトのドナーから署名された同意を得ます。 MMAは、動物用倫理承認以下、人間のアッセイと同様に、マウスのPBMCを使用して行うことができます。 MMAは、無菌の組織培養技術を利用します。 メモ： 図1を参照してください。 注：我々は方法が唯一の「短期」とは、培養法であるとして、無菌技術を維持するために、アッセイ中にレベル2生物学的封じ込めのキャビネットを使用することをお勧めしますが、細菌がアッセイを汚染するため、実際に十分な時間がありません。したがって、レベル2の生物学的封じ込めキャビネットが存在するだけではなく、このアッセイのためにいずれかを購入していない場合、アッセイはオープンベンチに、生物学的封じ込めキャビネットの外で行うことができました。 5％CO 2で37℃のインキュベーターの使用は、しかしながら、オプションではなく、使用しなければなりません最適な結果を得ます。 1.末梢血単核細胞の単離<ol><li>健康なドナーまたは酸 - クエン酸 - デキストロース（ACD）抗凝固剤（黄色のトップチューブ）を含むバキュテナーを使用して静脈穿刺を介して患者からのヒト全血を取得します。 注記：全血を、次のステップ11に進む前に、最大36時間、室温（18~22℃）でACDに格納することができます。通常は、全血の1-2 10-mLの真空採血管は、アッセイのために十分です。 </li><li>暖かい完全RPMI培地中で1 V / V（RPMI-1640は、10％ウシ胎児血清、20mMのHEPES、0.01ミリグラム/ mlのゲンタマイシンを補充した）全血1に希釈します。 </li><li>製造業者によって推奨されるように（材料のリストを参照）、密度勾配遠心分離を用いて希釈した全血から末梢血単核細胞（PBMC）を単離します。 （室温に加温し、18-22℃）で密度勾配上で非常にゆっくりと希釈した血液をレイヤ。 注：ミクシィの量を最小限に抑えます慎重に滴下様式で血液混合物を積層することによってまたはピペットを用いて、血液の最適分離するためのインタフェースでngの。 <ol><li>血液混合物をゆっくりと密度勾配の近くにピペットチップを配置することにより、非常にゆっくりとチューブの側面を下に実行するために血液混合物を可能にすることによって、密度勾配の上部を上に層を許可します。 </li><li>実験の規模に応じて、50ミリリットルの濃度勾配の15ミリリットルの上に密度勾配の3ミリリットル（15 mLチューブ内）または血液混合物の層を35mLの上に血液混合物の層を10mL（チューブ）。一般的に、全血10mLのは、いくつかのドナーへのドナーの変動で、千万のPBMCをもたらします。 注：これは、密度勾配と血液混合物のない混合が存在しないことが非常に重要です。血液混合物は、密度勾配を超える層と、すべての血液が密度勾配の上になるまでゆっくりと上昇する必要があります。 </li><li>ブレーキなしで30分間、700×gで層状混合物を遠心分離します。 CENTR血漿、バフィーコート（のPBMCを含む）、密度勾配材料、顆粒球、および赤血球：ifuged混合物は、（上から下へ）5層に分離する必要があります。 </li><li>削除し、プラズマの大部分を破棄し、慎重にパスツールピペットと吸引バルブを使用して、新しい15 mLチューブにバフィーコート（PBMC）コンテンツを取得します。 注：バフィーコート層の除去を効果的に層の外側の周りの円運動を行いながら、チューブに対するピペットの先端で、パスツールピペットで吸引を適用することによって行われます。 </li></ol></li><li>洗浄の間に（フルブレーキで）10分間、350×gで遠心分離することによって単離されたPBMCをpH7.3のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄します。完全RPMI培地中でPBMCペレットを再構成します。ペレットの大きさに応じて、メディアの3-7 mLで十分です。 </li><li>トリパンブルーおよび血球計数器を使用してPBMCを数えます。トリパンブルーで染色されていないこれらの細胞のみをカウントします。 Reconstitut完全RPMI培地中1,750,000細胞/ mLに電子のPBMC。 </li><li> 8チャンバースライドの各ウェルにシード400μL（70万細胞）。 37℃で、完全に加湿した組織培養インキュベーター中でスライドをインキュベート単球/マクロファージが付着できるようにするために1時間（5％CO 2を補充しました）。 </li></ol> 2.付着した単球の前処理注：食作用を阻害または増強する方法を模索している場合、このステップが必要なだけです。 <ol><li>前処理は、関心のある任意の薬剤（複数可）または化合物（複数可）で単球を接着しました。完全RPMI培地を用いて、所望の濃度の薬剤（単数または複数）または他の試験材料を再構成します。 注：例えば、IVIG200μgの/ mLのは、典型的には、ヒト単球を使用した場合、食作用の95％〜100％阻害を得るために使用されます。 </li><li>吸引は（ステップ1.6の後に）1時間のインキュベーションの後、8チャンバースライドから任意の非付着細胞を含む上清を廃棄し。 400と交換してください薬物または他の治療のμL、37℃で1時間インキュベートします。 <ol><li> 8チャンバースライド中の溶液を吸引し、交換するときは、弱く付着した細胞は持ち上げないように、流体の流れを制御するようにしてください。また、一度に2-3空のウェルと協力し、ウェルを乾燥させないようにしてください。 注：典型的には、各処理は、技術的な三連で実施されます。 </li></ol></li></ol> 3. R 2 R 2赤血球のオプソニン化を注：ここで使用されるR 2、R 2は、採血センター（カナダ血液サービス）から取得されますが、彼らはまた、市販されています。