の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

本手順の全体的な目的は、蛍光顕微鏡を用いて生細胞の増殖と分裂をイメージングし、細菌の細胞発達における細胞履歴および系統の影響を研究することです。まず、細胞を比較的栄養濃度の高い液体培地から液体飢餓培地へと移します。次に、細菌細胞がマイクロコロニーへと成長するための顕微鏡スライドを用意します。

単層を調製します。次に、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いて動画を撮影します。最後に、動画を処理し、データを解析します。

最終的に、タイムラプス蛍光顕微鏡法を用いて、単一の細菌細胞の発育を示す結果を得ることができます。フローサイトメトリーや標準的な顕微鏡法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、タンパク質のダイナミクス、細胞挙動、および単一細胞の発育を時間経過とともにモニタリングできることです。本手順は、私の研究室の博士課程学生であるConeによって実演されます。B. subtilisを調製するために、-80 °C保存ストックから細胞を、必要に応じて抗生物質を添加した10 mLのタイムラプス顕微鏡用（TLM）培地を含む滅菌シェーカーフラスコに接種します。細胞を30 °C、225 RPMの滅菌シェーカーフラスコで一晩培養します。翌朝、細胞を1:10の割合で、抗生物質を含まない予熱済みの化学的に定義された培地（CDM）に希釈します。B. subtilis細胞を対数増殖中期まで培養します。これには約4時間かかります。培養液の600 nmにおける吸光度を測定し、細胞をa 600が約0.035になるように希釈します。

CDMを使用します。このOD値により、タイムラプス顕微鏡観察のために、適切な間隔を設けた単一細胞が顕微鏡スライド上にスポットされることが保証されます。細胞が対数増殖の中期に達する1時間前に行います。

70% ethanolと水で2枚のガラススライドを洗浄し、顕微鏡スライドを準備します。ジーンフレームからプラスチックカバーの片方を、フレーム反対側のプラスチックカバーを外さないように注意しながら取り除きます。ジーンフレームをガラススライドの一方の端から貼り付け、その後、爪で残りの部分を導くようにして、ガラススライドの中央に固定します。

電子レンジを使用して、150 mgの高解像度・低融点アガロースを溶解させます。10 mLのCDM中で、背景蛍光を防ぐためにアガロースが完全に溶解していることを確認してください。温めたアガロースCDM 500 µLをジーンフレームの中央にピペットで滴下し、境界線を含む全領域が完全に覆われていることを確認します。

アガロースの過剰な乾燥を防ぐため、迅速に作業を行います。気泡が入らないように注意しながら、Aros CDM充填遺伝子フレームの上に2枚目のガラススライドを載せます。このサンドイッチ構造のものを4°Cで45分間水平に置き、アガロースを十分に凝固させます。

アガロースが完全に固まったら、上のガラスを慎重にずらして取り除きます。カミソリの刃を使用して、細菌を増殖させるための幅約5 mmのアガロースストリップを切り出します。1枚のスライドにつき最大3本のストリップを使用でき、それぞれの間隔は約4 mmあけます。

これらの隙間は、Bluの増殖に不可欠な空気を提供します。遺伝子フレームから2枚目および最後のプラスチックカバーを慎重に取り除き、粘着面を露出させます。アグロパッドに触れないように注意しながら、パッドの上端から始めて、約2.5 µLの液体中の単一細胞を固形培地上にロードします。

ピペットチップを用いて、スライドを上下に傾けながら培地を均等に広げます。ジーンフレームの上に清潔な顕微鏡用カバーガラスを置き、完全に密着させます。細胞のロード後、爪で圧力をかけて固定します。

細胞が浮遊したり、多層的に増殖したりするのを防ぐため、液体が十分に乾燥するまで待つことが極めて重要です。しかし、細胞を乾燥させすぎると、マイクロコロニー単層への増殖に支障をきたします。したがって、スライドの乾燥に必要な時間は実験条件によって異なり、一律に測定することはできません。

したがって、当然ながらそれに慣れる必要があります。タイムラプス実験の開始後数時間にオートフォーカスの問題が発生するのを防ぐため、タイムラプス顕微鏡観察に備えてスライドを30 °Cで1時間予熱してください。環境チャンバーは少なくとも2時間予熱してください。実験を開始する前に、実験セットアップに応じて適切な対物レンズ、フィルター、ダイクロイックミラーを選択してください。

長時間の実験を行う場合は、光源とサンプルの間にUVフィルターが設置されていることを確認してください。また、可能な限り、ニュートラル密度フィルターを用いて励起光の一部を遮断し、露光量を最小限に抑えてください。具体的な実験設定に従って、実験プログラムを設定します。

実際の実験に先立ち、特定のコンストラクトに必要な光量や、他のタイムラプス顕微鏡または細菌におけるオートフォーカス設定を決定しておくことが推奨されます。露光時間を短縮し、励起光の強度を下げることで、退色と光毒性を最小限に抑えることができます。オートフォーカス機能には顕微鏡光を使用してください。最後に、準備したスライドを顕微鏡の予熱済み環境チャンバーに設置し、30 °Cで単一細胞からマイクロコロニー単層への増殖を観察します。

タイムラプス蛍光実験が成功すると、視野内に完全に収まったマイクロコロニー単層が得られます。この動画の実験の最後では、左側に明視野、右側に蛍光像が表示されています。

これは B Subtles のマイクロコロニーの例であり、一部の細胞が重なり合って増殖しているため、それらの履歴を正確に追跡したり、蛍光強度を正しく測定したりすることが困難になっています。このビデオを視聴することで、タイムラプス顕微鏡観察のための微小試料の調製方法と、タイムラプス蛍光顕微鏡観察の実施方法について十分に理解できるはずです。BACE細胞を用いて実験を行ってください。