Name: の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 学ぶ自動蛍光タイムラプス顕微鏡を用いた枯草菌と肺炎球菌の生細胞イメージング法。単一細胞の分裂・成長過程をリアルタイムで観察し、タンパク質動態と細胞発達を解析する。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

他の多くの単一のセル技術とは対照的に、ここで説明するタイムラプス蛍光顕微鏡法は、その祖先、その動作、および除算イベントに関する特定のセルの履歴をたどるために使用することができます。蛍光標識した標的プロモーターまたはタンパク質と組み合わせることで、特定の発生経路の活性化は、時間とタンパク質の局在ならびにタンパク質のダイナミクスは、細菌の開発時に監視することができるで追跡することができます。 上記に示したように、別の細菌種に集​​中して研究は特定の細菌の要件に応じて増殖条件を適応することによって行うことができます。我々が遭遇した唯一の制限は、成長条件とサンプルサイズに関連しています。密閉された環境のために、培地条件が実験中に変更することはできません。また、実験ごとに4つの系統の最大は、効率的に監視することができます。 いくつかの重要なステップを考えると、ここで説明する単一細胞解析の手法は、容易に自動化された顕微鏡を使用して適用することができます。以下では、これらの重要な手順の概要が与えられます。詳細情報は、メインテキストに記載されて一般的な準備が：それは前の実験への特定の細菌のために必要なオートフォーカスの設定を確認するのが賢明です。可能であれば同様に、蛍光の可視化のためのおおよその最適な設定は、事前に決定されるべきである。また、準備したタイムラインは時間ですぐに使用できるすべての材料を持ってするのに役立つ、以下の（スライド1時間の準備を、顕微鏡の設定をプログラミング、顕微鏡室を事前に温めて細胞は、目的の増殖期になる前に、図1を参照） B.の 。 成長TLMとCDMの枯草菌 ：TLMとCDMが化学的に定義されている飢餓の媒体Bの枯草菌はゆっくりと成長。細胞を培地で栽培される時間期間は、特定の菌株によって延長する必要がある場合があります。低成長がお互いに積み重ねから細胞を防止顕微鏡の試料の調製は：。遺伝子のフレームの間に空気の泡を、スライドガラスとカバーガラスは、アガロースベースの媒体の広範囲な乾燥を防ぐために防止する必要があります。同じことはミディアム/カバースリップのインタフェースにも当てはまります。それは水泳および/ ​​または複数の層の成長を防ぐために、細胞が十分に乾燥させることが重要ですタイムラプス蛍光顕微鏡：。スライドだけでなく、環境室の前の温暖化が主要なオートフォーカスの問題を防ぐために重要である。これらは（サンプルが十分に乾燥させて提供）実験中にフィールドとフォーカスに滞在する最高のチャンスがあるので、細胞は、寒天のパッドの中央に選択する必要があります。実験ごとに10カ所の最大は、まだ正しく動作します。興味のある最初のセルを選択した後のみ（詳細は本文を参照）フォーカスを調整するためのソフトウェアを使用しています。 。細胞は30分間隔での実験分析の最初の数時間中にフォーカス可能かどうかを確認してください：それは媒体の背景が蛍光チャンネルで同じような値を持っているかどうかを事前に拡張された分析手順に確認することが重要です。小さ ​​な塵の粒子が、培地成分、汚れたレンズまたは小型アガロースの塊は、 トラブルシューティングを分析するために映画が困難または不可能に、局所的に増大した蛍光に貢献することができます。細胞は互いの上に成長した場合、これはどちらかのカバースリップがあったことを示すかもしれません早すぎるか、そのメディアが微小コロニー単分子膜の成長に適していない添付。スライド上の他の細胞が喜んで分割するのに対し、関心の細胞は連続して、途中で死亡した場合、あなたは位置にUVフィルターを置くかどうかをチェックすることがあります。また、長時間の実験中に、露光時間や光強度を減少させるために役立つかもしれない。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>遺伝子のフレーム</td><td> ABgene </td><td> AB - 0578 </td><td> 1.7 × 2.8センチメートル</td></tr><tr><td>高解像度の低融点アガロース</td><td>シグマ</td><td> A4718 </td><td></td></tr><tr><td>大きなカバースリップ</td><td>いくつか</td><td></td><td> 24 × 50ミリメートル</td></tr><tr><td>必要に応じて、膜色素、例えば、FM 5から95 </td><td>インビトロジェン</td><td> T23360 </td><td>他の膜の染料も使用可能です。 <a href="http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf">http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf</a> </td></tr><tr><td>環境室とのタイムラプス顕微鏡</td><td>いくつか</td><td></td><td>対応するセクションで我々のデバイスの詳細を参照してください。 </td></tr></tbody></table>

