成人肝細胞の混合初代培養からマクロファージを分離するためにシンプルかつ効率的な方法

次の実験の全体的な目標は、複雑な機器やスキルを必要とせずに、ラット肝細胞の混合初代培養物から複数のマクロファージ培養物を得ることです。これは、まずコラゲナーゼ灌流による成体ラット肝細胞の解離によって達成され、続いて実質肝細胞画分の単離によって達成されます。次に、細胞をT75でインキュベートし、増殖培地と共に組織培養フラスコを調製し、肝細胞の混合初代培養を確立する。

その後、10〜12日間の培養後、培養フラスコを振とうしてマクロファージをプラスチック皿に移し、短いインキュベーション期間後に選択的接着によって回収します。最後に、6個以上の細胞を、同じT75組織培養フラスコから2〜3日間隔で2週間以上繰り返し回収することができる。肝臓マクロファージの単離法は十分に説明されています。

しかし、これまでの方法の多くは、遠心イラストレーターなどの高度な機材や高度な技術力が必要でした。ここでは、特別な機器や高度な実験室技術を必要としない、成体ラップ肝細胞の混合一次培養物から十分な数と純度の肝臓マクロファージを得るためのシンプルで新しい方法を紹介します。動物解剖、肝臓の灌流、細胞の調製について、国立動物衛生研究所のNorco医師、山中医師、吉岡美子医師が実演します。

次に、肝臓マクロファージの文化的リスクからの分離と精製について、農業生物科学研究所の竹野武人博士によって示されます。それでは始めましょう。ラットの肝臓の氾濫に備えるためには、まず1本の洗浄液と1本のコラゲナーゼ溶液を予熱することから始めます。

次に、皮膚ピンチによる鎮静を確認した後、麻酔をかけた成体の雄ラットをステンレス製の鍋に入れ、腹部と胸部に70%エタノールを噴霧します。次に、解剖ハサミで腹部の中央に小さな切り込みを入れ、皮膚をはがします。次に、ハサミで腹部を開き、門脈の位置を確認します。

次に、外科用糸を門脈の下に通し、糸をゆるく締めます。次に、下バノックカバと腸間膜静脈の遠位部分を蚊クランプで固定して、肝臓への血液の逆流を防ぎます。横隔膜をハサミで切開して胸腔を開き、眼ハサミで門脈を小さく切開した後、心臓を露出させ、静脈に2ミリのプラスチックカテーテルを挿入し、カテーテル周りの糸をしっかりと締めます。

灌流システムに予温洗浄液をロードし、カテーテルに接続します。C 2で毎分10ミリリットルの速度で灌流を開始する。同時に、解剖はさみで右のアトリウムの壁に切り込み

増殖を10分間続けてから、増殖溶液をコラゲナーゼ溶液に切り替えて10〜20分間灌流します。毎分10ミリリットルの速度で、滅菌ビーカーに25ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を満たします。次に、灌流肝臓を取り出して慎重にビーカーに入れます。

肝臓をハサミで細かく刻みます。得られた細胞懸濁液に75ミリリットルのコールドMEMを加えます。穏やかにピペッティングした後、100 μメートルのセルストレーナーで懸濁液をろ過します。

未消化の組織片の結合組織を除去するには、ろ液を50ミリリットルの円錐管に集めます。.濾液を50ミリリットルの円錐管に移し、最初に細胞を50Gで摂氏4度で1分間スピンダウンすることにより、細胞を4回洗浄します。ブレークオフしたら、上清を慎重に廃棄し、ペレットを冷MEMに再懸濁し、最後の洗浄後に細胞を再びスピンダウンします。

肝細胞を増殖培地に再懸濁します。次に、5〜10T75組織培養フラスコに細胞を1平方センチメートルあたり10〜4番目の細胞の6.7倍の密度で播種します。培養フラスコをインキュベーターに入れ、2〜3日ごとに増殖培地を交換します。

1日の培養後、実質肝細胞がフラスコ表面に広がり、1つまたは2つの丸い核を持つ典型的な多角形のコーパル石のような形態を示します。培養後数日以内に、実質肝細胞は上皮細胞の形態を失い、より平坦な線維芽細胞に変化します 6日目頃、位相コントラストにより、明るい丸いマクロファージ様細胞が線維芽細胞シート上で増殖し始めます。マクロファージ様細胞の増殖は、12日目頃に最大レベルに達します。

マクロファージ様細胞の数は、線維芽細胞シートが変性し始める19日目頃に減少します。したがって、培養の約7〜10日間で、マクロファージが再懸濁されてから30分間、培養フラスコを相互に振とうすることにより、細胞シート上で増殖したマクロファージを培地に懸濁します。100 mmの非組織培養グレードのプラスチック皿を、2つのT 75フラスコの培地で再生します。

培養フラスコに増殖培地を補充し、インキュベーターに戻します。インキュベーション期間後30分間プラスチック皿をインキュベートし、他の汚染線維芽細胞が懸濁したままの状態で、マクロファージ様細胞様細胞を皿表面に付着させた細胞をプレーティングしてから10分後に、培地を吸引し、プラスチック皿をPBSで穏やかにすすいで皿を3回洗浄します。PBSリンス後、高度に精製されたマクロファージ集団が得られます。

この図に見られるように、細胞は40分間の培養後に典型的なマクロファージ形態を獲得し、矢印で示されているように有糸分裂細胞が頻繁に観察されます。この新しい高度に精製されたマクロファージ集団を1ミリリットルのトリップLE Express溶液で採取するには、洗浄した細胞にLE Express溶液を注入し、さらに10分間インキュベーターに戻します。このインキュベーション期間の後、9ミリリットルの増殖培地を加え、細胞スクレーパーで付着したマクロファージを優しく掻き取り、15ミリリットルのコニカルチューブ遠心分離機に移し、上清を捨てます。

1ミリリットルの増殖培地を添加し、再懸濁した細胞塊を激しいピペッティングにより単一細胞に解離し、このグラフに示すようにヘモサイトメーターにより細胞数を列挙すると、6個中10個以上をT75培養フラスコから2〜3日間隔で2週間以上繰り返し採取することができ、 T 75培養フラスコあたり10〜7の総細胞収量を可能にします。これらの画像に示されているように、単離された細胞は、CD68またはED1およびCD172AまたはOX41などのラットマクロファージ抗原に対するモノクローナル抗体で免疫染色されています。これらの細胞は、FITC標識マイクロビーズの活性食作用など、マクロファージの機能的特性を持っていました。

このビデオでは、成体赤肝細胞の混合初代培養物からマクロファージを得るためのシンプルで効率的な方法を紹介しました。私たちの手順は複雑な機器やスキルを必要とせず、真鍮の同じ培養物から繰り返し収穫できる十分な数の純粋なマクロファージを提供します。この方法は、他の哺乳類種にも適用できます。

ビデオをご覧いただき、ありがとうございました、そして今後の実験に頑張ってください。乾杯。