オプソニンR 2 R 2 RBCをのFcγR媒介性食作用の陽性対照として使用されています。ナイーブR 2、R 2は、1ヶ月まで4℃で（貯蔵寿命を延ばすために）Alseverの溶液中に保存されるべきです。 Alseverのソリューションは、社内で作られ、0.8で構成されています％/ vのクエン酸三ナトリウム（二水和物）、1.9％W / Vのデキストロース、W 0.42％/ vの塩化ナトリウム、および0.05％W / Vクエン酸（一水和物）wです。 R 2 R 2セルが利用可能でない場合、例えば、R 1、R 2、R 1、R 1、R 1、R、またはR 2、Rのような他のRh表現型細胞を使用することができます。 <ol><li> PBSで洗浄R 2 R 2（CDE / CDE）赤血球5分間、350×gの遠心分離を用いて3回の合計。 注：必要なRBCの量は実験的なサイズに依存し、逆算することができます。赤血球が原因で溶解または上清を除去する際に、各洗浄中に失われているので、常に、RBCの過剰量を洗います。たとえば、5トリートメント、2コントロール、技術的な三重で行われ、すべてを用いた実験では、21ウェルの合計があります。 400μL/ウェルの1.25％RBC混合物との21ウェルは、パックの105μLは、RBCが必要とされるオプソニン化することを示しています。 200 RBCのμLが最初に洗浄する必要がありますし、150＆＃181; Lは、食作用のステップのためのRBCのに十分な量があることを確認するためにオプソニン化する必要があります。 </li><li>ヒト血清から1 V / Vポリクローナル抗D抗体と断続的に混合して、37℃で1時間インキュベートする：1で洗浄し、R 2 R 2ペレットをオプソニン化。 注：ポリクローナル抗D抗体が利用できない場合、市販されているモノクローナル抗D抗体、または血液銀行または輸血から得ることができ、通常のRh免疫予防のために使用された抗Dを使用することが可能ですサービスを提供しています。アッセイを設定するとき、および未力価ポリクローナル抗体の多くを切り替えるたびに、またはモノクローナル抗体への切り替えを最適化試験は、初めに行われるべきです。これは、抗グロブリン試験3+間4+とカウント100単球あたり70から90の間の貪食RBCの食作用の結果の（IAT）結果のために必要な最適濃度または抗Dのボリュームを識別することです。 </li><li>オプソニン化を洗いますDのR 2、R 2、5分ごとに350×gで遠心分離を用いてPBS中で3回の合計。 注：R 2 R 2の成功オプソニン間接IATを実行することによって確認することができます。簡単に言えば、二次ポリクローナル抗ヒト抗体はRBCの表面上の主要なオプソニン抗体を結合するために添加され、増幅された信号は、血球凝集の形で観察することができます。詳細な製造業者のプロトコルは、補足資料ファイルに記載されています。 </li><li> 1.25％v / vの完全RPMI培地を使用する洗浄R 2 R 2ペレットを再構成します。 注：過剰オプソニンR 2、R 2は、一週間まで4℃でAlseverの溶液中で保存することができます。 </li></ol> 4.のFc受容体媒介食作用<ol><li> 8チャンバースライドからの薬物または中上清を吸引除去し、1.25％v / vのR 2 R 2混合物の400μLを追加します。 2時間37℃でインキュベートします。 </li><li>アフトえーインキュベーションの2時間、メーカーのアダプタを使用してチャンバを削除します。ペーパータオルで余分なR 2 R 2をオフに軽くたたきます。スライドが乾燥しないことを確認してください。 </li><li> PBSで100 mLビーカーを埋めます。水没し、ゆっくりと未貪食R 2 R 2の大部分を除去するために、前後（30-40ストローク付近）スライドを移動させることにより、スライドを洗います。 </li><li> PBSからスライドを削除してください。ペーパータオルやティッシュ、空気乾燥スライドを使用して過剰のPBSをオフに軽くたたきます。 </li><li> 45秒間、100％メタノール中で空気乾燥したスライドを修正しました。次に、固定されたスライドを空気乾燥させます。 注：スライドは、グリュンワルド・ギムザ染色21またはライト・ギムザ染色22として、下流の染色のためのより多くの互換性のある別の方法を使用して固定することができます。 </li><li>インハウスメイドELVANOLマウンティング培地（または他の市販の封入剤）を使用してスライドをマウントし、カバースリップを追加します。 注：エルバノール封入剤は経口w / vの15％で構成されていますlyvinylアルコール樹脂、PBS中30％（v / v）のグリセリン。すべての樹脂が溶解するまで混合物を加熱し、グリセリンを均質に混合します。これは、他の市販のマウンティング培地と交換することができます。 </li><li>マウントは定量化する前に一晩乾燥することができます。 </li></ol>貪食の5定量<ol><li>位相差顕微鏡および40Xの対物レンズを使用して、手動で少なくとも200単球およびそれらの単球内の貪食R 2 R 2の数をカウントすることによって食イベントの量を定量化します。同時に、単球の数と貪食R 2 R 2の数を定量化するためにそれぞれの手で1カウンターを持っています。 </li><li>単球数によって貪食R 2 R 2の数を割り、100 Expressの平均（SEM）の平均±標準誤差としてデータ（平均貪食指数）を乗じて平均貪食インデックスを取得します。 </li&gt; </ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

