の後胚表現型を識別するためのRNAiスクリーニング C.エレガンス

この手順の目標は、RNAiベースのゲノムスクリーニングと蛍光タグ付きタンパク質を使用して、C eleganceにおけるタンパク質発現と局在の胚後調節因子を特定することです。適切なスクリーニング株が構築されると、RNAiライブラリが選択されます。手順の最初のステップは、ライブラリクローンをバクテリアにパッケージ化することです。

次に、細菌を選抜し、成長させ、段階的なcエレガンス線虫に供給します。線虫を72時間成長させた後、目的の表現型の変化について観察されます。最終的に、攻撃されたタンパク質の発現または細胞内局在の変化は、蛍光顕微鏡で可視化されます。

この方法では、蛍光タグ付きタンパク質の適切な細胞内局在に必要な遺伝子を同定できます。しかし、このプロトコールは、関心のある他の胚後表現型に影響を与える遺伝子を同定するために変更することができます。この技術が既存の公開プロトコルと比較した場合の主な利点は、プレーティング前に細菌の二本鎖RNAの産生を誘導することにより、動物におけるRNAi応答の一貫性とレベルを最適化したことです。

手順を実証します キャシー・ファス、私の研究室の研究員 実験を開始してから2か月以内に、選択した摂食ライブラリクローンからのクローンライブラリの最初のストリーク細菌を準備し、LB炭酸テトラサイクリンプレートのポジティブおよびネガティブコントロールを準備します。ポジティブコントロールには、BLE fourなど、用量依存的な胚後表現型を産生する遺伝子を含むクローンを使用します。ネガティブコントロールの場合は、空のベクターまたは表現型が観察されていない予測された偽遺伝子を含むクローンを使用します。

各クローンについて、プレートを一晩インキュベートし、1ミリリットルあたり50マイクログラムを含む2ミリリットルのLB培地を接種します。ストリークプレートから単一のコロニーを持つ炭酸は、翌朝攪拌しながら培養物を一晩インキュベートします。溶液は、IPTGを培養物に添加し、同じ条件下でさらに4〜5時間インキュベートすることにより、濁った誘発による二本鎖RNAの産生を誘発する必要があります。

IPTGを添加すると、IPTGとNGMプレートのオーガーのみに頼るよりも、より一貫性のある堅牢な遺伝子産物のRNAI誘導ノックダウンが保証されます。IPTGインキュベーション後、各クローンから30マイクロリットルの培養物を調製した24ウェルNGM RNAiプレートの各ウェルにスポットします。ウェルごとに1つのクローン。各プレートには、コントロール専用の2つのウェルが必要です。

各図書館の場所を慎重に調べてください。24ウェルプレートのクローンを、蓋をしていないプレートを滅菌フローフードに入れて約20分間乾燥させます。寒天の端がプレートから引き離されないようにしてください。

ステージドセンチュウでプレートに乾燥させたら、センチュウの調製に関する指示が与えられます。次のセクションでは、最初の幼虫期またはL 1つの線虫の段階的な集団から始めます。Lから始めて、1匹の幼虫は潜在的な胚の致死的な表現型を回避します。

スクリーニングする動物の集団を段階的に分類することで、見られる変異はRNAiによるものであり、異なる段階で発生する単なる正常な変異ではないという確信も高まります。ただし、RNAiが発生遅延を引き起こす場合は、スクリーナー漂白剤によってこれに注意する必要があります。スクリーニング株の混合ステージ集団。

卵殻で保護された胚のみが、摂氏20度で実施された場合は12時間以内、または18時間以内に動物をステージングします。細菌培養物を接種した日に摂氏16度で実施した場合。スクリーニング系統動物の100ミリメートルプレートを3つ選択し、健康で重力、成体、および胚の両方を含んでいます。

すべての動物を滅菌M nine培地で洗浄し、スクリューキャップ付きの滅菌15ミリリットルチューブに洗浄液を移します。洗浄液が3.5ミリリットルを超える場合は、動物を回転させ、3.5ミリリットルを除くすべての液体を取り除きます。3.5ミリリットル未満の場合。

水またはM nineで容量を3.5ミリリットルに増やし、水酸化ナトリウムと漂白剤の混合物を1.5ミリリットルで成人から胚を解放します。動物をこの溶液で10分以内にインキュベートさせます。タイマーを開始した後、各チューブを10秒間ボルテックスし、2分ごとにボルテックスを繰り返します。

