Name: 微小管ポリマーメカニクス研究のためのマイクロ流体工学に基づくアプローチの開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: 学ぶマイクロ流体工学を用いた微小管ポリマーメカニクスの研究手法。PDMS成形と流体制御により気泡問題を解決し、高スループットアッセイで細胞骨格動態の理解を深めます。

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マイクロ流体工学は、流体流路の複雑な設計と製造により、多くの場合1マイクロリットル未満の微小な流体量を正確に制御することを可能にします1,2。マイクロ流体デバイスの小規模化は、ユニークな工学的現象を引き起こします。つまり、レイノルズ数(流体の流れにおける慣性力と粘性力の比の無次元尺度)は小さく、通常はマイクロ流体工学ではO(10)以下のオーダーであり、マイクロ流体デバイスにおける粘性力の重要性を強調しています。さらに、対流輸送と拡散輸送を比較するペクレ数では、マイクロ流体工学では対流輸送は一般的に無視できることを示しています3,4,5。マイクロ流体工学におけるこの拡散駆動型の層流領域は、正確な流体勾配を維持することにより、単一のデバイスでの並列実験をサポートするため、有利です。
フォトリソグラフィーは、マイクロ流体デバイスを作製するための主要な方法であることに変わりはない6,7,8。簡単に言うと、このプロセスには、マイクロ流体設計の「マスター」エッチングテンプレートを作成することが含まれます(図1)。感光性基板を調製し、マイクロ流体設計のフォトマスクをフォトレジストの領域を選択的に紫外線にさらします。その後のエッチング法により基板が現像され、デザインのレリーフが生成されます。ポリジメチルシロキサン(PDMS)は、多くの場合、マスターにキャストされ、硬化されます。その後、設計のマイナス特性を採用した硬化PDMSをマスターから取り外し、ガラスカバースリップに接着します。この製造プロセス全体は通常1〜2日かかるため、迅速な設計の反復と複数のデバイスの製造が可能になります。ソフトリソグラフィーと微細加工プロセスの詳細なレビューは、他の参考文献1,2,3,10,11,12,13で入手できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68185/68185fig01.jpg"> 
図1:従来のフォトリソグラフィープロセスと微細加工プロセスの概要(A)従来のフォトリソグラフィープロセスと(B)微細加工プロセス。用途や希望するフォトレジストの特性に応じて、ネガ型またはポジ型のフォトレジストを使用することができますが、それらは同じデザインマスターになります。必要なフィーチャ高さやフォトレジストの融解温度などの特性は、適切なフォトレジストの種類を決定するのに役立ちます。この図は、Rogers (2022)14の許可を得て修正されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68185/68185fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
マイクロ流体工学の使用は、多くの研究分野で可能性を広げており、最近では生物科学にその影響があります。マイクロ流体工学は、その規模が小さいため、細胞やタンパク質などの限られた貴重なリソースを正確に管理することができます。さらに影響力があるのは、マイクロ流体システムが、基板の剛性の変化、試料への力の行使、さらには電流の統合などの生理学的条件を模倣する調整が可能なことです。さらに、マイクロ流体工学を使用すると、複数の試薬を並行して操作し、システム設計を迅速にプロトタイプ化し、反復的に改良することができます。これらの機能により、ラボのワークフロー全体を、一般に「ラボオンチップ」1,6,9,15,16,17,18,19と呼ばれる単一のデバイスに小型化することができます。
マイクロ流体工学の細胞生物学的応用の1つは、微小管ポリマーの研究です。微小管は、細胞の細胞骨格の必須成分であり、細胞分裂や細胞内貨物輸送などのプロセスにおいて重要な役割を果たしている20,21。細胞骨格の最も硬い要素として、微小管はプレキシガラスに匹敵する弾性率を示します22,23。それらの堅牢な機械的特性は、例えば、心臓の収縮期および拡張期に周期的に曲がったり弛緩したりする心筋細胞の収縮など、さまざまな細胞機能にとって重要である24。マイクロ流体デバイスは、in vitroで微小管とその高次構造の特性を調べるために以前に採用されてきました。実際、マイクロ流体工学は、微小管重合ダイナミクス、微小管-微小管相互作用、および微小管の機械的特性に対する微小管関連タンパク質の影響を調査するために使用されてきました25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35、36、37、38、39、40、41。
マイクロフルイディクスの微小管分野への導入は多くのエキサイティングな発見をもたらしましたが、これらのデバイスを微小管研究に適合させることにはまだ改善の余地があります。この研究では、マイクロ流体デバイスの微小管の研究に根強く残る2つの特定の制限、つまり、通常、マイクロ流体デバイスの手動操作によってもたらされるデバイス内の気泡形成の可能性と、ハイスループットアッセイの低利用について説明します。まず、チューブの抜き差しなどの手動操作により、チャネルに気泡が形成される可能性があります。フローセル内の気泡形成は、気泡がタンパク質を変性させ、微小管ポリマーをせん断し、細胞培養に悪影響を及ぼす可能性があるため、壊滅的である42,43。さらに、デバイスの鋭い角や斜めの角度は、表面の濡れが不均一になり、空気が巻き込まれる可能性が高くなります。気泡の形成、持続性、および影響を減らすために、数多くの技術が開発されてきました。ただし、バブル緩和方法の使用は普遍的ではありません42,43,44,45,46。さらに、マイクロ流体工学を使用する大きな利点の1つは、ハイスループット実験の能力ですが、マイクロ流体工学は微小管研究のスケールアップにはまだ使用されていません。マイクロ流体デバイスは、同じデバイス上で複数の実験条件を並行してテストするように設計できます。例えば、流体グラジエントを使用して、異なる微小管関連タンパク質や薬物の流れを誘導し、同じデバイス内で分割された微小管の特定の領域に標的を絞った送達を可能にすることができます。
ここでは、これらの制限に対処するマイクロ流体デバイスを反復的に設計しました。私たちは、デバイスの製造の段階的なプロトコルを提供し、それにより、より多くの人々が微小管の研究にマイクロ流体技術を採用できるようにします。このデバイス設計には、バブルトラップ機能が組み込まれており、自動フロー制御システムを利用して手動介入を減らすと同時に、デバイス内の溶液の勾配をハイスループット分析に利用できます。要約すると、このマイクロ流体設計の開発は、微小管力学の広範な研究と理解を促進すると同時に、より広範な微小管研究分野にわたる実験設計に貴重な改善を提供することができます。