の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

ここ数年の間に科学者は微生物集団ベースの実験から得られた平均的なデータが単一の細胞の挙動、状態や表現型の代表ではないことをますます認識するようになりました。この新しい洞察による単一細胞の研究の数は、（最近のレビューのために1,2,3を参照）継続的に上昇する。しかし、適用される単一のセル技術の多くは、時間のある特定の単一のセル（例えばフローサイトメトリーまたは標準顕微鏡）の開発と動作を監視することはできません。 ここで、我々は多くの世代のための成長と分裂を介して枯草菌と肺炎球菌の個々の細菌細胞を以下のと（の蛍光）を記録できるようにいくつかの最近の研究4、5で使用される顕微鏡法、6、7、の詳細な説明を提供しています。結果として得られる動画は、1つの共通祖先に由​​来する集団内の単一セルの歴史をさかのぼることによって系統学的系統樹を構築するために使用することができます。このタイムラプス蛍光顕微鏡法は、個々の細胞の増殖、分裂と分化を調査するだけでなく、特定の細胞挙動のセルの歴史と祖先の影響を分析するために使用することはできません。また、タイムラプス顕微鏡は、理想的には細菌の細胞周期の間に遺伝子発現のダイナミクスとタンパク質の局在を調べるために適しています。方法は、細菌の細胞を調製し、微小コロニーに単一細胞の伸長を有効にするために顕微鏡スライドを構築する方法を説明します。一言で言えば、単一の細胞は、彼らが成長し、温度制御された環境室内で蛍光顕微鏡下で割っているアガロースを添加した増殖培地から成る半固体表面上にスポットされています。画像は特定の間隔でキャプチャされ、後にオープンソースソフトウェアImageJを用いて解析している。

このプロトコルは、自動化された蛍光タイムラプス顕微鏡を用いて時間の異なる細菌の単セルの動作を監視するためにステップバイステップ手順を提供します。さらに、我々は、顕微鏡画像を分析する方法のガイドラインを提供します。

