偏上皮細胞へのプラスミドのマイクロインジェクションによる低分子量GTPaseの機能を解析する

この手順では、分極膜輸送に対する小さなGTP ACEの影響を分析します。まず、小さなGTP ACEとレポータータンパク質をコードするDNAプラスミドを分極した細胞の細胞核に共注入します。次に、小胞体またはTGNでレポータータンパク質を停止させる温度でDNAを発現させ、小さなGTPAがサイトゾルに蓄積している間、シクロハイデの存在下でレポータータンパク質を細胞表面に追いかけ、さらなるタンパク質合成を防ぎます。

最後に、免疫蛍光分析のために細胞表面のレポータータンパク質を標識します。このアッセイから得られた結果により、共焦点顕微鏡による表面局在の変化の可視化が可能になります。トランストランスフェクトのような既存の方法のこの技術の主な利点は、マイクロインジェクションで達成される短時間の過剰発現において、二次的影響が最小限に抑えられ、目的のタンパク質の一次的影響を研究することができることです。

この方法は、small gtpaが分極膜輸送をどのように制御するかなど、細胞極性分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、成功したマイクロインジェクションに必要な個々のステップは、視覚的な支援なしでは説明が難しいため、非常に重要です Sigma Aldrichエンドトキシンフリーマキシプレップキットを使用してエンドトキシンフリー血漿DNAを分離します メーカーのプロトコルに従って。この実験では、孔径0.4μmの透明な12mmトランズウェルフィルターを3つ使用して培養します。

この細胞は、5番目のMDCK細胞の10倍の4倍を各フィルターに装着します。2日後、顕微鏡で培養物を検査し、細胞が閉じた単層で増殖していることを確認します。マイクロインジェクション用。

マイクロインジェクションの日には、5リットルのMM成長培地と15mmのHEISを360 x 15 mmプレートに調製し、摂氏39度のインキュベーターに入れます。さらに、1ミリリットルのMEM増殖培地と50ミリモルのハイス、および0.1ミリグラム/ミリリットルのシクロヘキシミドを3枚の12ウェルプレートに調製し、摂氏31度のインキュベーターに入れます。マイクロインジェクション顕微鏡の電源を入れ、この倒立顕微鏡のように、加熱されたステージ10 xおよび32 x対物レンズとeinor femtoジェットをセットしてセットアップします。

加熱されたステージを摂氏39度に設定します。また、エアテーブルへの窒素ガスタンクの供給を開きます。次に、DNAをろ過水で希釈して、最終濃度を0.2ミリグラム/ミリリットルにします。

続いて、einor マイクロ遠心分離機で DNA を 13, 000 RPM で 30 分間回転させます。上部を取り外し、新しいチューブに入れます。次に、外科用ブレードで培養皿から第1のフィルターを取り出してMDCK細胞を調製し、フィルターホルダーからフィルターを切り取り、摂氏39度の温めたMEM増殖培地5ミリリットルと50ミリハイスを含む調製した60×15ミリメートルプレートに入れる。

培養プレート内のフィルターを重くするには、サージカルブレードをフィルターの中央に置き、培養プレートを顕微鏡の加熱ステージに移します。希釈したDNAの2〜3マイクロリットルをマイクロインジェクション針にロードします。針の保護カバーをひねり、床に落とします。

針をホルダーに配置するには、インジェクトのメニューキーを押して、バルブがシャットダウンしていることを確認します。針をホルダーにねじ込みます。針をきつく締めすぎないように注意してください。

破損の原因となりますので、再度メニューキーを押してください。そのため、適用される補償圧力により、マイクロインジェクションの手順中にメディアが針に吸い込まれるのを防ぐことができます。最後に、ジョイスティックをタップして保存されたホーミングを消去し、針を細胞に下ろします。

10 x 対物レンズを使用して、針を液体の上の光線に持ってきます。次に、細胞に焦点を当てます。フォーカスホイールを180度上に回して再びピントを合わせ、針を見つけます。