<table><tbody><tr><td>0.6 mLマイクロ遠心チューブ(透明)</td><td>任意のブランド</td><td></td><td>低保持タイプが推奨</td></tr>されます <tr><td>1.5 mLマイクロ遠心チューブ(透明)</td><td>任意のブランド</td><td></td> 低<td>保持タイプが推奨されます</td></tr><tr><td>1.5 mm標準生検パンチ</td><td>Integra LifeSciences</td><td>33-31A-P/25</td><td></td></tr><tr><td>100x/1.49開口数 TIRF対物レンズ</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mmガラスカバーガラス</td><td>ThorLabs</td><td>CG15CH</td><td></td></tr><tr><td>3 インチ片面研磨シリコンウェーハ</td><td>ユニバーシティ ウェーハ</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>4 インチ ペトリ皿</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>450 & マイクロ;L、オープントップ薄壁超透明チューブ</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>345843</td><td>プロトコルでは「エアフュージチューブ」と呼ばれ</td></tr>ます <tr><td>488 nm、561、および 640 nm 固体レーザー</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A-95 固定角ローター</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>347595</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Airfuge 空気駆動超遠心分離機</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>347854</td><td>プロトコルでは「エアフュージ」と呼ばれ</td></tr>ます <tr><td>Alexa Fluor 488 マイクロスケールタンパク質ラベリングキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon Ultra EM-CCD</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor NEO sCMOS</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td></td><td>Generic バージョン使用可能</td></tr><tr><td>ウシ脳 ラベルなしチューブリン (精製)</td><td>N/A</td><td></td><td>社製ですが、購入可能</td></tr><tr><td>カゼイン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>カタラーゼ</td><td>ミリポアシグマ</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>クリーンドライエア (CDA) (加圧ガス)</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr> 圧縮<tr><td>空気供給</td><td>任意のブランド</td><td></td><td>マイクロ流体に接続フローコントローラー</td></tr><tr><td>COMSOL マルチフィジックスソフトウェア</td><td>COMSOL, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カスタム真鍮製ステージアダプター</td><td>N/A</td><td></td><td>22 mm x 22 mmのカバーガラスを顕微鏡に取り付けるために社内で製造</td></tr> 脱<tr><td>イオン水</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr> D<tr><td>-グルコース</td><td>MilliporeSigma</td><td></td> G7528 <td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> EGTA <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>MilliporeSigma</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Elveflow Smart Interface (ESI) ソフトウェア</td><td></td> ETFE & frac14 を備えた Elveflow <td></td><td></td></tr><tr><td>フランジレス PFA 継手。「-28〜1/16」外径フェルール&NBSP;</td><td>ダーウィン・マイクロ流体工学</td><td>CIL-XP-245X</td> 加<td>圧リザーバーラックを介して、ミクルチューブソースバイアルからフローセンサーにチューブを接続するために使用</td></tr><tr><td>Fluiwell 4チャンネル2 mL低圧</td><td>フルイジェント</td><td>14002001</td><td>フロー制御システムをミクルーチューブに接続するために使用します。「加圧リザーバーラック」とも呼ばれます。</td></tr><tr><td>ヒュームフード</td> 任意の<td>ブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼ</td><td>ミリポアシグマ</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>イエナバイオサイエンス</td><td>NU-405L</td><td></td></tr><tr><td>グアノシン三リン酸 (GTP)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HS-625 高速エミッションフィルターホイール</td><td>Finger Lakes Instrumentation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJソフトウェア</td><td>N/A</td><td></td><td>オープンアクセス</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karl Suss MA-6 マスクアライナー</td><td>SUSS MicroTec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.05833</td><td></td></tr><tr><td>MATLABソフトウェア</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAPOSIT SPR 220 7.0フォトレジスト</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ流体継手 6-40 から 1/4"-28 アダプターキット</td><td>ダーウィン マイクロ流体</td><td>LVF-KFI-08</td> 加<td>圧リザーバーラック (Fluiwell ラック) を介して、ミクルーチューブソースバイアルからフローセンサーにチューブを接続するために使用されますマイクロ</td></tr><tr><td>流体継手メスルアーロックアダプターキット</td><td>ダーウィンマイクロ流体</td><td>LVF-KFI-04</td><td>シリンジをチューブマイクロ</td></tr><tr><td>流体フローコントローラー</td><td>に接続するために使用Elveflow</td><td>OB1 MK3 +</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ流体流量センサー</td><td>Elveflow</td><td>MFS3</td><td>この流量センサーの範囲は 0-80 & mu です。