ヒト神経幹細胞を継代
2007年8月22日
in vitroでのヒト神経幹/前駆細胞（hNSPCs）を操作する能力は、治療目的のための細胞移植としてのユーティリティを調査し、人間の神経発生を探索することができます。このプロトコルは、ヒト幹細胞研究の増加再現性を期待して培養し、継代hNSPCsの方法を提示。
こんにちは、スティーブです。私は、アーバインにあるカリフォルニア大学医学部の病理学科にあるフラナガン博士の研究室で働いています。今日は、ヒトの神経前駆細胞を分割する方法をお見せします。
この手法では、ヒトフィブロネクチン溶液で新しいフラスコをコードし、細胞解離バッファーで細胞を持ち上げ、次に細胞解離バッファーを10%血清溶液で中和し、細胞懸濁液を遠心融合し、細胞を新鮮で培地に懸濁し、細胞懸濁液を新しいフラスコに移します。私たちの研究室では、ヒトの神経前駆細胞を1日おきに培地の半分を交換して培養し、1〜2個ずつ分けて週に1回程度継代しています。細胞を継代するとき、免疫化学実験と交換したい場合や、核エフェクターを使ったトランスフェクションを行いたい場合など、細胞を数えることがあります。
まず、トリプシンとは異なり、非酵素的であり、細胞にはるかに優しいため、細胞をパッケージングする際に細胞解離バッファーを使用することが重要です。こんにちは、私たちは組織培養室にいます さて、ヒト前駆細胞のコンフルエントフラスコがどのように見えるかをお見せする前に、まず組織培養を準備します。まず、UVライトをオフにして、ライトとエアフローをONにします。
次に、フードを70%エタノールでペーパータオルをスプレーしてフードを拭き取ります。フードの内側に直接ではなく、ペーパータオルに70%エタノールをスプレーすることが重要です。フードに70%エタノールをスプレーすると、HEPAフィルターが損傷する可能性があり、これは非常に高価です。次に、すべての試薬と器具をスプレーします。
そして最後に、バキュームホースをスプレーします。これで準備は完了です。これらのセルを見てみましょう。したがって、これらの細胞は約80%コンフルエントに見えます。
これらはヒトの胎児から単離されたヒトの神経前駆細胞であり、T25フラスコで増殖させます。毎週、1〜2回に分けます。これで細胞を継代する準備が整いました。
そしてまず、BDバイオサイエンスのヒトフィブロネクチンで4時間コーティングした新しいT 25フラスコを持ってきます。そこで、フィブロネクチン溶液を取り除きました。細胞をフラスコに移動する前に、このフラスコをBBSですすいでください。
そして今、私は37度のインキュベーターから細胞を取り出します。彼らがそこにいました。次に、ヒトフィブロネクチンでコーティングされた新しいフラスコからPBS洗浄液を取り出します。
そして、新しいフラスコに2ミリリットルの古いコンディショニングメディアを追加します。だから今、私は彼を表面から取り除く前に、PBSで細胞をすすぐ必要があります。そこで、まず、残りの培地を取り除き、細胞を濡らさずにすぐに約2ミルのPBSを追加します。
PBSを取り外して、高射砲の表面から売上を取り除くために、販売解離バッファーを配置する前に、約2分待つつもりです。次に、PBSを除去し、再度、細胞が乾燥しないように、すぐに細胞解離バッファーを追加しようとします。そこで、1.5ミルの細胞解離バッファーを追加します。
また、PBSとは異なり、細胞に直接追加し、できるだけ多くの表面を覆うように試みます。そこで、フラスコを左右に動かしながら、このバッファーをゆっくりとセルに加えていきます。そして、細胞が表面から剥がれ始めるまで、今から約5分待ちます。
そして、フラスコを室温でフードに入れておきます。ここでわかるように、細胞は最初に切り上げられ始め、次に表面から出始め、実際にはいくつかの細胞がすでに浮いているのを見ることができます。そして、フラスコの側面を大きく叩くと、フラスコが外れやすくなります。
5分が経ちましたが、ご覧の通り、溶液は表面から剥がれた細胞で非常に密集しています。そして今度は、4.5ミルの血清含有培地を添加して、細胞解離バッファーの効果を中和します。そこで、D-M-E-M-F 12培地に10%熱不活化ウシ胎児血清を使用し、フラスコの表面に直接添加して、細胞が付着していないことを確認します。
そして、ピペットで優しく上下に動かして、残っている細胞を取り除きます。次に、細胞溶液を15ミルの円錐管に移します。そして、1000回転で1分間回転させます。
それで、細胞の回転が完了し、ここに美しい細胞パレットがあります。パレットを乱さないように、非常に慎重に美容液を取り出します。そして、パレットをメディアの4ミルに再吊り下げます。
そこで、ペレットを再懸濁して、細胞の塊が残らないようにして、溶液が均一になり、塊を含まないようにします。そして、私は1対2の分割を行っているので、4つのミルのうちの2つを取り、すでに2ミルのコンディションメディアが含まれている新しいフラスコに移します。そして最後に、フラスコにセルタイプ、通過番号、日付をラベル
付けします。これは、30分前に継代した細胞の様子です。そして、ご覧の通り、彼らのほとんどは、表面に付着し、プロセスを送り出し始めています。以上です。
そして今、私は数える準備ができています。
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概要
このプロトコルは、ヒト神経幹細胞/前駆細胞（hNSPC）の培養と移行をin vitroで行う方法を概説しています。この技術は、ヒト幹細胞研究の再現性を高め、神経発達と潜在的な治療応用の探索を容易にすることを目的としています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 幹細胞生物学
- 細胞培養技術
背景
- ヒト神経幹細胞/前駆細胞（hNSPC）は神経発達を研究する上で重要です。
- hNSPCのin vitro操作は治療の進歩につながる可能性があります。
- 幹細胞研究における再現性は科学的進歩にとって不可欠です。
- 細胞培養技術は神経科学研究の基礎となっています。
研究の目的
- hNSPCの培養のための信頼できる方法を提供すること。
- 実験応用におけるhNSPCの使用を容易にすること。
- ヒト神経発達の理解を深めること。
使用された方法
- ヒトフィブロネクチンでフラスコをコーティングすること。
- 細胞解離バッファーを使用して細胞を剥離すること。
- 解離バッファーを血清溶液で中和すること。
- 細胞を遠心分離して新鮮な培地で再懸濁すること。
主要な結果
- 概説された方法によるhNSPCの移行の成功。
- 細胞培養実践における再現性の向上。
- 免疫化学およびトランスフェクション実験への応用の可能性。
- 培地交換と移行頻度のルーチンの確立。
結論
- このプロトコルはhNSPC培養のための体系的なアプローチを提供します。
- 再現性の向上により、より良い実験結果につながる可能性があります。
