Name: ヒト神経幹細胞を数える (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 学ぶヒト神経幹細胞の計数法。ヘマサイトメーターとトリパンブルー染色を用いて生存細胞と死細胞を区別し、組織培養実験のための正確な細胞数を算出する方法です。

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著者らは、子供の病院、hNSPC文化を提供するためのオレンジカウンティ研究所で国立ヒト神経幹細胞資源の博士フィリップH.シュワルツ氏に感謝します。

ヒト神経幹細胞を継代 注 ：を参照してください<a href="/index/details.stp?ID=263">継代ヒト神経幹細胞の</a> 細胞をデタッチして再懸濁させる方法についての記事。 https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 カウントのために細胞懸濁液を準備する<ol><li> 0.4％トリパンブルー溶液を、エッペンドルフチュー​​ブに細胞培地の20μlの代わりに25μlの。 </li><li>優しく均一な懸濁液を作成するためにメディアの知られているボリュームで細胞を含むチューブをタップしてカウントされる細胞を再懸濁します。前のステップからエッペンドルフチュー​​ブに細胞を5μlを置きます。このステップでは、10倍の細胞の濃度を希釈する。 </li><li>血球計算盤にカバーガラスを置き、細胞懸濁液11〜12μlを約読み込みます。 <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_4/262_Figure-01.png" alt="262_Figure - 01" width="511" height="139"> </li></ol>血球計算盤で細胞をカウントする<ol><li>位相差顕微鏡で血球計のグリッド全体を観察。グリッドの一象限（赤などのものなど）に焦点を当てる。 <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_5/262_Figure-02.png" alt="262_Figure - 02" width="492" height="278"> </li><li>その膜が損傷し、トリパンブルー色素を除外することができないされているため、死または死細胞は青色表示されます。生細胞は青色表示されず、位相コントラストの光の"ハロ"（"フェーズ明るい"となる）で囲まれます。 </li><li>つの象限（領域1 mm 2）の中の生存細胞数を数える。また、セルの合計数によって生存細胞の数を割ることによって細胞の生存率を決定することができます。 3月4日ランダム象限で細胞をカウントし、象限当たりの細胞の平均数を決定します。象限のボリュームが10 -4 mlまたは0.1μLであることが知られているので、細胞の濃度を決定することができます。 <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_6/262_Figure-03.png" alt="262_Figure - 03" width="741" height="165"> </li><li>あなたは、＃細胞/μlを決定するために次のショートカットを使用することができます。 <img src="/files/ftp_upload/old/262_2008_7_18_7/262_Figure-04.png" alt="262_Figure - 04" width="368" height="69"> チューブの＃チューブ内のセルの合計=＃細胞/μlのXμL </li></ol>

<ol><li>Marchenko, S., Flanagan, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 7, 
 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263</a> (2007).</li>
<li>Caprette, D. avidR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+Hemacytometer%5BTitle%5D)+AND+%22BioEd+Online%22%5BJournal%5D)">Using a Hemacytometer.</a> BioEd Online. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3">http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3</a> (2008).</li>
<li>Caprette, D. avidR. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+Chamber+%28Hemacytometer%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioEd+Online%22%5BJournal%5D)">Counting Chamber (Hemacytometer).</a> BioEd Online. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2
">http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2
</a> (2008).</li>
</ol>

このプロトコルは、細胞を伴う実験の様々な細胞濃度を決定するために簡単かつ迅速な方法を説明します。 3Dで説明されているショートカットを使用して、一つは迅速かつ正確に細胞濃度と指定されたボリュームの総細胞数を決定することができます。

<table><tbody><tr><td>位相差血球計数器</td><td>器具</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td>記載のカタログ番号でFisherより販売</td></tr><tr><td>トリパンブルー染色液 0.4%</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>記載のカタログ番号でInvitrogenより販売</td></tr></tbody></table>

ヒト神経幹細胞を数える

Counting Human Neural Stem Cells

細胞懸濁液の所定量中の生細胞の正確な数の知識は、このような免疫細胞または細胞のトランスフェクションに用いる細胞を播き、多くの日常的な組織培養の操作、が必要です。このプロトコルは、生細胞と死細胞を区別し、細胞濃度と血球計を用いて全細胞数を定量化するための簡単​​かつ迅速な方法を説明します。この手順は、最初の成長表面から細胞をデタッチし、メディアでそれらを再懸濁する必要があります。次に、細胞をトリパンブルー（理想的には象限当たり20から50まで細胞を与える濃度まで）の溶液で希釈し、血球計算盤に配置されます。最後に、1つの1 MM 2象限（0.1μL）および希釈係数を掛けるの体積で平均を割って、いくつかのランダムに選ばれた象限に生存細胞の数を平均化L.当たりのセル数を与える液中の総体積でこの細胞濃度を掛け合わせると総細胞数を与えます。このプロトコルは、ヒト神経幹/前駆細胞（hNSPCsを）数えて説明するだけでなく、他の多くの細胞種に使用することができます。