L&nbsp;</td></tr><tr><td>MICROPOSIT MF-319 開発者</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements ソフトウェア</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen (加圧ガス)</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ ヒーター</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>One-ピース フィンガータイト 10-32 コーン フィッティング 1/16 インチ外径チューブ用&nbsp;</td><td>ダーウィン マイクロ流体工学</td><td>CIL-F-120X</td><td>シリンジをチューブに接続するために使用</td></tr><tr><td>パクリタキソール (タキソール)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1097</td><td></td></tr><tr><td>フォトリソグラフィーマスク</td><td>N/A</td><td></td><td>当社の設計を使用して外部当事者によって製造</td></tr>されました <tr><td>PIPES</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>172615000</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>ハリックプラズマ</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>プラズマ流量計システム</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-FMG</td><td>プラズマクリーナーと統合し、加圧ガスの流量制御を可能にします</td></tr><tr><td>プラスチック製電球ピペット</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluoronic F-127</td><td>MilliporeSigma</td><td>P2443</td><td>プロトコルでは「ポロキソマー407」と呼ばれています</td></tr> 塩<tr><td>化カリウム</td><td>研究製品インターナショナル</td><td>P41000</td><td></td></tr><tr><td>サンゴバンパフォーマンスプラスチック&nbsp;チューブ Tygon .020 ID</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-206-8921</td><td>プロトコルでは「1.5 mm チューブ」および「チューブ」と呼ばれ</td></tr>ます <tr><td>メス</td><td>Any ブランド</td><td></td><td></td></tr><tr>の<td>スピンコーター</td><td>Cost Effective Equipment, LLC.</td><td>200x</td><td>このモデルは製造中止になる可能性があります</td></tr><tr><td>標準ピペットとチップセット 任意の</td><td>ブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>標準プラスチックシリンジ</td><td>任意のブランド</td><td></td><td>10 mL ルアースリップシリンジ</td></tr><tr><td>Sylgard 184 シリコンエラストマーキット</td>を使用しました <td>Dow, Inc.</td><td></td><td>プロトコルでは「PDMS」および「硬化剤」と呼ばれ</td></tr>ます <tr><td>T339 Micrewtube with Lip Seal and Flat Screw Cap</td><td>Medline Industried, LP。</td><td>T339</td><td>プロトコルでは「ソースバイアル」と呼ばれます。0.5 mL と 1.5 mL の両方のサイズを使用しました</td></tr><tr><td>TAMRA、SE;5-(および-6)-カルボキシテトラメチルローダミン、スクシンイミジルエステル</td><td>Invitrogen</td><td>C1171</td><td>プロトコルでは「TTR」と呼ばれ</td></tr>ます <tr><td>トリクロロ(1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル)シラン</td><td>MilliporeSigma</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>Trion Phantom RIE ICP&nbsp;</td><td>トライオンテクノロジー株式会社</td><td></td><td>このプラズマクリーナーは、プロトコルのステップ1.1でのみ使用されます。代わりに、PDMSボンディングに使用されるような別のプラズマクリーナーを使用できます。シリコンウェーハの洗浄のために、このシステムによって達成可能なはるかに低い真空を好みます</td></tr><tr><td>TRITC ポリクローナル抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A6397</td><td>プロトコルでは「抗ローダミン抗体」と呼ばれ</td></tr>ます <tr><td>ピンセット</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr> 真空<tr><td>ポンプ</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

微小管ポリマーメカニクス研究のためのマイクロ流体工学に基づくアプローチの開発

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微小管ポリマーメカニクス研究のためのマイクロ流体工学に基づくアプローチの開発

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