スクリーニング可能インビボトランスジェニック生物発光を使用したミトコンドリアモジュレーターについてのアッセイ線虫（Caenorhabditis elegans）

次の実験の全体的な目標は、モデル生物を使用して薬物のミトコンドリア毒性または有益な効果を特定することです。Cエレガンス。これは、緑色蛍光タンパク質に融合したホタルアブラナ科酵素を発現するトランスジェニックウミエルカ系統のTPレベルのin vivo定量によって達成されます。

融合遺伝子は、線虫に2つの異なる特性を付与します。1つ目は、基質Luciferが与えられた場合、線虫はそれらの細胞A TPの蓄えに比例して可視範囲の光を放出するということです。そして2つ目は、適切な波長で照らされると、強い緑色の蛍光を示すことです。

蛍光は線虫のTPレベルとは無関係であり、その質量または数に比例します。したがって、生物発光測定値を正規化するために使用できます。典型的なアッセイでは、発生的に同期した線虫の集団がL 4幼虫期まで成長します。

次いで、線虫を、蛍光および生物発光の両方の測定に先立って、一定期間、被験薬物化合物で処理する。結果は潜在的な薬物毒性を示しています。生物発光が減少すると、増強されたシグナルは、ミトコンドリア機能に対する有益な効果をさらに試験するためのヒットを示します。

この手法の主な利点は、培養細胞の薬物スクリーニングなどの既存の方法と比較して、スクリーニングがヒトの50%近くの遺伝的眼科を持つ生きた多細胞生物全体の生理学的状況で行われていることです。そして、人間のように、優雅さは実際に成人期に発展するためにミトコンドリアの酸化的リン酸化を必要とし、そのミトコンドリアはまた、その構造、機能、それらの生体エネルギーの点で哺乳類のミトコンドリアと多くの特性を共有していますプロトコル内の重要なパラメータは、曝露が線虫のへの曝露の長さを開始した発達段階を含みます。 関心のある薬と各井戸への同数の線虫の播種、そしてもちろん、汚染の回避 初日。無菌条件下で、2ミリリットルのS完全培地中の1枚の6センチメートルの線虫増殖培地プレートから、大腸菌1リットル当たり30グラムのフラスコに線虫を移す。

OP 50をS完全培地に入れ、4日目にフラスコを振とうしてインキュベートし、GRセンチュウの培養物を漂白して卵を収穫し、ワームの個体数を同期させます。次に、15ミリリットルのS完全培地が入ったガラスフラスコで卵を一晩孵化させ、翌日、5日目に振ると、線虫は同じ成長段階になります。毎回きれいな先端を使用して孵化した線虫の数を決定するには、線虫の3つの100マイクロリットルアリコートを900マイクロリットルの培地が入った別々のマイクロチューブに移し、0.01%tween 20を数回上下にピペッティングして、先端に付着した線虫を放出します。

次いで、三重希釈チューブのそれぞれから4つの別々の10マイクロリットル液滴中の線虫を数え、10マイクロリットルあたり10本の線虫で2つの20ミリリットルの培養物をセットアップするのに必要な線虫懸濁液の体積を計算し、おおよその体積を予め秤量した2つの15ミリリットルの円錐管にデカントする。チューブの重量を量り、実際に分注される量を決定します。次に、ターゲットボリュームをゆっくりと渦巻き、余分なボリュームを削除します。

次に、合計14ミリリットルの新鮮なSで線虫を洗い、チューブごとに完全な培地を洗い、イコライのリットルあたり30グラムのS完全な培地の5ミリリットルでペレットを懸濁します。OP50。線虫を15ミリリットルのSを含む円錐形のガラスフラスコに移し、イコライ1リットルあたり30グラム

OP 50をフラスコあたり20ミリリットルの総量にし、給餌時間を記録します。9つの10マイクロリットル液滴中の線虫の数を平均化して、培養物が10マイクロリットルあたり10個の線虫に希釈されていることを確認する。培養物をインキュベーターに42〜44時間置きます。

