遺伝的にコードされたカルシウムのセンサを用いたアポトーシス時のミトコンドリア内カルシウム濃度の動的変更の監視
April 1st, 2011
このプロトコルは、蛍光イメージングによるミトコンドリアのカルシウムフラックスのリアルタイム測定のための方法を説明します。方法は、選択的にミトコンドリアで発現する循環permutated YFPベースのデュアル励起レシオメトリックカルシウムセンサー（レシオメトリックpericam - MT）を利用しています。
この手順の全体的な目標は、生細胞内のミトコンドリアカルシウム濃度の変化を監視することです。これは、トランスフェクションの1日または2日後に、ミトコンドリアマトリックスを標的とするカルシウム指標タンパク質比メトリックペラムで細胞を最初にトランスセクトすることによって達成されます。蛍光顕微鏡とソフトウェアは、生細胞イメージング用に設定されています。
次に、レシオメトリックペラム発現細胞の画像を、カルシウム動員アゴニストを添加して取得します。手順の最後のステップは、取得した画像の定量分析です。最終的には、比率メトリックカルシウム指標タンパク質を発現する生細胞の蛍光顕微鏡法を通じて、ミトコンドリアカルシウム濃度の動的変化を示す結果を得ることができます。
合成カルシウム指標を用いたカルシウムレベルの測定など、既存の方法に対するこの手法の主な利点は、レシオメトリックペラムが遺伝的にコード化されているため、ミトコンドリアやその他の関心のある臓器を標的にできることです。こんにちは、私はDr.Ascar、博士ベニングの研究室のポスドクです、そして私は今日手順をデモンストレーションします 前夜にプロトコルプレートヘロ細胞を開始するには、滅菌ガラスカバースリップへのトランスフェクションを標準的な6ウェル培養プレートに置き、翌日のトランスフェクションに約70%の密度で配置します。翌日、製造元の指示に従って、4マイクログラムのメートル法のペラムミトコンドリア発現ベクターと、トランスフェクトする各ウェルの最適値0.5ミリリットルに希釈した10マイクロリットルの脂肪切除術2000を使用して、DNA脂肪切除術2000複合体を準備します。
次に、各ウェルの D-M-E-M-F-B-S HELOC 培養培地を、抗生物質を含まない 1.5 ミリリットルの同じ培地と交換します。脂肪切除液をDNA溶液に加え、複合体が形成された後に穏やかに混合します。DNA脂肪切除液を各ウェルに滴下し、プレートを穏やかに揺さぶってトランスフェクション混合し、インキュベーション後、摂氏37度、二酸化炭素5%の細胞培養インキュベーターで4時間インキュベートします。
メディアを抗生物質を含むD-M-E-M-F-B-Sと交換します。細胞がメートル法を1〜2日間発現するのを待ってから、鉗子を使用してイメージングします。HELOC細胞の入ったカバースリップを、イメージング溶液の入った適切なイメージングチャンバーに静かに入れます。
イメージングチャンバーを倒立顕微鏡ステージに取り付けます。次に、40 倍以上の油浸対物レンズと波長380ナノメートルを使用します。レシオメトリックを発現する1つ以上の細胞を含む関心領域を見つけるために、ここでは380ナノメートルのペラムを使用して、細胞をレシオメトリックとして識別します。
Peramは、この波長での光退色に対する耐性が低くなります。対象領域を特定したら、495ナノメートルと380ナノメートルの二重励起用にソフトウェアを設定します。次に、495ナノメートルと380ナノメートルで交互に励起することにより、画像を順次取得します。
アゴニストを適用する前に、少なくとも 30 秒間、ベースラインのカルシウム レベルの画像を取得します。次に、カルシウム動員アゴニストを増殖装置を介して適用し、各アゴニストの露光時間および取得間隔の追加時間を最適化して、十分な時間分解能を確保しつつ、光の漂白を防ぐように最適化する必要があることに留意する。実験が完了したら、画像をオフラインで分析できます。
解析を開始するには、フィールドの空白領域内の関心領域を選択し、必要に応じてバックグラウンド蛍光を差し引きます。次に、関心領域から4 95 3 80の比率測定値をExcelまたは同様のグラフ作成ソフトウェアにエクスポートします。この画像のパネルは、比率メトリックperamとミトコンドリアの細胞内局在を示しています。
左側は、ペラム比を発現するヘロ細胞の生細胞画像です。中央は、ミトコンドリアと選択的色素MITトラッカーred CMX Rossの蛍光染色です。そして最後に、右側に示されているマージされた画像は、10マイクロモルのA TPで処理されたミトコンドリアで比メトリックペラムを発現する4つのヘロ細胞の一連の疑似カラー4 95、3 80ナノメートル比の画像であり、これらの前の4つの細胞のミトコンドリアカルシウムレベルの変化の変化の定量化は、ミトコンドリアで比メトリックペラムを発現するヘラ細胞のこの画像に示されています。
個々のミトコンドリアにおけるカルシウム応答の不均一性、およびミトコンドリアの有意な断片化は、0.5マイクロモルの貯蔵スポリン処理の60分間によって明らかです。ミトコンドリアには、白い矢印で示されているカルシウムの振動増加を示すものもあれば、黄色の矢印で示されているカルシウムレベルに大きな変化が見られないものもあります。このグラフは、0.5マイクロモルの貯蔵スポリンを用いて120分間アポトーシスを誘導した後の、単一のhelo細胞における全体的なミトコンドリアカルシウムレベルの変化を示しています。
このビデオを見れば、ミトコンドリアマトリックスを選択的に標的とするカルシウム薬用タンパク質R幾何学的ペラムを使用して、さまざまなtliに応答したミトコンドリアカルシウムレベルの動的変化を測定する方法についてよく理解できるはずです。
概要
このプロトコルは、遺伝子組み換えカルシウム指標であるratiometric pericam-mtを使用して、ミトコンドリアのカルシウムフラックスをリアルタイムで測定する方法を説明しています。この技術により、生きた細胞内のカルシウムレベルの動的なモニタリングが可能となり、ミトコンドリア機能に関する洞察が得られます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 蛍光イメージング
背景
- ミトコンドリアのカルシウムレベルは、細胞の代謝とシグナリングに重要です。
- カルシウムレベルを測定する従来の方法は、合成指標に依存していることがよくあります。
- 遺伝子組み換え指標は、特異性とターゲティングにおいて利点を提供します。
- この研究は、ミトコンドリアのカルシウムダイナミクスの強化されたイメージングのためにratiometric pericam-mtを使用しています。
研究の目的
- 生きた細胞内のミトコンドリアのカルシウム濃度の変化をモニタリングすること。
- ミトコンドリアにターゲット化された遺伝子組み換えカルシウム指標の使用を示すこと。
- ミトコンドリアのカルシウムフラックスのイメージングと分析のための詳細なプロトコルを提供すること。
使用された方法
- ratiometric pericam-mtを用いた細胞のトランスフェクション。
- 蛍光顕微鏡を用いた生きた細胞のイメージング。
- カルシウム測定のための二重波長での連続励起。
- カルシウムダイナミクスを評価するための蛍光イメージの定量分析。
主要な結果
- ミトコンドリアのカルシウムレベルの動的な変化を正常に測定しました。
- 個々のミトコンドリア間でのカルシウム応答の異質性が観察されました。
- 特定の処理下でミトコンドリアの顕著な断片化が認められました。
- 結果はratiometric pericam-mtのリアルタイムイメージングの有効性を示しました。
結論
- このプロトコルは、ミトコンドリアのカルシウムダイナミクスを研究するための信頼性の高い方法を提供します。
- ratiometric pericam-mtのような遺伝子組み換え指標は、イメージング能力を向上させます。