生存細胞の正確な数の知識は、多くの組織培養の操作が必要です。このプロトコルは、生細胞と死細胞を区別し、血球計算盤を用いて細胞を定量化する方法について説明します。それはヒト神経幹/前駆細胞（hNSPCsを）数えて説明していますが、それは他の細胞型に使用することができます。

細胞懸濁液の一定量に含まれる生存細胞の正確な数を把握することは、以下のような多くの日常的な組織培養操作において不可欠です。

ここでは、ヒト神経前駆細胞の計数方法について説明します。細胞を免疫化学染色の段階に移行させる際や、核因子機序を用いたトランスフェクションを行う際に計数を行います。ここでは、エッジグリッドを備えた位相差ヘモサイトメーターと、トリパンブルーという染料を使用します。この染料は、生存細胞と死細胞を区別できるため非常に有用です。死細胞または死にゆく細胞はこの染料を取り込み、青色に染まります。ヘモサイトメーターで細胞を観察すると、生存細胞はこの染料を排除できるため、青色には染まりません。これにより、細胞の生存率を決定できます。トリパンブルーと培地の混合溶液を調製します。この0.5 mLのエピチューブに、20 µLのトリパンブルー溶液を加えます。次に、25 µLの培地を加えます。これにより、現在はトリパンブルーと培地の混合液が45 µLあり、ここに5 µLの細胞懸濁液を加えることで、10倍希釈（1:10希釈）となります。それでは、5 µLの細胞懸濁液を添加します。まず、フィンガーボルテックスを用いて細胞が十分に再懸濁されているか確認します。この溶液がよく混合されていることを確認してください。そこで、ベッドを数回上下させます。最後に、この細胞懸濁液を約 12 µL、血球計数器に注入します。これには2つのポートがあり、どちらを使用しても構いません。したがって、このポートから溶液を導入するだけで、毛細管現象によって液体が吸い上げられます。これでカウントの準備が整いました。10倍の倍率でヘモサイトメーターを確認します。ここには16個の正方形を含む区画があります。ご覧の通り、ここでは生存細胞と死細胞を観察することができます。こちらにある、これやこれ、そしてこれらが生存細胞です。また、こちらの細胞のように、いくつかの死細胞も見られます。お気づきの通り、死細胞は濃い青色に見えますが、生細胞の周囲にはハロー（光輪）のようなものが見えます。それでは、ここからすべての生細胞をカウントします。左から右へ、そして上から下へと数えていきます。1、2、3、4、5、6、33、1 32、33、34、3 5、3 6。したがって、この象限には合計で36個の細胞があります。この線のような象限の境界線上にある細胞がある場合、一貫性を保つため、左側の境界および上側の境界にある細胞をカウントします。そして、ヘモサイトメーターのすべての区画において、境界線上の細胞を一貫してカウントします。それでは、1 µLあたりの細胞数を算出します。そのために、1区画あたりの細胞数の平均値である38に、チャンバーの寸法によって決定される係数である10を掛けます。さらに、今回の希釈倍率である10を掛けます。最終的に、1 µLあたりの細胞数が得られます。したがって、この場合は 3,800 cells/µL となります。また、細胞ペレット

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

細胞内に目的の遺伝子を導入することは生体内でその機能を解明するための強力な方法です。このプロトコルは、AmaxaによるNucleofectorエレクトロポレーション装置を用いてヒト神経幹/前駆細胞（hNSPCs）の文化をトランスフェクションの効率的な方法を説明します。...

Amaxa Nucleofectorでヒト神経幹細胞をトランスフェクト

ヒト神経幹細胞を継代

免疫細胞が存在、細胞内局在性、および培養細胞における目的の抗原の相対量を決定する強力な方法です。このプロトコルは1つの抗体を節約し、自分の染色を最大限に活用することを可能にする手順のわかりやすいシリーズを紹介。...

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大人の齧歯類の脳の従来の従来にない地域から神経幹細胞を増殖させる

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ヒト神経の集合体のためのcGMP適用可能な展開法は、幹細胞および前駆細胞は、多能性幹細胞や胎児の脳組織由来

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三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

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成体ラットおよびヒト脊髄の脳室周囲領域から神経幹/前駆細胞の単離

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ヒト神経幹細胞を数える

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