7日目に、線虫の培養物を1つのフラスコに引き込み、穏やかに渦巻かせ続けます。次に、線虫の3、4ミリリットルのアリコートを単一の60ミリリットルの滅菌トラフに移します。Eloquaに8チャンネルピペットを使用し、96に井戸あたり25マイクロリットルの懸濁線虫を使用します。

フラットで透明な底を持つウェルブラックのマイクロタイタープレート。次に、蓋をプレートに戻し、プレートを脇に置きます。2枚のプレートが播種されるたびに、失われた量を補うために、さらに2.5ミリリットルの線虫のアリコートをトラフに移します。

線虫で13〜14枚のプレートを播種した後、各ウェルに74マイクロリットルのS完全培地を加え、プレートが振とれている間に、プレートを湿ったチャンバーと振とうのあるインキュベーターに移します。テストのために2 96溶接薬物プレートを解凍します。次に、マルチチャンネルピペットを使用し、チップを毎回交換します。

最初の薬物プレートの最初の列から線虫プレートの1〜5列に1マイクロリットルを移します。.薬物プレートの2番目の列から別のマイクロリットルを線虫プレートの8列目から12列に移します。次に、線虫プレートの6列目と7列目に1マイクロリットルの車両を追加します。

ドラッグプレートの残りのカラムを使用して、残りの線虫プレートを同じように処理し、2つのすべてのビヒクル処理プレートも含めるようにします。その後、8日目にさらに20〜22時間、すべてのプレートを振盪インキュベーターの湿ったチャンバーに戻します。蛍光読み取り用のバックグラウンドコントロールプレートを調製するには、全車両処理された線虫プレートからのウェル内容物を組み合わせ、線虫を2〜3分間沈降させます。

次に、スナットを含む細菌を採取し、底が透明な黒いマイクロプレートの各ウェルに100マイクロリットルのサンプルをロードします。顕微鏡でプレートを観察し、線虫が見えるウェルに注意して、これらのウェルを蛍光バックグラウンド推定から除外できるようにします。次に、最後に蛍光を読み取り、各プレートの生物発光を測定します。

次に、新たに調製した発光バッファー50マイクロリットルをそれぞれに分配し、プレートを振とうのあるプラットフォームにしっかりと置き、3分後にタイマーを開始します。測定ごとに1秒で発光を読み取ります。この最初の代表的な実験では、ミトコンドリア複合体1阻害剤として知られる腐敗が、ある濃度の範囲で比較的短時間の曝露と長期の曝露の両方で線虫による光出力を減少させた。

この実験では、除草剤パラコートがC株PE2 54の生物発光GFP蛍光および正規化生物発光を有意に減少させることが実証された。さらに、生物発光の減少は蛍光のそれよりも大きく、ミトコンドリア機能の低下の既知の影響と一致し、薬物によって誘発されるTP産生を減少させた。このグラフは、線虫の生物発光を増強する化合物の一例である、クエン酸回路中間オキサロ酢酸を8ミリモルの単一濃度で示している。

これらの反復実行間で見られる実験のばらつきは、Luciferベースの実験では珍しいことではないことに注意してください。ここでは、ホタルルシフェラーゼ阻害化合物が、25マイクロモルおよび100マイクロモルでin vitroルシファー活性に影響を及ぼし、DDD化合物による活性がほぼ完全に減衰することが観察されました。図1、4、3、4、4、直接比較可能ではないが、生体内でもルシファー阻害化合物処理後に生物発光の有意な低下が観察された。

生物発光の変化は、in vivo A TPレベルの変化ではなく、Lucifer酵素阻害剤の作用に起因する可能性があることを実証しています。この手順を実行する際には、化合物がワームのエネルギー状態に影響を与えるのではなく、ホタルルシフェラーゼ酵素の活性に直接影響を与える可能性があることを考慮することが重要です。したがって、サブヒートは、ミトコンドリア機能を評価するための多くの手法、例えば、酸素消費量の決定、活性酸素種のミトコンドリア膜電位の決定、または海の優雅な株におけるミトコンドリアの可視化などを使用して検証できます。

GFPタグ付き、ミトコンドリア。