Name: の後胚表現型を識別するためのRNAiスクリーニング C.エレガンス /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 学ぶC. elegansのRNAiスクリーニングによる後胚期タンパク質発現・局在制御因子の同定法。蛍光標識タンパク質を用いて、遺伝子機能と細胞内動態を可視化する神経科学・ゲノミクス研究に応用可能です。

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著者らは、注射マーカーのDBL-1のcDNAとDrクリストファー·ロンゴ（ワクスマン研究所、ラトガース大学、ニュージャージー州）の贈り物に博士リックパジェット（ワクスマン研究所、ラトガース大学、ニュージャージー州）に感謝したいと思います。博士バルトグラントの研究室は、GFPタグ付きDBL-1コンストラクトの低コピー数の統合のための遺伝子銃砲撃を行った。ルネ·ガルシア研究室では、texIs100の作成 ​​中に技術支援を提供しました。ルネ·ガルシア、ロビンのLints、とHongmin秦研究所では、生産的なアドバイスを提供しました。この作品は、分子細胞医学のTAMHSC部からの起動資金によって賄われていた。化合物の範囲とスピニングディスク共焦点顕微鏡は、部門とディーン医学事務所のTAMHSC大学によって提供された資金で購入しました。

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<li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+I.+Wild-type+growth+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction.</a> Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).</li>
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<li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+for+small+body+size+mutants+in+C.+elegans+reveals+many+TGFbeta+pathway+components%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components.</a> Genesis. 35, 239-247 (2003).</li>
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<li>Nelson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bow-Tie+Genetic+Architecture+for+Morphogenesis+Suggested+by+a+Genome-Wide+RNAi+Screen+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, e1002010(2011).</li>
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<li>Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+mutant+allele+identification+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 865-867 (2008).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

ここで紹介するRNAiスクリーニング方法は、通常の（トランスジェニック）後胚表現型に必要な遺伝子産物の高感度で迅速な分析を可能にします。に示す例では、蛍光標識タンパク質の細胞内局在性に関与する遺伝子の画面です。しかし、このプロトコルは、関心のある他の後胚の表現型に影響を及ぼす遺伝子を同定するために変更することができます。 このメソッドは、RNAiライブラリーを使用して候補遺伝子アプローチを活用しています。突然変異誘発技術を使用してフォワード遺伝子スクリーニングはランダムに誘導される新たな対立遺伝子を識別しますが、それらの対立遺伝子は、24を識別するために相当な時間、労力、および/ ​​または資金を必要とします。 cDNAライブラリーを使用すると、その一方で、関心のRNAi表現型が急速に候補遺伝子を確認して生じたcDNAインサートの塩基配列。また、クローニングに対応したcDNAインサートは、識別された候補者の下流の分析を容易にします。さらに、変異したときに致死である遺伝子同定し、RNAiを用いて解析することができます。誘導される細菌で孵化した動物を置くことによっ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> NGM寒天培地</td><td>線虫の増殖培地</td><td> IPMサイエンティフィック株式会社</td><td> NGM寒天プロトコル25に従って調製することができます</td></tr><tr><td> M9培地</td><td> 22mmのKH 2 PO 4、 42MMのNa 2 HPO 4、 86mMのNaCl、 1 mMのMgSO 4を </td><td></td><td> 26 </td></tr><tr><td>寒天</td><td> EMDケミカルズ</td><td> 1.01614.1000 </td><td> NGMプレートの水に2％であった。顕微鏡スライドパッドの水に4％（当初は、その後、溶融するためのマイクロオートクレーブ）。 </td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>ベクトン·ディキンソン - Difco社製CP </td><td> 211677 </td><td> 0.25パーセント</TD&gt; </tr><tr><td> IPTG </td><td>研究プロダクツ国際社</td><td> I56000-5.0 </td><td> 1mMの最終濃度</td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td>研究プロダクツ国際社</td><td> C46000-5.0 </td><td> 50μg/ mlの希釈率</td></tr><tr><td> LBブロスレノックス</td><td>ベクトン·ディキンソン - Difco社製CP </td><td> 240230 </td><td> 20グラム/リットル</td></tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td>シグマ</td><td> 268054 </td><td> 12.5μg/ mlの希釈率</td></tr><tr><td>次亜塩素酸ナトリウム</td><td>すべてのブランド</td><td> 5％の家庭用漂白剤</td><td>新鮮な漂白剤を使用しています。 </td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>すべてのブランド</td><td> CAS 1310-73-2 </td><td> 5 Nの在庫</td></tr><tr><td> M9培地</td><td> Wormlabレシピブック</td><td> <a href="http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab">http://1</a>30.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm＃Commonlab </td><td> 26 </td></tr><tr><td> levamisol </td><td>シグマ</td><td> 31742 </td><td> 100μM - 1mMの希釈率</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> S227 </td><td> M9の作業希釈で、10mMの</td></tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td>グライナーバイオワン</td><td> 662160 </td><td> VWR販売代理店</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>すべてのブランド</td><td> 75×25×1ミリメートル</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバースリップ</td><td>すべてのブランド</td><td> 22×22ミリメートルNo.1.5 </td><td>顕微鏡メーカーが推奨する厚さを使用しています。 </td></tr><tr><td>複合顕微鏡</td><td>カールツァイス株式会社</td><td> A1m </td><td>実験のニーズに合わせて目標やフィルタを使用しています。 </td></tr><tr><td>メディア·ポンプ</td><td>マノスタットVaristalticポンプ</td><td>ケイト モデル＃72-620-000 </td><td>チューブとマシンの適切な設定を使用</td></tr></tbody></table>