MMAは、組織培養および顕微鏡の両方の専門知識を必要とする面倒な手法です。成功を確実にするには、いくつかの重要なステップがあります：単球、単層の1）の生成は、 RBCの2）オプソニン化、および3）マニュアル定量化。単球の単層は、チャンバースライドに非常に強く付着しないので、生理的pHは、アッセイ11を通じて維持されなければならないとPBMCの十分な数が播種されるべきです。接着した細胞を乱す可能性があり、激しいピペッティングは、避けるべきです。一つのアプローチは常に削除して、チャンバーの同じコーナーからソリューションを追加し、動きがゆっくりと着実であることを保証することです。同様に、過剰な赤血球を除去するための最後の洗浄工程の間に、動きがゆっくりと着実にする必要があります。まだ未貪食RBCの大部分を除去しながらこれは、単層に最小限の妨害を保証します。不十分な洗浄は、手動の資格を行い、混入RBCの高いバックグラウンド、につながりますntification難しいです。第二に、R 2、R 2 RBCが十分に貪食制御のための80から120までの平均貪食インデックスを取得するためにオプソニン化する必要があります。この目的の食作用範囲はカウントのしやすさとのバランスを打つと統計分析のための食作用の十分な量を維持する（ 例えば、5つ以上の単球は、赤血球を正確に定量化することは困難である貪食しました）。オプソニン作用の程度は、IATによって確認することができ、4+ 3+との間の読み取りが必要です。 R 2、R洗浄の間の過剰な溶解があるとき上清は暗赤色に変わったら、または食作用の有意な減少は、ストレージ内の細胞の老化に起因する実験で観察されたときに2個のRBCは、破棄されるべきです。最後に、顕微鏡を使用して手動定量は、実験室の担当者の間や実験間でカウントを比較する場合は特に、注意が必要です。各ウェルに同じフィールドを調べることによって、または単により多くの細胞を計数することによってより一貫性のある数を得ることができます。経験豊富な技術とトレーニング用スライドの指定されたセットを使用したサイド・バイ・サイドのトレーニングが推奨されます。 MMAの主要な批判は、手動の定量化ステップの主観です。しかし、適切な訓練で、一貫性が異なるカウンタ渡って得ることができます。別の制限は、ヒト試料を扱うデータ変動の源である2 R 2表面抗原の発現レベルを、単球食作用能力およびRにおいて内因性のドナーからドナーの違いです。 他の代替技術は、FcγRを媒介食作用を調べるために利用可能です。市販のキットの大部分は、食作用をモニターするための蛍光出力を利用して（ 例えば、生体粒子、pH感受性蛍光タンパク質、またはIgG標識蛍光ラテックスビーズ）。蛍光出力の使用は、より客観的な定量化を提供しますが、1はまた、コンする必要があります可用性、コスト、および蛍光顕微鏡やフローサイトメーターと同様に、市販のキットの際に後続依存の使用に関連するトレーニングサイダー。 最後に、このアッセイは、研究の質問に応じて変更することができます。食作用の薬物阻害をテストする場合、例えば、単球を前処理することができるいずれかまたは薬物およびオプソニン化赤血球（ すなわち、競合アッセイ）の両方と共培養しました。異なるサブタイプ、キメラ抗体、または組換え構築物の抗体の下流のシグナル伝達も試験することができます。普遍的抗原ヌル血液24の開発における最近のブレークスルーでは、MMAは、食作用を誘発における低下効果が実際に存在するかどうかを評価するために様々な抗体を用いたこれらの抗原ヌルRBCの初期画面で利用することができます。

