Name: ヒト神経幹細胞を継代 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学ぶヒト神経前駆細胞の継代培養法。フィブロネクチンコーティングと細胞解離バッファーを用いた標準化されたプロトコルで、神経発生研究と再生医療への応用可能性を探求します。

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作者は感謝して子供の病院、その培養にhNSPCsと初期命令を提供するためのオレンジカウンティ研究所の国立ヒト神経幹細胞資源の博士フィリップH.シュワルツを認めます。

注 ：週に一度私たちのhNSPCsのルーチン培養するために、我々は一日おきに、通常は通過して1時02分メディアの50〜100％に変更。 F12ベースのメ​​ディア：文化メディアは20％のBIT - 9500 DMEMで、1X抗生物質/抗真菌剤、および成長因子（EGF、FGF、およびPDGF 40 ng / mlの時それぞれ）が含まれています。 コー​​トフラスコを準備し、セルの関連付け解除<ol><li> 37℃の組織培養インキュベーターで、継代細胞のために新しいフラスコを準備するには、EMEMで10μg/ mlのヒトフィブロネクチンでコーティングT25フラスコに4時間、または一晩。右の細胞を継代する前に、フィブロネクチン溶液を除去し、PBSでフラスコを洗う。 </li><li>新しいフィブロネクチンでコートフラスコ（各フラスコのためのメディアの半分最後のボリュームが&quot;エアコン&quot;メディアとなるよう）に継代する細胞から古い&quot;エアコン&quot;メディアを転送します。これらの培養条件は、その未分化状態でこれらの細胞を保つのを助ける。 </li><li>一度にすべてのメディアの継代する細胞から削除され、PBSで細胞を1回すすいでください。細胞を乾燥しないように注意してください。 </li><li>直接細胞（T25フラスコ用1.0〜1.5ミリリットル）に細胞解離バッファー（CDB）を追加します。室温で約5分間、バッファーで細胞をインキュベート。静かにフラスコをタップすると細胞剥離をスピードアップに役立ちます。 </li></ol> 、遠心分離し再懸濁し、そしてめっきセル<ol><li>剥がれた細胞をフラスコに（CDBの〜3倍のボリュームを使用）：血清含有培地を（F12 10と％熱不活化ウシ胎児血清DMEM）を追加します。 15 mlコニカルチューブにメディアとセルを削除する。フラスコを洗浄し、残りの細胞を回収するために新鮮な血清含有培地の小さなボリュームを使用してください。 </li><li> 5分間で1000rpm（〜200xg）でメディアと細胞を遠心分離します。 </li><li>血清含有培地オフ吸引し、均一な細胞懸濁液を作るためにピペッティングし、新鮮培地で細胞を懸濁します。 </li><li> 1：02分割のそれぞれの新しいフラスコに再懸濁した細胞の半分を譲渡する。フラスコの新しい道の番号に注意してください。 </li></ol>

<ol><li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).</li>
<li>Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Stem+Cell+Manual%3A+A+Laboratory+Guide%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell culture.</a> Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).</li>
<li>Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture.+Progenitor+cells+from+human+brain+after+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture. Progenitor cells from human brain after death.</a> Nature. 411, 42-43 (2001).</li>
<li>Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+neural+progenitor+cells+from+post-mortem+human+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex.</a> J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).</li>
</ol>

我々は、このプロトコルはhNSPCsの信頼性の高い文化を提供することを見出した。我々の細胞の一つの重要な要因は、彼らはかなり密培養物として維持されると細胞が疎であることがポイントに継代することができる必要があるということです。私たちの手では、疎な文化は非常にゆっくりと成長または完全に分割することを中止。文化は非常に密集しているときにこのような理由から、我々は、通常私たちの文化、1:2または1:3分割。それが良い細胞の接着および遊走を促進する、しかし、ラミニンとは異なり、それはまた、細胞を分離するために細胞解離バッファー（CDB）の使用を許可するので、フィブロネクチンと培養皿のコーティング面は重要です。ラミニンへの細胞接着が強すぎると細胞剥離のためのタンパク質分解酵素（例えばトリプシン）を使用する必要があります。非酵素的CDBは、細胞表面タンパク質のタンパク質分解的切断は、時間をかけhNSPCsの形態学的変化を引き起こすことがあるため、トリプシンが好ましい。また、馴化培地で培養hNSCPsは、その未分化状態でこれらの細胞を維持するのに役立ちます。

