ヒト神経幹細胞を数える
August 22nd, 2007
生存細胞の正確な数の知識は、多くの組織培養の操作が必要です。このプロトコルは、生細胞と死細胞を区別し、血球計算盤を用いて細胞を定量化する方法について説明します。それはヒト神経幹/前駆細胞（hNSPCsを）数えて説明していますが、それは他の細胞型に使用することができます。
次に、ヒトの神経前駆細胞を数える方法をお見せしますが、免疫化学のために細胞を入れたいときや、核因子マシンでトランスフェクションを行いたいときには、細胞を数えることができます。私は、エッジグリッドを持つ位相差ヘモサイトメーターを使用し、また、トリップとブルーと呼ばれる染料を使用しています。また、この色素は、生細胞と死細胞を区別できるという点で有用です。
死んだ細胞または死にかけている細胞がこの色素を取り込み、青色に見えます。血液中の細胞を見ると、サイトメーターと生細胞はこの色素を除外することができ、彼らは、彼らは、青く見えません。そうすれば、トリップとブルーとメディアの溶液を調製するための細胞の生存率を判断できます。
この0.5ミルのエピチューブに20マイクロリットルのトラップと青い溶液を追加します。そして、25マイクロリットルのメディアを追加します。そうすれば、今は45マイクロリットルのトラップパンブルーとメディア溶液があり、5マイクロリットルの細胞懸濁液を追加すると、1〜10
希釈になります。そして今、私は5マイクロリットルの細胞懸濁液を追加するつもりです。まず、指のボルテックスによって細胞が十分に再懸濁されていることを確認します。だから今、私はこの解決策がうまく混合されていることを確認したいと思います。
だから、ベッドを何度か上下に寝かせます。そして最後に、この細胞懸濁液の約12マイクロリットルをヘモサイトメーターにロードします。それは、2つのポートを持っており、あなたはすることができます、あなたはどちらかを使用することができます。
したがって、あなたがしなければならないのは、このポートに溶液を導入することだけで、液体は毛細管現象によって吸い上げられます。そして今、私は数える準備ができています。ここでは、10 xのヘモサイトメーターを見て、16の正方形を含む象限があります。
そして、ご覧の通り、ここでは生きた細胞と死んだ細胞を観察することができます。ここには、これとこれとこれのような生きた細胞があります。また、このような死んだ細胞もあります。
気づいたら、死んだ細胞は濃い青で見えますが、生きた細胞の周りには雹のようなものがあります。それでは、すべての生細胞を数えます。だから私は左から右へ、上から下へ行きます。
1、2、3、4、5、6、33、1 32、33、34、3 5、3 6。したがって、この象限には合計 3 つの 6 セルがあります。したがって、象限の境界線上にあるセル、たとえばこの線に沿っているセルが一貫性を保つために、左の境界線と上部の境界線にあるセルをカウントします。
そして、私は一貫して、ヘモサイトメーターのすべての象限について、その境界上の細胞をカウントしています。それでは、マイクロリットルあたりの細胞数を計算します。そのために、象限あたりの細胞数の平均値(38)に10を掛けます。これはチャンバーの寸法によって決まる要素です。
また、この場合の希釈係数である10を掛けます。そして最終的には、マイクロリットルあたりの細胞数を取得します。したがって、この場合、マイクロリットルあたり3, 800個の細胞があります。
また、セルパレットを500マイクロリットルの溶液に吊り下げたため、合計でセル数を計算できます。そして、私たちはすべて準備ができています。
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概要
このプロトコルは、ヘマサイトメーターを使用してヒトの神経幹/前駆細胞（hNSPCs）を数える方法を概説しています。さまざまな組織培養応用のために生きている細胞と死んだ細胞を区別することの重要性を強調しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 組織培養
背景
- 生存細胞数は組織培養操作にとって重要です。
- 生きている細胞は特定の染料を除外できますが、死んだ細胞は除外できません。
- ヘマサイトメーターは細胞数を数えるための標準的なツールです。
- Trippanブルー染料は細胞の生存能力を評価するために一般的に使用されます。
研究の目的
- hNSPCsを数えるための信頼できる方法を提供すること。
- 生きている細胞と死んだ細胞を効果的に区別すること。
- 免疫化学やトランスフェクションなどのさらなる実験の準備を研究者に支援すること。
使用される方法
- 位相差ヘマサイトメーターの使用。
- 細胞の生存能力を区別するためにTrippanブルー染料の適用。
- 顕微鏡下での細胞の数え方。
- Trippanブルーと培地の溶液の調製。
主な結果
- 生きている細胞と死んだ細胞の成功した区別。
- hNSPCsの正確な定量化。
- Trippanブルー染料の有効性の実証。
- ヘマサイトメーターの信頼できる数え方の検証。
結論
- このプロトコルは細胞数え方の簡単なアプローチを提供します。
- hNSPCs以外にもさまざまな細胞タイプに適用可能です。
- 細胞の生存能力を理解することは、成功した組織培養実験にとって不可欠です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of viable human neural stem/precursor cells (hNSPCs) is essential for reproducible tissue culture workflows in neuroscience drug discovery. This protocol enables reliable cell viability assessment and concentration measurement, supporting consistent experimental seeding for downstream applications such as immunocytochemistry and transfection. By standardizing live/dead discrimination using Trypan blue and hemacytometer-based counting, the method enhances predictive confidence in early-stage target validation and assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise seeding of hNSPCs for target engagement and pathway modulation studies.
- Operational Value: Reduces variability in cell-based assays by ensuring consistent input of viable cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative, reproducible cell concentration data critical for assay standardization.
- Operational Value: Supports scalable preparation of cell suspensions for high-content screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains cellular input consistency across discovery-to-preclinical transition stages.
- Operational Value: Facilitates cross-functional collaboration through standardized cell counting practices.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, supporting reliable cell preparation from target validation through assay optimization and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Ensures accurate cell dosing for target validation experiments involving hNSPCs.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable cell inputs necessary for reproducible assay performance.
- Analytics: Generates viable cell concentration and total count outputs used to normalize experimental conditions.
- Translational Research: Supports continuity in cell handling between in vitro discovery and preclinical models.
- Enterprise Reuse: Represents a transferable, low-complexity capability applicable across multiple cell types and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence by minimizing variability in cell-based experimental inputs.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories and teams.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions through reliable assay foundations.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by ensuring data quality in early efficacy screening.
Implementation Considerations
- Requires basic tissue culture technique and microscopy proficiency.
- Dependent on hemacytometer availability and proper cleaning to avoid contamination.
- Necessitates consistent operator training for unbiased quadrant selection and border-counting rules.
- Limited by manual counting throughput; not suited for high-throughput automation without adaptation.
- Relies on correct dilution and mixing to ensure representative sampling of cell suspension.