各ボルテックスの後、動物の死骸の解剖スコープで溶液を観察します。6〜8分以内に、成体は断片化され、胚は放出されるはずです。胚をペレット化し、ペレットを乱さずにできるだけ多くの上清を除去することにより、漂白剤溶液から胚を取り除きます。

次に、滅菌M nineを追加し、攪拌を使用して、ペレットを10ミリリットルの容量に再懸濁します。漂白剤の臭いが完全に検出できなくなるまで、この洗浄プロセスを少なくとももう一度繰り返します。より厳密にステージ化するために、動物は食物なしでMナインミディアムで胚を孵化させることにより、Lの1つのステージでそれらを逮捕します。

これは、M nineの胚を小さな三角フラスコに移すことによって行われます。フラスコをひずみに適した温度で一晩振って実験します。この間、動物はすべて孵化し、翌日Lの1つの休眠で停止します。

幼虫を二本鎖RNを発現する調製した細菌に移すことにより、設定された時点から幼虫の成長を再開します。これは、24ウェルプレートにバクテリアが発見されたのと同じ日です。まず、L oneの動物を15ミリリットルのチューブに移し、回転させます。次に、動物をM nineの半分から1ミリリットルに濃縮し、5マイクロリットルの濃縮線虫をプレートに置きます。

プレート上の動物の数を数え、濃縮された線虫溶液を調整します。TE 30 マイクロリットルごとに 10 マイクロリットル。最後に、調製した各ウェルの細菌に約30Lの1段階動物を見つけます。

24ウェルプレートは、ウェルあたり30匹以上の動物が飢餓につながる可能性がありますスポットが乾燥した後、数分かかりますが、輪ゴムで蓋を固定し、必要な温度と持続時間で動物を反転させてインキュベートし、目的の段階で動物をスコアリングします。線虫をスクリーニングする準備ができたら、ポジティブコントロールとネガティブコントロールが期待される表現型を生成することを確認します。その後、実験動物の発生異常を観察します。

次に、解剖顕微鏡を使用して、各ウェルから8〜12匹の動物を4%Agri PETスライドに5マイクロリットルの麻酔薬を滴下します。適切なカバースリップを貼った後、複合顕微鏡を用いて少なくとも5匹の動物を観察します。遺伝子、観察された動物の数、表現型の結果について整理されたデータベースを保管してください。

各RNAI実験について、可能であれば別の二次表現型によってR RNAiが産生した表現型を確認し、実験を繰り返すことで、同じ系統の細菌を繰り返し実験することができます。古いストリークは、液体の一晩の培養での成長不良につながる可能性があるため、最初にストリークを再設定する必要があります。一部の細菌培養物は、プラスミドに発現する遺伝子産物のためにうまく成長しません。

この場合、めっきする前に細菌を濃縮するだけです。継続的なスクリーニングでは、常に多くの胚をステージングの準備をしておくことが重要です。スクリーニング株は常に給餌されるべきであり、飢餓状態にならず、関心のある表現型に影響を与える可能性のある汚染物質がないようにする必要があります。

動物への給餌のためのメンテナンススケジュールを定めました。DBLの1つの局在に影響を与える遺伝子は、このスクリーニングの株デザインを使用してRNAiによって同定されました。GFPタグdbl oneの正常な発現には、腹側神経索細胞体と、DBLに対するアンチセンスRAを与えられたpuncti動物の列が含まれます。

1つのmRNAは、DBLの発現が著しく減衰していることを示しました。これらの動物も小さく、機能的なDBL、L型が欠けている動物などでした。RNA Iスクリーニングは、その産物がDBLの1つの局在に影響を与える他の多くの遺伝子を成功裏に同定し、TGFベータが細胞内輸送をどのように行うかについての理解を広げ、さらに多くの研究の出発点を提供しました。

この方法を使用すると、1人の人間が毎週2〜4セットの実験を合理的にステージングして観察できます。たとえば、月曜日と火曜日にステージングされた動物は、それぞれ木曜日と金曜日に観察でき、動物は月曜日と火曜日の金曜日と土曜日に再びステージングできます。画面全体でこの手順を実行しながら観察します。

ステージングのために十分な量の胚を準備しておくことが重要であるため、スクリーニング株を定期的に維持してください。また、すべての観察結果について詳細なメモを取ることが重要です。