単球単層アッセイ(MMA)は、もともと赤血球に対する自己抗体または同種抗体(RBC)1-5を持つ患者の輸血結果をより良く予測するために開発されたin vitroアッセイです。このin vitroアッセイを用いて、Fcγ受容体(FcγR)媒介性食作用における抗RBC抗体の効果を評価することにより、in vivoでの臨床転帰を予測することが可能です。実際、MMAは、血清学的に不適合な血液の輸血にもかかわらず、抗体結合RBCの免疫破壊を回避するために成功裏に使用されてきました5。適合性試験の典型的な輸血前手順は、クロスマッチングとも呼ばれ、患者の血液のABO抗原とRh抗原のタイピングや、患者内の抗RBC抗体の存在のスクリーニングを含む血清学的方法が含まれます6。ABO/Rhに一致する血液が選択され、抗体が存在する場合は、これらの抗原を避けるために輸血用の血液をさらに選択できるように、抗体の同定が試みられます。理想的なクロスマッチの結果は、すべてのドナーの血液が患者の血液と血清学的に適合する場合に発生し、輸血後の溶血のリスクが軽減されます7。しかし、このシステムは、反復輸血や妊娠によって同種免疫化されるようになった少数の患者グループには不十分です。これらの患者は、特定のRBC抗原に対する同種抗体を産生します。一部の人々は、一般集団で非常に高い頻度の抗原に対する抗体を産生するため、8,9のクロスマッチングが次第に困難になります。複雑さに加えて、すべての同種抗体が臨床的に重要であるわけではありません。言い換えれば、血清学的検査で検出された赤血球への同種抗体の結合は、抗原陽性で不適合な血液を輸血した場合、必ずしも溶血をもたらさない。MMAはもともと、輸血設定1-5における血清学的に不適合な血液の潜在的な臨床的意義を評価するために開発されました。
>jove_content<抗体結合赤血球の血管外溶血は単核食細胞系によって媒介されることが知られているため、初代単球/マクロファージは診断アッセイの開発に利用されます。単球、赤血球、および抗体の相互作用を研究する最初のアッセイは1975年に発表されましたが、使用された最適でない条件はロゼット形成(単球の末梢への赤血球の結合)のみをもたらし、食作用は観察されませんでした10。アッセイに大幅な変更が加えられたいくつかのグループにより、同種抗体結合赤血球の食作用のレベルが溶血1-5の臨床転帰と相関するアッセイが得られた。最近、臨床サンプルの最適な保存条件とアッセイ条件のさらなる最適化が検討され、自家患者サンプル11を用いた臨床MMAクロスマッチの有用性が向上した。
輸血の結果を予測するために、MMAに加えて3つの診断技術が採用されています:51Cr放出試験、ロゼット試験、および化学発光試験（CLT。51Cr放出試験では、患者に51個のCr標識ドナーRBCを注射し、標識したRBCの半減期をモニターし、輸血後の生存またはクリアランスを予測する12,13。この方法は放射性物質を使用するため、もはやほとんど行われていません。ロゼット試験は、単球を赤血球と混合してインキュベートし、ロゼット形成のレベルを定量化することを含む(食作用なし)14。in vivoでの抗体の臨床的意義には、脾臓および/または肝臓に見られるマクロファージによる活発な食作用が含まれます。したがって、この方法では、食作用の適切な読み出しは提供されません。CLTは、ルミノールがファゴソーム15で酸化されると青色に蛍光を発するため、RBCの単球食作用中の酸化バーストをモニターするためにルミノールを使用します。この方法は優れていますが、好中球による汚染により、読み出しが混乱する可能性があります。利用可能な4つの方法の感度、実用性、再現性を評価するために並行比較が行われ、CLTとMMAの両方が上位にランクされました16。しかし、CLTは主に胎児および新生児の溶血性疾患(HDFN)の評価に利用されており、アッセイの最適なpH8.0は食作用のレベルを損なう可能性があります11。
その診断的および臨床的有用性に加えて、MMAは他の研究目的のために変更されました。実際、MMAは、血清学と生物学の不一致に対処するための機能アッセイとして役立つだけでなく、静脈内免疫グロブリン(IVIG)療法後の溶血の原因を遡及的に調査するためにも使用されてきました17。また、FcγR媒介性食作用18-20の化学阻害剤の構造機能を調べるため、およびFcγR媒介性食作用21の下流シグナル伝達を研究するためにも使用されています。当研究室では、ヒトMMAを用いるだけでなく、マウス初代末梢血単核細胞(PBMC)や自家赤血球を用いたマウスMMAを開発しています。理論的根拠は、in vivo 自己免疫性溶血性貧血 (AIHA) マウス モデル (未発表データ) を開発するための中間体として、FcγR 媒介性食作用を誘導できる抗体をスクリーニングすることです。さまざまな修飾は、食作用を誘導するIgG抗体とFcγR相互作用のさまざまな側面に焦点を当てています。

