の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

この手順の全体的な目標は、蛍光顕微鏡を使用して増殖と分裂を通じて生細胞を画像化し、細胞の歴史と祖先が細菌の細胞発生に及ぼす影響を研究できるようにすることです。これは、最初に細胞を比較的高栄養濃度の液体培地から液体飢餓培地に移すことによって達成されます。次に、細菌細胞がマイクロコロニーに成長する微細なスライド

単層を調製します。その後、タイムラプス蛍光顕微鏡動画を撮影します。最後に、ムービーが処理され、データが分析されます。

最終的には、タイムラプス蛍光顕微鏡法により、単一の細菌細胞の発生を示す結果を得ることができます。この技術の主な利点は、フローサイトメトリーや標準的な顕微鏡法などの既存の技術よりも、タンパク質のダイナミクス、細胞の挙動、および単一細胞の発達を時間内に監視できることであり、手順が円錐形になることを実証し、私の研究室の博士課程の学生がマイナス80°Cから細胞を接種する準備をします。 必要に応じて抗生物質を補充した滅菌シェイクフラスコに10ミリリットルのタイムラプス顕微鏡またはTLM培地をストックし、翌朝、滅菌シェイクフラスコで摂氏30度と225RPMで細胞を一晩成長させ、抗生物質を含まないプレウォーム、化学的に定義された培地またはCDMで細胞1〜10を略奪し、ミツバチの最も微妙な細胞を指数関数的な段階の中期まで成長させます。 所要時間は約4時間です。600ナノメートルで培養物の吸光度を測定し、細胞を約600の0.035に希釈します。

CDM を使用します。このODは、細胞間の適切な間隔を持つ単一細胞が、タイムラプス顕微鏡用の顕微鏡スライド上で発見されることを保証します。細胞が指数関数的成長の途中で到達する1時間前。

2つのスライドガラスを70%エタノールと水で洗浄して、顕微鏡スライドを準備します。プラスチックカバーの1つを遺伝子フレームから取り外し、フレームの反対側のプラスチックカバーが分解されないように注意してください。遺伝子フレームをスライドガラスの1つの中央に取り付けます。

電子レンジを使用して、150ミリグラムの高分解能低融点アロを溶解します。10ミリリットルのCDMでは、バックグラウンド蛍光を防ぐために、arosが完全に溶解していることを確認してください。500マイクロリットルの温かいアグロCDMを遺伝子フレームの中央にピペットで固定し、境界を含む全領域が完全に覆われていることを確認します。

アロスの過度の乾燥を防ぐために迅速に作業します。2枚目のスライドガラスをAros CDM充填遺伝子フレームに置き、気泡を避けます。サンドイッチを摂氏4度の水平位置に45分間置き、アグロスが十分に固まるようにします。

アロスが慎重に固まったら、上部のガラスから滑り落ちます。かみそりの刃を使用して、バクテリアが成長する幅約5ミリメートルのアグロストリップを切り取ります。スライドごとに最大3つのストリップを使用でき、両側に約4ミリメートルのスペースを空けて使用できます。

これらのスペースは、Bluの成長に不可欠な空気を提供します。2番目と最後のプラスチックカバーを遺伝子フレームから慎重に取り外して、粘着性のある面を露出させます。アグロスパッドの上部から始めて、単細胞を固体培地に約2.5マイクロリットルの液体に単細胞をロードします。

ピペットの先端で、スライドを上下に傾けて培地が均等に広がるようにします。清潔な顕微鏡カバーを遺伝子フレームに置き、カバースリップを完全に取り付けます。指の爪を使用して圧力をかけますので、セルがロードされた後。

液体が十分に乾くのを待つことが重要であり、細胞が泳いで複数の層で成長しないようにします。しかし、細胞を長時間乾燥させすぎると、マイクロチョロン単層に成長するのに問題が発生します。そのため、スライドの乾燥に必要な時間は実験によって異なり、測定することはできません。

そして、もちろん、タイムラプス実験の最初の数時間でオートフォーカスの問題を防ぐために、スライドを摂氏30度で1時間温めて、タイムラプス顕微鏡の準備をします。環境チャンバーを少なくとも2時間予温します。実験を開始する前に、実験のセットアップに応じて適切な対物レンズフィルターとダイクロイックミラーを選択してください。

長時間の実験では、光源とサンプルの間にUVフィルターが配置されていることを確認してください。さらに、可能であれば、減光フィルターを使用して励起光の一部を遮断し、露出を最小限に抑えます。特定の実験設定に従って実験をプログラムします。

実際の実験の前に、特定のコンストラクトに必要な光の量と、他のタイムラプス顕微鏡やバクテリアのオートフォーカス設定を決定することが賢明です。露光時間が短く、励起光のレベルが低いため、漂白と光毒性が最小限に抑えられます オートフォーカス機能にはスコピックライトを使用してください。最後に、調製したスライドを顕微鏡の予温環境チャンバーに置き、30°Cのマイクロコロニー単層への単一細胞の増殖をモニターします。

タイムラプス蛍光実験が成功すると、視野内に完全に配置されたマイクロコロニー単層が生成されます。このムービーの実験の最後には、左側に明視野があり、蛍光が見られます。右側にあります。

これは、一部の細胞が互いに重なり合って成長したB Subtlesマイクロコロニーの例であり、その歴史を正確に追跡し、蛍光レベルを正しく測定することが困難になっています。このビデオを見れば、タイムラプス顕微鏡用の顕微鏡サンプルをうまく調製する方法と、タイムラプス蛍光顕微鏡法の実施方法について十分に理解できるはずです。BACE細胞で実験します。