の後胚表現型を識別するためのrnaiスクリーニング c.エレガンス</em

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

線虫C. elegansは、多くの遺伝子や遺伝子経路1の発見と機能解析のための貴重なモデルシステムであることが判明した。このシステムでは、研究のためのより洗練されたツールやリソースは、より微妙な表現型またはロールを持つ遺伝子の継続的な発見を容易にしています。 ここで我々はCを識別するための適応一般的なプロトコルを提示RNAiの2を使用して関心の後胚の表現型を有する線虫の遺伝子。この手順は、簡単にかどうかを解剖または化合物を顕微鏡の光や蛍光光学系により、アッセイの選択肢の表現に変更されます。このスクリーニングのプロトコルは、生物の物理的な資産および分子ツールにCを大文字にelegansの研究コミュニティが生産している。例として、我々は、この通常のローカライズに必要な遺伝子を識別するために、RNAiスクリーニングの蛍光産物を発現する統合されたトランスジーンの使用方法を示してい後期幼虫と成虫の製品。まず、完全長cDNAインサートを市販のゲノムRNAiライブラリーを使用していました。このライブラリは、候補遺伝子産物のRNAi還元することにより複数の候補の迅速な同定を容易にします。第二に、我々はRNAiと小文字を区別し、バックグラウンドで興味のある私たちのfluorecentlyタグ付きタンパク質を発現する統合された導入遺伝子を生成します。第三に、RNAi実験に孵化した動物を曝すことによって、この画面では、そうでなければ、目的のタンパク質を調節するのに後胚の役割をマスクしたい重要な胚の役割を担っている遺伝子産物の同定を可能にします。最後に、この画面では、単一細胞の解像度のために装備の複合顕微鏡を使用しています。

我々は、タンパク質の発現と局在の後胚レギュレータを識別するための増感方法について説明します。<em&gt; C.エレガンス</em&gt; RNAiベースゲノムの画面と機能的な、蛍光標識タンパク質を発現する統合された遺伝子を使用します。