<table><tbody><tr><td>酸性クエン酸デキストロース(ACD)バキュテナーBD</td><td></td><td>REF364606</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td>シ<td>グマ</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>バイオショップ</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>マルチセル&nbsp;</td><td>080150</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-64</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.gelifesciences.com/ リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>8-chamber slides</td><td>Lab-Tek-ll</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>R2R2 (cDE/cDE) 赤血球</td><td>カナダの血液サービス</td><td></td><td>市販の(例えば、http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)</td></tr><tr><td>ポリクローナル抗Dヒト血清ガン</td><td>マバイオロジクス</td><td>DIN 02247724</td><td>市販のモノクローナル抗DまたはRh免疫グロブリン</td></tr><tr><td>100%メタノール</td><td>カレドン</td><td>6700-1-42</td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルアルコール樹脂</td><td>で置き換えることができますシグマ</td><td>P8136</td><td>市販のマウントで代用可能</td></tr><tr><td>UltraPure グリセリン</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>VWR</td><td>48366 067</td><td></td></tr><tr><td>ノバクローン 抗IgG</td><td>Immucorgamma</td><td>5461023</td><td>IAT用オプション (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf)</td></tr></tbody></table>

fcγ受容体媒介食作用を評価するために、単球単層アッセイの使用

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

もともとは血清学的に不適合な血液の輸血結果を予測するために開発されましたが、単球単層アッセイ(MMA)は、研究と臨床の両方の環境で抗体とFcγ受容体(FcγR)を介した食作用のさまざまな側面を調べるために変更できる非常に汎用性の高いin vitroアッセイです。このアッセイは、哺乳類の全血から単離された末梢血単核細胞由来の接着性単球を利用します。MMAは、ヒトとマウスの両方の研究に使用することが説明されています。これらの単球は、免疫応答に関与するFcγR(FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIAなど)を発現します。MMAは、FcγRを介した相互作用、特に食作用のメカニズムを利用しており、抗体感作性赤血球(RBC)がFcγRに付着および/または活性化し、その後単球によって食作用します。インビボでは、主に脾臓や肝臓に見られる組織マクロファージが、抗体オプソニン化赤血球のFcγR媒介性食作用を行い、血管外溶血を引き起こします。MMAを使用して食作用のレベルを評価することにより、in vivo FcγRを介したプロセスのさまざまな側面を調査できます。MMAのアプリケーションには、輸血環境における同種抗体または自己抗体の臨床的関連性の予測、食作用を促進または阻害する候補薬の評価、蛍光顕微鏡法または従来のウェスタン免疫ブロッティングとアッセイを組み合わせてFcγR関与薬または抗体の下流シグナル伝達効果を調査することが含まれます。いくつかの制限には、開始から終了まで丸一日かかるこの技術の骨の折れる作業や、哺乳類の血液を扱うための研究倫理承認の要件が含まれます。しかし、勤勉さと適切なトレーニングにより、MMAの結果は24時間のターンオーバー時間内に取得できます。