<table><tbody><tr><td>BIT-9500 (BSA, インスリン, トランスフェリン)</td><td>試薬</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>09500</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌剤</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12 (1X)</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>EMEM (1X)</td><td>試薬</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>MT-10-010-CV</td><td>指定のカタログ番号でFisherから販売</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>FGF, ヒト基本リコンビナント</td><td>試薬</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AB</td><td>試薬</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-00AB</td><td></td></tr><tr><td>EGF, ヒトリコンビナント</td><td>試薬</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40052</td><td>指定のカタログ番号でFisherから販売</td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ, 25 cm2</td><td>器具</td><td>Corning</td><td>10-126-28</td><td>指定のカタログ番号でFisherから販売</td></tr><tr><td>フィブロネクチン, ヒト, 天然</td><td>試薬</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40008A</td><td>指定のカタログ番号でFisherから販売</td></tr><tr><td>ヒト神経幹細胞/前駆細胞</td><td>細胞</td><td>National Human Neural Stem Cell Resource</td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞解離バッファー</td><td>試薬</td><td>Invitrogen</td><td>13150-016</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト神経幹細胞を継代

Passaging Human Neural Stem Cells

in vitroでのヒト神経幹/前駆細胞（hNSPCs）を操作する能力は、治療目的のための細胞移植としてのユーティリティを調査するだけでなく、人間の神経発生と病理学の多くの基本的なプロセスを探索する手段を提供します。このプロトコルは、この手法を標準化し、ヒト幹細胞研究の再現性を高めることを望んで培養し、継代hNSPCsの簡単な方法を提示。我々が使用するhNSPCsは国立ヒト神経幹細胞資源で死体生後脳の皮質から単離し、フィブロネクチン（パーマーら、2001;シュワルツら、2003。）でコーティングしたフラスコ上に付着培養物として増殖させた。 DMEMで我々の文化は私たちのhNSPCs：F12無血清培地はEGF、FGF、およびPDGFを補充し、通過それらの1時02分、約7日ごと。これらの条件を使用して、培養中の細胞の大半は、バイポーラの形態を維持し、未分化な神経幹細胞（そのようなネスチンとSox2など）のマーカーを発現する。

in vitroでのヒト神経幹/前駆細胞（hNSPCs）を操作する能力は、治療目的のための細胞移植としてのユーティリティを調査し、人間の神経発生を探索することができます。このプロトコルは、ヒト幹細胞研究の増加再現性を期待して培養し、継代hNSPCsの方法を提示。