の後胚表現型を識別するためのRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

C. elegansは、多くの遺伝子および遺伝子経路の発見と機能特性解析において、価値あるモデルシステムであることが証明されています1。より高度な...

この手順の目的は、RNAiベースのゲノムスクリーニングと蛍光タグ付きタンパク質を用いて、C. elegansにおけるタンパク質発現および局在の胚後調節因子を特定することです。適切なスクリーニング系統を構築した後、RNAiライブラリを選択します。この手順の最初のステップは、ライブラリクローンを細菌にパッケージングすることです。その後、細菌を選択して培養し、ステージを合わせたC. elegans線虫に与えます。線虫を72時間成長させた後、目的の表現型に変化があるか観察します。最終的に、標的タンパク質の発現または細胞内局在の変化を蛍光顕微鏡で可視化します。本手法を用いることで、蛍光タグ付きタンパク質の適切な細胞内局在に必要な遺伝子を特定することができます。ただし、本プロトコルを改変すれば、関心のある他の胚発生後の表現型に影響を与える遺伝子の特定にも適用可能です。既存の公開プロトコルに対する本手法の主な利点は、プレート播種前に細菌内で二本鎖RNAの産生を誘導させることで、個体におけるRNAi応答の整合性とレベルを最適化した点にあります。本手順の実演は、私の研究室のリサーチアソシエイトであるKathy fussが行います。実験開始から2か月以内にクローンライブラリーを調製してください。まず、選択したフィーディングライブラリークローン、およびポジティブコントロールとネガティブコントロールの細菌をLB carbonic tetracyclineプレートにストリークします。ポジティブコントロールには、BLE fourなどの用量依存的な胚後表現型を誘導する遺伝子を含むクローンを使用してください。ネガティブコントロールには、空ベクターまたは表現型が観察されない予測擬遺伝子を含むクローンを使用してください。プレートを一夜培養し、各クローンについて、50 µg/mLのカルベニシリンを含む2 mLのLB培地にストリークプレートから単一コロニーを接種します。培養液を振盪しながら一夜培養してください。翌朝、溶液が混濁していることを確認し、IPTGを培養液に添加して二本鎖RNAの産生を誘導し、同じ条件下でさらに4～5時間培養します。IPTGを添加することで、IPTGのみおよびNGMプレートのオーガーに頼るよりも、遺伝子産物のRNAi誘導ノックダウンをより一貫して強力に行うことができます。IPTGでのインキュベーション後、各クローンの培養液30 µLを、準備した24ウェルNGM RNAiプレートの各ウェルにスポットします。1ウェルにつき1クローンとし、各プレートの2ウェルをコントロール用に使用してください。各ライブラリーの位置を慎重に記録します。24ウェルプレートにクローニングし、プレートの蓋を開けた状態で滅菌フローフード内に置き、約20分間乾燥させます。アガーの端がプレートから剥がれないように注意してください。段階的に分画した線虫をプレート上に乾燥させた後、線虫の調製に関する手順を説明します。次のセクションでは、第1段階幼虫（L1期）の分画集団から開始してください。L1期幼虫から開始することで、潜在的な胚致死表現型を回避できます。段階的なステージの個体群を用いてスクリーニングを行うことで、観察された変動が単なるステージごとの自然な変動ではなく、RNAiによるものであるという確信を高めることができます。ただし、RNAiによって発生の遅延が生じた場合は、スクリーナーがそれを記録する必要があります。スクリーニング系統の混合ステージ個体群を漂白（Bleach）します。卵殻に保護された胚のみがこの工程を生き残ります。20 °Cで実施した場合は12時間以内、16 °Cで実施した場合は18時間以内に動物をステージングします。細菌培養物を接種した日に、健康的で、妊娠した成体と胚の両方が含まれているスクリーニング株の動物が入った100 mmプレートを3枚選択してください。すべての動物を滅菌済みのM9培地で洗浄し、洗浄液をスクリューキャップ付きの滅菌済み15 milliliterチューブに移します。洗浄液が3.5 millilitersを超える場合は、遠心分離して動物を沈殿させ、液体を3.5 millilitersまで除いてください。3.5 milliliters未満の場合は、水またはM9バッファーを用いて液量を3.5 millilitersまで増やし、各洗浄ステップで水酸化ナトリウムと漂白剤の混合液1.5 millilitersを加えて、成体から胚を分離させます。