図1において非常に重要なステップと上記で概説した手順に従うことで、MMAは再現可能に行うことができます。 IVIGは、 図2の食作用の阻害のための例として使用しました。 IVIGは、このように食作用の下流の結果を阻害し、結合し、Fc受容体をブロックすることが知られています。使用IVIGの量を滴定することにより、用量依存的阻害とは、/ mLの全て（ 図2A）で阻害しなかった/ mLの0.5μgの下の100％に近い抑制および濃度をもたらした200μg以上の濃度、観察されます。食作用指数は、形質転換し、0％阻害、/ mLで決定することができるの3μgのIC 50（ 図2B）での阻害曲線としてR 2 R 2陽性対照に対して標準化されている場合。 一貫してアッセイを実施することに加えて、quantificaアッセイの化は、時には困難な場合があります。 図3は 、様々なMMAスライドの位相差顕微鏡画像のコレクションです。顕微鏡の経験では、1は、混入RBC（ 図3D）、または貪食RBC（ 図3B）からの液胞から単球を区別することができます。細胞および/または破片の密なクラスターは、定量化（ 図3EおよびF）の間に避けるべきです。また、1はオーバーオプソニン化単球の内部をovercrowdsし、正確な定量（ 図3C）に干渉する高め食作用につながるR 2 R 2 RBCを、避けるべきです。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig1.jpg" /> MMAの1模式図を図。 MMAにおける重要なステップのステップバイステップの描写：全血からPBMCを単離し、付着しmonocytを供給オプソニン化R 2、R 2、およびチャンバースライドを洗浄とエス。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig2.jpg" /> 図2静脈内のIgG（IVIG）は、MMAを用いてインビトロで食作用を阻害します。 IVIGは、食作用を阻害することが知られており、人間のMMAにおける阻害対照として使用します。 （A）IVIGの滴定は、未処理のR 2 R 2、対照と比較食作用の用量依存的阻害をもたらしました。結果は、n = 3回の実験の平均（SEM）の平均±標準誤差を示しています。統計分析は、 スチューデントt検定を用いて行った：**P≤0.01及び***P≤0.001。 IC 50 OでIVIGの（B）阻害曲線F 3 / mlの（点線）。結果は、未処理のR 2 R 2（0％阻害）に対して正規化したデータを示します。 n = 3の実験の平均±SEM。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig3.jpg" /> 40X倍率下サンプルスライドの図3の位相差顕微鏡画像。 （A）単球が背景（白矢印）で非常に少数の汚染、非貪食R 2 R 2で、平均（独特のハロー輝きと黒の矢印）に1-2、R 2、R 2を貪食した完璧なスライド。貪食R 2、R 2と間違われることができ、このスライドに示すように、（B）、単球が時々拡大してきた空胞（白矢印）、。 （C &lt;R 2、R 2は、上でオプソニン化されている場合には/）&gt;強い、以上の4-5は、単球あたりR 2 R 2（黒矢印を貪食）R 2、R 2は、単球および別個の細胞内で混雑しているので、難しいカウント正確なレンダリング境界は区別することはできません。 （D）スライドの不十分な洗浄は、付着したRBCと間違われる可能性が豊富で、R 2、R 2汚染（白矢印）、につながります。 （E）場合によっては、単球および夾雑赤血球のクラスターを形成してもよいです。クラスタはまた避けるべきである細菌汚染を示しています。 （F）単球は、定量化の際に避けるべきであるより大きな凝集体を形成することができます。表示するために、フィールドのランダムな選択を使用して、パネルAは、MMAが適正に行われている場合に通常観察されるものです。スケールバーは20μmです。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig3large.jpg" target="_blank">こちらをクリックしてください</a>この図の拡大版を表示します。