ヒト神経幹細胞/前駆細胞（hNSPCs）をin vitroで操作できる能力は、...への細胞移植としての有用性を検討するための手段を提供します。

こんにちは、スティーブです。カリフォルニア大学アーバイン校病理学部のFlanagan博士の研究室に所属しています。本日は、ヒト神経前駆細胞の継代方法（スプリット）について説明します。この手法では、まず新しいフラスコをヒトフィブロネクチン溶液でコーティングし、細胞解離バッファーを用いて細胞を剥離させます。次に、10%血清溶液で細胞解離バッファーを中和し、細胞懸濁液を遠心分離した後、新鮮な培地で細胞を再懸濁させ、その細胞懸濁液を新しいフラスコに移します。当研究室では、ヒト神経前駆細胞の培地を1日おきに半分交換して培養し、1対2に分散させて約1週間に1回継代しています。細胞を継代する際、免疫化学実験に使用する場合や、核エフェクターを用いてトランスフェクションを行う場合は、細胞数をカウントすることがあります。細胞を回収する際は、細胞解離バッファーを使用することが重要です。なぜなら、トリプシンとは異なり非酵素的であり、細胞への負荷が格段に少ないためです。現在、組織培養室にいます。コンフルエントになったヒト前駆細胞のフラスコの様子をお見せする前に、まず組織培養の準備を行います。まず、UVライトを消し、照明とエアフローをオンにします。次に、ペーパータオルに70% ethanolをスプレーしてフード内を拭き上げ、フードを消毒します。70% ethanolをフード内に直接スプレーすると、非常に高価なHEPAフィルターを損傷させる可能性があるため、必ずペーパータオルにスプレーして使用することが重要です。続いて、すべての試薬と器具にスプレーを行います。最後に、真空ホースをスプレーすれば準備完了です。それでは、これらの細胞を確認しましょう。これらの細胞は、コンフルエンシーが約80%の状態に見えます。これらはヒト胎児から単離されたヒト神経前駆細胞であり、T 25フラスコで培養しています。1週間に1回から2回の頻度で継代（分割）を行います。それでは、細胞の継代準備を始めます。まず、BD biosciences社製のヒトフィブロネクチンで4時間コーティングした新しいT 25フラスコを用意します。フィブロネクチン溶液を除去した後、細胞をフラスコに移す前に、このフラスコをBBSで洗浄します。それでは、37°Cのインキュベーターから細胞を取り出します。こちらです。次に、ヒトフィブロネクチンでコーティングした新しいフラスコから、PBS洗浄液を除去します。そして、2 mLの古い調整培地を新しいフラスコに加えます。次に、細胞を表面から回収する前に、PBSで洗浄する必要があります。まず、残っている培地を除去し、細胞が乾燥しないよう、すぐに約2 mLのPBSを加えます。PBSを除去し、フラスコの表面から細胞を剥離させるために細胞解離バッファーを加えるまで、約2分間待ちます。それでは、PBSを除去します。細胞が乾燥しないよう、すぐに細胞解離バッファーを加えます。細胞解離バッファーを1.5 mL加えます。PBSとは異なり、これを細胞に直接添加し、可能な限り広い面積をカバーするようにします。そのため、バッファーをゆっくりと細胞に添加しながら、フラスコを左右に動かします。そして、細胞が表面から剥がれ始めるまで、約5分間待ちます。そして、フラスコをフード内の室温に置いておきます。ここで見てわかるように、細胞がまず円形になり始め、その後、表面から剥がれ始めます。実際、すでにいくつかの細胞が浮遊しているのが見えます。フラスコの側面を軽く叩くと、細胞の剥離を促進させることができます。5分が経過しました。ご覧の通り、表面から剥離した細胞によって溶液が非常に濃くなっています。ここで、4.5 mLの血清含有培地を加えて、細胞解離バッファーの効果を中和します。10%熱不活化胎児牛血清を含むDMEM/F12培地を用い、細胞の脱離漏れがないよう、フラスコの表面に直接添加します。次に、ピペッティングをゆっくりと行い、残っている細胞をすべて剥がします。その後、細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移し、1,000 RPMで1分間遠心分離します。細胞の遠心分離が完了し、ここに良好な細胞ペレットが得られました。ペレットを乱さないよう、非常に慎重に血清含有培地を除去します。その後、4 mLの培地でペレットを再懸濁します。次に、細胞の凝集塊が残らず溶液が均質になるまで、ペレットを再懸濁させます。今回は1:2で継代するため、4 mLのうち2 mLを、あらかじめ2 mLの条件培地が入っている新しいフラスコに移します。最後に、フラスコに細胞種、継代数、および日付を記載します。これは30分前に継代した細胞の様子です。見ての通り、ほとんどの細胞が表面に接着し、突起を伸ばし始めています。以上で終了です。それでは、計数を行います。

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

細胞内に目的の遺伝子を導入することは生体内でその機能を解明するための強力な方法です。このプロトコルは、AmaxaによるNucleofectorエレクトロポレーション装置を用いてヒト神経幹/前駆細胞（hNSPCs）の文化をトランスフェクションの効率的な方法を説明します。...