- さらなる研究により、hNSPCの治療的可能性を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Standardized passaging of human neural stem/precursor cells (hNSPCs) supports reproducible in vitro models for target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease research. Reliable expansion of hNSPCs enables consistent assay inputs for phenotypic screening and lead identification programs. This protocol addresses variability in stem cell culture that can confound translational biomarker studies and preclinical model fidelity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neural pathway modulation using genetically stable hNSPCs expressing nestin and SOX2.
- Operational Value: Reduces culture-induced variability that obscures target engagement readouts in early screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides adherent, bipolar morphology hNSPCs suitable for high-content imaging of neurite outgrowth or synaptic marker expression.
- Operational Value: Standardized 1:2 split every 7 days supports scalable seeding densities for multi-well plate assays.
- Strategic Value: Fibronectin-coated flasks improve attachment efficiency, reducing well-to-well inconsistency in compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains undifferentiated marker expression, preserving multipotency for differentiation into disease-relevant neuronal subtypes.
- Operational Value: Conditioned media carryover during passaging supports paracrine factor studies relevant to neuroinflammatory pathways.
Pipeline & Workflow Integration
This passaging method fits within the discovery continuum from target validation through assay optimization to preclinical model generation, where hNSPC consistency impacts data reliability across stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via controlled expansion of hNSPCs for CRISPR screening or overexpression studies.
- Screening: Enables reproducible plating densities for quantifying compound effects on cell viability or differentiation markers.
- Analytics: Yields homogeneous suspensions amenable to flow cytometry or immunocytochemistry for quantitative readouts.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing a scalable source for generating neurons or glia for transplantation efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Defined coating and passaging frequency allows technology transfer across sites for multi-project stem cell programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in stem cell-derived assays through minimized passage-induced drift.
- Operational Value: Standardized dissociation and neutralization steps enhance day-to-day reproducibility.
- Strategic Value: Enables capital-efficient scale-up by reducing failed batches due to inconsistent subculture.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted decisions in neurodegenerative portfolios by improving data fidelity in target validation cascades.
Implementation Considerations
- Requires aseptic technique training for safe handling of dissociation buffers and serum supplements.
- Depends on access to human fibronectin-coated cultureware and sterile conical tubes for centrifugation.
- Necessitates standardization of passaging timing relative to confluence (~80%) to avoid overgrowth-induced differentiation.
- Adaptation to suspension or spheroid cultures would require matrix adjustments beyond adherent fibronectin coating.
- Limited to research-scale operations; GMP-compliant passaging would require closed-system bioreactors and qualified reagents.