単球単層アッセイ(MMA)は、哺乳類の末梢全血から得られた単離された初代単球を利用して、Fcγ受容体(FcγR)を介した食作用を評価するin vitroアッセイです。

Fcγ受容体媒介食作用を評価するために、単球単層アッセイの使用

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

このin vitro機能アッセイの全体的な目標は、FC媒介性食作用のさまざまな側面を評価することです。この方法は、赤血球に対する自己抗体および同種抗体の臨床的意義は何かなど、免疫血液学および輸血医学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術は、赤血球に対する抗体があらかじめ形成されている患者の輸血の結果を予測するためにin vitroで実施できる機能生物学的アッセイを提供します。その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるCindy Tongです。ここで、人間の血液を扱う作業は危険な場合があり、この手順を実行するときは常に保護ガウンや手袋を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。健康なドナーから1〜2個の10ミリリットルの全血サンプルを、静脈穿刺によって酸性クエン酸デキストロースを含むバキュテナーチューブで取得した後、チューブをクラスIIバイオセーフティキャビネットに入れ、血液を温かい完全な培地で1対1の比率で希釈します。次に、層が混ざらないように注意しながら、遠心チューブの側面から室温の密度勾配に血球をゆっくりとピペットで移します。遠心分離により細胞を分離します。次に、上部のプラズマ層を廃棄し、ガラス製のパスツールピペットを使用して、バフィーコートを含むPBMCを新しい15ミリリットルチューブに移します。単離したPBMCをPBSで3回洗浄し、3回目の遠心分離後に細胞を3〜7ミリリットルの培地に再懸濁します。カウント後、細胞を完全な培地で1ミリリットルあたり10〜6番目の細胞濃度の1.75倍に希釈し、400マイクロリットルの細胞を8チャンバースライドの各ウェルに播種して、摂氏37度、最大湿度で5%CO2で1時間のインキュベーションを行います。R2R2赤血球をオプソニン化するには、まずPBSで赤血球を3回洗浄します。3回目の遠心分離後、ヒト血清由来のポリクローナル抗D抗体と1対1の比率でR2R2ペレットを希釈し、摂氏37度で1時間インキュベートし、間欠的に混合します。オプソニン化の最後に、インキュベーターから細胞を取り出し、示したようにPBSでさらに3回洗浄します。ペレットを完全なRPMI培地で1.25%の容量に再懸濁します。次に、8チャンバースライドの各ウェルからの上清を、400マイクロリットルのオプソニン化R2R2細胞と摂氏37度で2時間交換します。インキュベーションの最後に、スライドアダプターを使用してチャンバーを取り外し、余分なR2R2をペーパータオルで軽くたたきます。次に、100ミリリットルのビーカーにPBSを入れ、各スライドを塩溶液に30〜40回ゆっくりと浸して、未食作用のR2R2の大部分を取り除きます。乾燥後、スライドを100%メタノールに45秒間固定し、細胞を乾燥させてから、サンプルをカバースリップでマウントします。翌日、各スライドを40倍対物レンズを備えた位相差顕微鏡にロードし、各手に1つのカウンターを使用して、少なくとも200の単球と各単球内の食作用R2R2の数を手動でカウントし、サンプルあたりの単球数と食作用R2R2細胞の数を同時に定量します。静脈内免疫グロブリンは、用量依存的に食作用を阻害するFC受容体に結合してブロックし、1ミリリットルあたり200マイクログラムの静脈内免疫グロブリン濃度からほぼ100%の阻害が観察され、阻害剤の0.5マイクログラム未満の濃度ではほとんど阻害が観察されませんでした。.食作用指数をR2R2陽性対照に0%阻害として正規化すると、IC 50を3マイクログラム/ミリリットルとする阻害曲線を決定することができる。経験を積むと、位相差顕微鏡を使用して、単球を汚染された赤血球から、また食作用のある赤血球から液胞を区別することができます。R2R2赤血球の定量や過剰オプソニン化の際には、密集した細胞クラスターや破片を避ける必要があります。これは、単球内部を過密にし、正確な食作用分析を妨げる食作用の亢進につながる可能性があります。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば6〜8時間で完了できます。この手順に続いて、共焦点顕微鏡を用いた免疫細胞化学や免疫蛍光などの他の方法を実行して、食作用タンパク質の発現、赤血球の相互作用、および区画化に関する追加の質問に答えることができます。この技術は、初期開発とさらなる最適化により、輸血医学や細胞生物学の分野の研究者がオプソニゼーションシステムを探索する方法に情報を提供します。このビデオを見れば、食作用を引き起こす抗体相互作用の種類を評価するための単球単層アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は、蛍光抗原をコーティングしたビーズと標準化で複数のFc受容体は、提供する受容体の使用量と貪食能の測定を表す単球細胞株を利用し、臨床検体から抗原特異的抗体の食作用活性を決定するためにハイスループットフローサイトメトリーアッセイを提示し、興味のある任意の抗原のための再現可能なファッション。...