ゆっくりと針を動かしてピントを合わせます。その後、再びピントを合わせないようにします。細胞に再び焦点を合わせる作業。

針を再びピントを合わせます。針が媒体の表面に触れるまで繰り返し、その時点でハローが観察されます。細胞が焦点を合わせている点まで到達し続けますが、針はまだ焦点面からぼやけています。

次に、32 x目標に切り替えて、コース設定を見つけます。針の先端で頂端膜に触れ、約10マイクロメートルを引くことでZ限界を設定します。核は頂端膜の下に約10マイクロメートル横たわっているためです。

次に、針を焦点面から数ミクロンできるだけ早く取り出します。針を核の上に向け、ジョイスティックの注入ボタンを押して放します。95 PSIから始めて、適切な射出圧力を見つけます。

圧力が高すぎると、セルが爆発します。圧力が低すぎると、白い点が残りますが、それ以外は何も起こりません。細胞サイズを変化させることなく、相変化を伴う注入を成功させます。

細胞上にある外科用ブレードの穴に100〜500個の細胞を注入します。次に、培養皿と外科用ブレードを備えた細胞を摂氏39度のインキュベーターに入れ、2時間インキュベートします。最後に、調製した12ウェルプレート(MEMと50ミリモル0.1ミリグラム/ミリリットル、シクロハイデ)に細胞を移し、摂氏31度で2時間インキュベートします。

発現したGFPシグナルの漂白を避けるために、その後の表面染色のすべての手順でアルミホイルで覆うことにより、試料を光から保護します。培養皿に入れた細胞を氷の上の金属板に載せて洗います。氷冷PBSプラスプラスで一度、目的のタンパク質のエクトドメインを認識する抗体のアイスピペット30マイクロリットル滴上の金属プレート上のパラフォームのきれいな部分を配置します。

次に、細胞を含むフィルターを逆さまにして液滴の上に置き、フィルターの裏側に抗体を数滴加えます。氷上で1時間インキュベートします。氷冷したPBS plus plusで細胞を3回洗浄し、室温で15分間3%パラホルムアルデヒドで固定します。

PBS plus plusで細胞を1回洗浄し、PBS plus plusで5分間平衡化します。次に、ブロッキング透過性バッファーで細胞をインキュベートします。室温で1時間インキュベートし、BPBで一次抗体を1〜200に希釈して、発現したRAB GTP ACE遠心分離機を10分間検出します 13, 000 RPMピペットで、30マイクロリットルの抗体溶液をウェットチャンバーに置いたクリーンなパラメータに

フィルター上の細胞を逆さまにして抗体滴の上に置き、1時間インキュベートします。室温で、細胞を右側を上にして12に戻します。ウェルプレートをプレート化し、適切な二次抗体とインキュベートした後、室温でBPBを30分間かけて5回洗浄します。これには、洗浄ステップも含まれます。

フィルター上のセルを脱イオン水に3回浸し、10マイクロリットルのマウントでマイクロスライドに右側を上にして置き、18 x 18ミリメートルのマイクロカバーガラスを上に置き、フェイシャルティッシュを使用してカバースリップを細胞に優しく押し付けます。最後に、V-S-V-G-T-S-O 45 GFPをコードするプラスミドのみの模擬注射でマニキュアで密封します。タンパク質は、十分に分極されていない細胞の赤色表面染色によって判断されるように、よく分極されたMDCK細胞の基底外側表面に送達されます。

GFP融合タンパク質の一部は、頂端膜に送達されます。対照標本がこのような形をしていると、データは信頼できないため、より分極性の高い細胞で実験を繰り返す必要があります。GFP融合に発現した全てのものが、全タンパク質に対する広範な細胞内緑色シグナルによって証明されるように、摂氏31度の追跡中に基底外側膜に送達されるわけではないことに留意されたい。一旦習得すると、この技術は、その開発後約10〜12時間かかるはずである。

この技術は、膜輸送の分野の研究者が分極した上皮細胞の制御タンパク質を探索する道を開きました。このビデオを見れば、マイクロインジェクション技術を用いて分極上皮細胞でタンパク質を発現する方法を十分に理解できるはずです。