この溶液中での動物のインキュベーション時間は最大10分までとしてください。タイマーを開始した後、各チューブを10秒間ボルテックスし、2分ごとにボルテックス操作を繰り返します。ボルテックス処理を行うたびに、解剖顕微鏡下で溶液を観察し、成体の死骸を確認します。6〜8分以内に成体が断片化され、胚が放出されます。遠心分離により胚をペレット化し、ペレットを乱さないようにして上澄み液を可能な限り除去し、漂白液から胚を回収します。次に、滅菌済みのM9バッファーを加えて液量を10 millilitersにし、攪拌してペレットを再懸濁させます。漂白剤の臭いが完全に消失するまで、この洗浄工程を少なくとももう一度繰り返してください。動物のステージをより厳密に揃えるには、餌のないM9培地で胚を孵化させ、L1ステージで停止させます。M9バッファー中の胚を小さな三角フラスコに移します。その株および実験に適した温度で、フラスコを一晩振盪します。これにより、動物はすべて孵化し、翌日にL1ディアポーズ状態で停止します。準備した二本鎖RNAを発現する細菌へと幼虫を移し、設定した時点から幼虫の成長を再開させます。これは、24ウェルプレートに細菌をスポットした日と同じ日です。まず、L1期の個体を15 mLチューブに移し、遠心分離して沈殿させます。次に、個体を0.5～1 mLのM9バッファーで濃縮し、濃縮した線虫5 µLをプレート上に分注します。プレート上の個体数を数え、濃縮線虫溶液を調整します。3～10 µLあたり30匹の線虫となるように調整してください。最後に、準備した各ウェルの細菌の上に、L1ステージの個体を約30匹ずつスポットします。24ウェルプレートにおいて1ウェルあたり30匹以上の動物を飼育すると、飢餓状態になる可能性があります。スポットが乾燥するまで数分待機した後、ゴムバンドで蓋を固定します。動物を目的のステージでスコア判定できるよう、指定の温度と期間で倒置状態でインキュベートします。線虫がスクリーニング可能な状態になったら、陽性対照および陰性対照が期待される表現型を示すことを確認してください。その後、実験群の動物に発育異常が見られるか観察します。次に、解剖顕微鏡を用いて、各ウェルから8〜12匹の個体を5 µLの麻酔薬とともに4%Agri PETスライドに載せます。適切なカバーガラスを被せた後、複合顕微鏡を用いて少なくとも5匹の個体を観察します。遺伝子、観察個体数、および表現型結果を整理したデータベースを作成してください。各RNAi実験において、得られたRNAi表現型は、可能であれば別の二次的な表現型を用いて検証し、さらに実験を繰り返して確認してください。再現実験には、同一のストリークから採取した細菌を使用できます。保存期間の長いストリークでは、液体培地での一晩培養において増殖が悪くなる可能性があるため、まず再ストリークを行ってください。また、プラスミドで発現している遺伝子産物の影響により、増殖が不十分な細菌培養物もあります。この場合、プレートに播種する前に単に細菌を濃縮してください。継続的なスクリーニングを行う際は、ステージングのために常に十分な数の胚を準備しておくことが重要です。スクリーニングに用いる系統には、常に餌を与え（飢餓状態にせず）、目的の表現型に影響を及ぼす可能性のあるコンタミネーションがない状態を維持する必要があります。動物への給餌に関する維持スケジュールを策定しました。このスクリーニング用に設計された系統を用い、RNAiによってDBL oneの局在に影響を与える遺伝子を特定しました。GFPタグ付きdbl oneの正常な発現には、腹側神経索の細胞体と、DBLに対するアンチセンスRAを投与した動物における一列の点状構造が含まれます。1つのmRNAでは、DBL oneの発現が著しく減弱していました。これらの個体は、機能的なDBL L oneを欠損した個体と同様に小型でした。このRNAiスクリーンにより、DBL oneの局在に影響を与える産物を有する他の多くの遺伝子を特定することに成功し、これによりTGF betaの細胞内輸送に関する理解が深まり、さらなる多くの研究への足掛かりが得られました。この手法を用いれば、1人で毎週2〜4セットの実験を無理なく準備し、観察することが可能です。例えば、月曜日と火曜日に準備した動物をそれぞれ木曜日と金曜日に観察し、さらに金曜日と土曜日に動物を準備して、翌週の月曜日と火曜日に観察するといったスケジュールを組むことができます。スクリーニングの間、この手順に従って観察を行ってください。ステージングのために十分な数の胚を常に準備しておくことが重要であるため、スクリーニング系統を定期的に維持してください。また、すべての観察結果について詳細な記録を取ることが重要です。