- この技術は、ミトコンドリア機能を調査するために様々な実験条件に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Monitoring mitochondrial calcium dynamics provides critical mechanistic insights into apoptosis pathways, enabling target validation in cell death mechanisms. This genetically encoded sensor approach supports predictive confidence in preclinical models by quantifying organelle-specific calcium fluxes with temporal resolution. The method facilitates early de-risking of therapeutic hypotheses involving mitochondrial dysfunction in disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mitochondrial calcium as a regulator of apoptotic pathways for target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides organelle-specific readouts that reduce ambiguity in mechanistic studies of cell death.
- Predictive Value: Supports functional validation of targets involved in calcium-mediated apoptosis through real-time flux measurements.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative ratiometric data enabling dose-response analysis of compounds affecting mitochondrial calcium.
- Operational Value: Compatible with standard wide-field microscopy, allowing integration into existing imaging platforms without specialized equipment.
- Scalability Value: Enables longitudinal tracking of calcium dynamics and mitochondrial morphology in live cells over hours.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links mitochondrial calcium changes to apoptotic outcomes, supporting biomarker relevance in disease models.
- Operational Value: Demonstrates utility with both ATP (physiological agonist) and staurosporine (apoptosis inducer), broadening applicability across experimental conditions.
- Translational Continuity: Facilitates progression from mechanism discovery to preclinical validation by providing dynamic, physiologically relevant readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through mechanistic de-risking to preclinical assessment by providing dynamic, quantifiable data on mitochondrial function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of calcium-dependent apoptotic pathways through real-time mitochondrial flux measurements.
- Screening: Enables assay-ready systems with standardized, reproducible calcium readouts for compound screening campaigns.
- Analytics: Delivers quantitative ratiometric outputs (495nm/380nm excitation ratio) that allow statistical comparison of calcium dynamics across conditions.
- Translational Research: Connects mitochondrial calcium changes to apoptotic phenotypes, supporting continuity from mechanism to phenotypic outcome.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for studying mitochondrial dysfunction across multiple disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in apoptosis pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility through genetically encoded, organelle-targeted indicators that avoid dye leakage and artifacts.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative insights into mitochondrial mechanisms of compound action.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on mitochondrial calcium modulation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology for transfection and live-cell imaging.
- Dependent on fluorescence microscopy with dual-excitation capability (380nm and 495nm) and standard filter sets.
- Necessitates standardization of image acquisition protocols and region-of-interest analysis across teams.
- Adaptation considerations include mitochondrial targeting efficiency and potential overexpression artifacts in different cell models.
- Practical limitations include photobleaching risks during long-term imaging and need for optimization of agonist exposure intervals.