臨床抗体サンプルの貪食活性を決定する

出典: Nagre, N. ほか。 マウスにおける肺胞マクロファージの食いと細菌の除去。 J. Vis. Exp.

オプソナイズド赤血球を用いた補体媒介食噬のモデル化

このビデオでは、単球による標識およびオプソニン化された熱帯熱マラリア原虫感染赤血球を含むフローサイトメトリーベースの食作用アッセイを実演しています。フローサイトメトリーは、単球の蛍光を同定し、食作用によるオプソニン化赤血球の同定に成功したことを裏付けています。...

寄生虫感染赤血球の抗体媒介性食作用の定量化のためのアッセイ

このビデオでは、末梢血の初代単球を利用して、ポリD抗体オプソニン化R2R2赤血球によるFcγ受容体媒介性食作用を評価する単球単層アッセイを紹介しています。...

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このビデオでは、間葉系幹細胞(MSC)がエフェクターT細胞の増殖に及ぼす免疫調節効果を調査するためのin vitroアッセイを実演しています。このアッセイには、MSCとPBMCの共培養が含まれ、単球集団が免疫調節表現型を獲得するように誘導し、インターロイキン-10(IL-10)の分泌につながります。活性化されたCD4+...

白血球増殖に対する単球の免疫調節影響を評価するためのIn vitroアッセイ

このビデオは、母乳食細胞による抗体依存性細胞食作用(ADCP)を測定するアッセイを示しています。抗原-抗体複合体に結合した蛍光標識マイクロスフェアを母乳から単離した細胞懸濁液と組み合わせ、食作用性白血球による抗体依存性細胞食作用を誘導します。一般的な白血球抗原(CD45)に対する抗体で細胞を標識すると、フローサイトメトリーを使用して、マイクロスフェア陽性の生存貪食性白血球の蛍光強度を測定し、ADCP活性のレベルを示します。...

食細胞による抗体依存性細胞貪食作用を測定するためのin vitroアッセイ

ここでは、接着性マクロファージ細胞株による蛍光粒子の食作用を蛍光測定法を用いて定量化するプロトコールを紹介します。この方法により、粒子の内在化とそれに伴うアクチン重合のハイスループット定量が容易になります。...

マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術

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ヒト血液中の測定顆粒球と単球食作用および酸化バースト活動

ここでイメージの単一食イベントに回転ディスク共焦点顕微鏡を用いたマウス腹腔マクロファージの方法について述べる。他の貪食細胞に、プロトコルを拡張できます。...

マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

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好中球機能の概要を把握するための一連のスクリーニング技術

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単球マクロファージアッセイを用いた赤血球抗体の意義の予測

学ぶ単球単層アッセイによるFcγ受容体媒介食作用の評価法。ヒト血液由来単球を用いたin vitro機能アッセイで、輸血医学における抗体の臨床的意義を解明し、輸血予測に貢献します。

Fcγ受容体媒介食作用を評価するために、単球単層アッセイの使用

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