ここ数年、微生物集団に基づく実験から得られる平均データは、必ずしも実態を反映していないという認識が科学者の間でますます高まっています。

本手順の全体的な目的は、蛍光顕微鏡を用いて生細胞の増殖と分裂をイメージングし、細菌の細胞発達における細胞履歴および系統の影響を研究することです。まず、細胞を比較的栄養濃度の高い液体培地から液体飢餓培地へと移します。次に、細菌細胞がマイクロコロニーへと成長するための顕微鏡スライドを用意します。単層を調製します。次に、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いて動画を撮影します。最後に、動画を処理し、データを解析します。最終的に、タイムラプス蛍光顕微鏡法を用いて、単一の細菌細胞の発育を示す結果を得ることができます。フローサイトメトリーや標準的な顕微鏡法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、タンパク質のダイナミクス、細胞挙動、および単一細胞の発育を時間経過とともにモニタリングできることです。本手順は、私の研究室の博士課程学生であるConeによって実演されます。B. subtilisを調製するために、-80 °C保存ストックから細胞を、必要に応じて抗生物質を添加した10 mLのタイムラプス顕微鏡用（TLM）培地を含む滅菌シェーカーフラスコに接種します。細胞を30 °C、225 RPMの滅菌シェーカーフラスコで一晩培養します。翌朝、細胞を1:10の割合で、抗生物質を含まない予熱済みの化学的に定義された培地（CDM）に希釈します。B. subtilis細胞を対数増殖中期まで培養します。これには約4時間かかります。培養液の600 nmにおける吸光度を測定し、細胞をa 600が約0.035になるように希釈します。CDMを使用します。このOD値により、タイムラプス顕微鏡観察のために、適切な間隔を設けた単一細胞が顕微鏡スライド上にスポットされることが保証されます。細胞が対数増殖の中期に達する1時間前に行います。70% ethanolと水で2枚のガラススライドを洗浄し、顕微鏡スライドを準備します。ジーンフレームからプラスチックカバーの片方を、フレーム反対側のプラスチックカバーを外さないように注意しながら取り除きます。ジーンフレームをガラススライドの一方の端から貼り付け、その後、爪で残りの部分を導くようにして、ガラススライドの中央に固定します。電子レンジを使用して、150 mgの高解像度・低融点アガロースを溶解させます。10 mLのCDM中で、背景蛍光を防ぐためにアガロースが完全に溶解していることを確認してください。温めたアガロースCDM 500 µLをジーンフレームの中央にピペットで滴下し、境界線を含む全領域が完全に覆われていることを確認します。アガロースの過剰な乾燥を防ぐため、迅速に作業を行います。気泡が入らないように注意しながら、Aros CDM充填遺伝子フレームの上に2枚目のガラススライドを載せます。このサンドイッチ構造のものを4°Cで45分間水平に置き、アガロースを十分に凝固させます。アガロースが完全に固まったら、上のガラスを慎重にずらして取り除きます。カミソリの刃を使用して、細菌を増殖させるための幅約5 mmのアガロースストリップを切り出します。1枚のスライドにつき最大3本のストリップを使用でき、それぞれの間隔は約4 mmあけます。これらの隙間は、Bluの増殖に不可欠な空気を提供します。遺伝子フレームから2枚目および最後のプラスチックカバーを慎重に取り除き、粘着面を露出させます。アグロパッドに触れないように注意しながら、パッドの上端から始めて、約2.5 µLの液体中の単一細胞を固形培地上にロードします。ピペットチップを用いて、スライドを上下に傾けながら培地を均等に広げます。ジーンフレームの上に清潔な顕微鏡用カバーガラスを置き、完全に密着させます。細胞のロード後、爪で圧力をかけて固定します。細胞が浮遊したり、多層的に増殖したりするのを防ぐため、液体が十分に乾燥するまで待つことが極めて重要です。しかし、細胞を乾燥させすぎると、マイクロコロニー単層への増殖に支障をきたします。したがって、スライドの乾燥に必要な時間は実験条件によって異なり、一律に測定することはできません。したがって、当然ながらそれに慣れる必要があります。タイムラプス実験の開始後数時間にオートフォーカスの問題が発生するのを防ぐため、タイムラプス顕微鏡観察に備えてスライドを30 °Cで1時間予熱してください。環境チャンバーは少なくとも2時間予熱してください。実験を開始する前に、実験セットアップに応じて適切な対物レンズ、フィルター、ダイクロイックミラーを選択してください。長時間の実験を行う場合は、光源とサンプルの間にUVフィルターが設置されていることを確認してください。また、可能な限り、ニュートラル密度フィルターを用いて励起光の一部を遮断し、露光量を最小限に抑えてください。具体的な実験設定に従って、実験プログラムを設定します。実際の実験に先立ち、特定のコンストラクトに必要な光量や、他のタイムラプス顕微鏡または細菌におけるオートフォーカス設定を決定しておくことが推奨されます。露光時間を短縮し、励起光の強度を下げることで、退色と光毒性を最小限に抑えることができます。オートフォーカス機能には顕微鏡光を使用してください。最後に、準備したスライドを顕微鏡の予熱済み環境チャンバーに設置し、30 °Cで単一細胞からマイクロコロニー単層への増殖を観察します。タイムラプス蛍光実験が成功すると、視野内に完全に収まったマイクロコロニー単層が得られます。この動画の実験の最後では、左側に明視野、右側に蛍光像が表示されています。これは B Subtles のマイクロコロニーの例であり、一部の細胞が重なり合って増殖しているため、それらの履歴を正確に追跡したり、蛍光強度を正しく測定したりすることが困難になっています。このビデオを視聴することで、タイムラプス顕微鏡観察のための微小試料の調製方法と、タイムラプス蛍光顕微鏡観察の実施方法について十分に理解できるはずです。BACE細胞を用いて実験を行ってください。

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