Amaxa Nucleofectorでヒト神経幹細胞をトランスフェクト

生存細胞の正確な数の知識は、多くの組織培養の操作が必要です。このプロトコルは、生細胞と死細胞を区別し、血球計算盤を用いて細胞を定量化する方法について説明します。それはヒト神経幹/前駆細胞（hNSPCsを）数えて説明していますが、それは他の細胞型に使用することができます。...

ヒト神経幹細胞を数える

神経幹細胞は、成人の非冬眠年子北極ジリス（AGS）の海馬から調製した。これらの神経幹細胞は、グリア培養とほぼ50:50ニューロンとして、数多くの通路を通って拡大して区別し、維持することができます。...

成人海馬ホッキョクジリス神経幹細胞の増殖と分化

捨てられた人間の胎児皮質組織から神経幹細胞の単離および培養上シンプルで信頼性の高い方法が記載されている。既知のヒト神経疾患から派生した培養物は、病理学、細胞及び分子過程の特性だけでなく、薬理学的有効性を評価するためのプラットフォームを提供するために使用することができます。...

廃棄されたヒト胎児脳組織から神経幹細胞の生成

この動画では、ヒトの神経幹細胞をニューロスフェアから神経およびアストロサイト前駆細胞に分化させる方法を酵素処理と成長因子が豊富な培地で培養し、最終的に特殊な前駆細胞に成熟させる方法を示しています。...

ヒト神経幹細胞の神経前駆細胞とアストロサイト前駆細胞への分化

成人脳から採取した神経幹細胞は神経系の発達の基礎研究から再生医療の潜在的な臨床応用を探索範囲の用途に利用が増加している。これは実験的な成果を鳴らす重要なこれらの細胞を成長させるために使用される分離と培養条件に厳密な制御を行う。...

大人の齧歯類の脳の従来の従来にない地域から神経幹細胞を増殖させる

このプロトコルは、単一の細胞懸濁液に解離することなく、球状の神経幹細胞および前駆細胞集合体の拡大を可能にする新たな機械的なチョッピング方法が記載されている。細胞/細胞接触を維持することは、40以上の継代するための迅速かつ安定的な成長を可能にします。...

ヒト神経の集合体のためのcGMP適用可能な展開法は、幹細胞および前駆細胞は、多能性幹細胞や胎児の脳組織由来

この方法は、直接末梢血細胞から濃縮造血前駆細胞からのヒト神経幹細胞を誘導するために開発された。...

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

分化したヒト神経幹細胞(hNSC)上のmiRNAの変化を特徴づける目的で、3次元システム上でのhNSC分化、miRNA...

三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

成体の哺乳類の脊髄には、培養で単離および増殖可能な神経幹/前駆細胞(NSPC)が含まれています。このプロトコルは、ラットおよびヒト臓器移植ドナーからの成体脊髄の脳室周囲領域から生成されたNSPCの採取、単離、培養、および継代について説明しています。...

成体ラットおよびヒト脊髄の脳室周囲領域から神経幹/前駆細胞の単離

本研究では、標準的なフィーダーフリーhPSC培養を用いた、シンプルでありながら堅牢な皮質オルガノイド培養システムのための詳細な技術を提供する。これは、...

インビトロでの脳ニューロン老化のモデリングのための皮質脳オルガノイドの堅牢で再現性の高い生成

学ぶヒト神経前駆細胞の継代培養法。フィブロネクチンコーティングと細胞解離バッファーを用いた標準化されたプロトコルで、神経発生研究と再生医療への応用可能性を探求します。

ヒト神経幹細胞を継代

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