rnai-screening-to-identify-postembryonic-phenotypes-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

Neurexinsとneuroliginsはシナプス分化と伝達に重要な役割を実行する膜ニューロンの接着タンパク質です。のニューロリギン欠損変異体...

の浸透圧の回避線虫（Caenorhabditis elegans）：二つの遺伝子のシナプス機能、ヒトのオルソログ NRXN1と NLGN1</em自閉症の候補として>、

イメージング C.エレガンス</em落射蛍光顕微鏡とオープンソースソフトウェアを使用して>胚

我々は、使用してプロトコルを記述する...

の定量と自動ハイスループットゲノムワイドRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

我々は、標的遺伝子とスコアボディサイズの表現型をノックダウンするのRNAi送り技法を使用する方法を示し...

線虫における身体サイズ調節に関与する遺伝子をスクリーニングするための戦略を給餌RNA媒介干渉を用いた<em&gt; Cエレガンス</em

dsRNAは、Cで供給しながら、 エレガンスは、大規模な送り画面の現在のプロトコルは、可変ノックダウン効率をもたらす遺伝子機能を評価するための強力なツールである。我々は、遺伝子発現の非常に有効かつ再現性のノックダウンをもたらす大規模なRNAi送り画面を実行するための改良されたプロトコルを記載している。...

大規模な遺伝子ノックダウン中<em&gt; C.虫</em&gt;堅牢な機能喪失表現型を生成するためのdsRNA摂食ライブラリの使用

このプロトコルは、画像に線虫（Caenorhabditis elegans）の胚における組織内の細胞を分割する方法について説明します。いくつかのプロトコルは、初期胚の画像細胞分裂に、このプロトコルはどのように中期後期胚形成の間に開発し、組織内の細胞分裂像に説明して方法について説明している。...

中に神経芽細胞細胞質分裂を可視化する<em&gt; C.虫</em&gt;胚

このプロトコルでは、線虫の体内の細胞運命変換中に細胞プロセスを研究する方法について説明します。観察することができます熱ショック プロモーターに駆動されるニューロン運命誘導転写因子チェ 1 過剰発現と神経細胞のリプログラミング クロマチン制御因子林 53 生殖細胞の RNAi による枯渇のトランスジェニック動物を使用して生体内で。<br...

線虫のニューロンに生殖細胞を再プログラムする RNAi と熱衝撃による転写因子の発現のアプリケーション

C.エレガンス胚発生を解析するセミハイスループットイメージング法とデータ可視化ツールキット

シャペロン-シャペロンとシャペロン基質相互作用を研究するために、我々は、軽度の突然変異またはシャペロンの過剰発現と組み合わせてRNA干渉を使用して カエノハブディティス・エレガンス...

カエノハブディティス・エレガンスを使用して組織特異的シャペロン相互作用をスクリーニングする

このビデオでは、トランスジェニック動物を作成するために線虫の生殖巣にマイクロインジェクションのテクニックを示しています。...

マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代

学ぶC. elegansのRNAiスクリーニングによる後胚期タンパク質発現・局在制御因子の同定法。蛍光標識タンパク質を用いて、遺伝子機能と細胞内動態を可視化する神経科学・ゲノミクス研究に応用可能です。

の後胚表現型を識別するためのRNAiスクリーニング C.エレガンス

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