Name: 成人肝細胞の混合初代培養からマクロファージを分離するためにシンプルかつ効率的な方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 学ぶ ラット肝細胞の混合初代培養からマクロファージを分離する簡便な方法。コラゲナーゼ灌流と選択的付着を用いて、複雑な装置なしに高純度のマクロファージを繰り返し収集できます。

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この作品は、研究助成金及び農業、林業、そして日本の水産省の食品ナノテクノロジープロジェクトからの補助金によって賄われていた。

1。肝臓の灌流<ol><li>ペントバルビタールナトリウム溶液（50 mgのナトリウムペントバルビタール/ kg体重）の腹腔内注射によって、成体雄Sprague - Dawleyラットを（体重150〜200グラム週齢の10〜15時）麻酔。 </li><li>ステンレス鍋に動物を配置し、腹部と胸部の上に70％エタノールをスプレー。 </li><li>皮膚の小さなカットして皮を作る。ハサミでカットで腹部を開きます。 </li><li>門脈の位置を確認し、門脈と疎塊の下に外科的スレッドを渡します。 </li><li>クランプ下大静脈と肝に血液の逆流を防ぐために、腸間膜静脈の遠位部分。はさみで横隔膜をカットして胸腔を開き、そして心を公開。 </li><li>門脈にプラスチック製のカテーテル（直径2mm）を挿入し、カテーテルの周囲にしっかりとスレッドを締めます。 </li><li> 37温めた℃、洗濯液（pH7.2のCa 2 +とMg 2 + 0.5mMのEGTA、10mMのHEPES、4.2 mMのNaHCO 3を含む無料のHBSSが）でロードされる灌流システムにカテーテルを接続する</li><li> 10ml /分の速度でその場で灌流を開始する。それと同時に、右心房の壁にカットを行います。 10分間の灌流を続ける。 </li><li>速度で20分- 、および10の浸み込ませる。[pH7.5の10mMのHEPESおよび4.2mM NaHCO 3を含むHBSSはI型コラゲナーゼ（0.05％）とトリプシン阻害剤（50μg/ ml）を補充した]コラゲナーゼ溶液への灌流液を切り替える10 ml /分、肝臓が少し腫れて漿膜下の肝臓の構造の崩壊のための符号を示すまで。 </li></ol> 2。実質の肝細胞が豊富な細胞分画の調製<ol><li>取り外し、慎重にコラゲナーゼ溶液の25mlを含む滅菌ビーカーに肝臓を移す。はさみで細かくミンチ。 </li><li>その結果、細胞懸濁液中に冷たいMEMの75 mlを加え。穏やかなピペッティングした後、ろ液は、セルストレーナー（100μm以下）を介して結合組織および未消化の組織片を除去する。 </li><li> 4℃（ブレーキオフ）で1分に50 × gで50 mlコニカルチューブと遠心分離機にろ液を移す。 </li><li>注意深く上清を捨てる。冷たいMEMでペレットを再懸濁します。 </li><li> ）三回2.4を繰り返します。 </li></ol> 3。肝細胞の混合初代培養<ol><li>に10％熱不活性化100μMのβ-メルカプトエタノールを添加したFCS、、10μg/ mlのインスリン、100μg/ mlのストレプトマイシンおよび100 U / mlペニシリンを含むDMEMで構成される成長培地に2.5で得られた細胞）を一時停止、および種子6.7 × 10 4細胞/ cm 2（培地の5 × 10 6細胞/フラスコ/ 12-15 ml）の密度で：五から十組織培養フラスコ（75 cm 2と表面積）。 </li><li>文化のflasksat 37インキュベート℃、5％CO 2の大気中のC - 95％の空気。 </li><li>増殖培地2〜3日おきの間隔を交換してください。 </li></ol> 4。マクロファージの選択的分離<ol><li>文化の12日後に、マクロファージは、細胞シートで増殖する。これらの細胞は80℃培養フラスコの揺れ逆数で中断している - 30分間毎分120ストロークを37℃ </li><li> 100ミリメートルの非組織培養グレードのプラスチック製の皿に培養液を移す。 1つのプラスチックの皿に2つのT75フラスコから培地をプール。成長培地を補充培養フラスコをインキュベーターに戻す。 </li><li> 37℃で30分間プラスチック皿をインキュベート℃、5％CO 2の大気中のC - 95％の空気。他の混入細胞はそうではないマクロファージが容易に、このインキュベーションのプロセスの下で、非組織培養グレードのプラスチックの皿に取り付けます。 </li><li>培地を吸引し、穏やかにPBSでプラスチック製の皿を洗う。このステップを3回繰り返します。 </li><li>皿にTrypLE Expressソリューションの1 mlを加え、そして37℃で10分間インキュベート℃、5％CO 2の大気中のC - 95％の空気。 </li><li>増殖培地9mlのを追加。優しくセルスクレイパーで接続されているマクロファージを削り取る。 </li><li> 25 ° C（上ブレーキ）で5分で180 × gで15 mlコニカルチューブと遠心分離機に細胞懸濁液を移す。 </li><li>上清を捨て、増殖培地1 mlを加える。活発なピペッティングによって単一細胞に解離する。血球計計数することにより、細胞数を列挙する。 </li><li>分離ステップは、二週間以上の2〜3日間隔で同一の培養フラスコで繰り返すことができます。 </li><li>分離されたマクロファージは、3.1で説明されている増殖培地で培養することができる。 </li></ol> 5。代表的な結果成体ラット肝細胞の混合初代培養の例を図2に示されています。肝実質細胞は培養中の数日以内に上皮細胞の形態を失い、変性または線維芽細胞様細胞に変身。その後、一日中6〜12段階、コントラスト、明るい、ラウンドマクロファージ様細胞はvigourouly線維芽細胞シートで増殖する。培養フラスコを振とうすることにより、マクロファージは、容易に培養培地に懸濁させ、そしてマクロファージの選択的接着（図3）のプラスチック製の皿の結果でその後の転送とインキュベーション。マクロファージ様細胞は、8日目には早くも収穫され、数字は12〜14日に最大レベルに到達することができます。以上の10 6の細胞をT75培養フラスコあたり10 7（図3）のフラスコあたりの総細胞収率を可能にする、以上の二週間に2〜3日間隔で繰り返しT75培養フラスコから収穫することができる。分離されたマクロファージの純度は次のようなED - 1（図4）、ED - 3、OX - 41（図4）とIba1 9などのラットマクロファージ特異的抗体、とフローサイトメトリーまたは免疫細胞化学により評価、95から99パーセントでした。分離した細胞は、ポリスチレンビーズのアクティブな食作用（図5）、組換えGM - CSF、LPSで刺激し、多核巨細胞9の形成時に炎症/抗炎症性サイトカインの分泌に対する増殖応答としてマクロファージの典型的な特徴を、示す。 <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1ラット肝細胞の混合初代培養からのマクロファージ様細胞の選択的単離および精製の ​​ためのスキーム。 <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。ラット初代肝細胞の培養とマクロファージ様細胞の増殖。矢印は多核巨細胞を示している。スケールバー= 100μmの。エルゼビアから許可を得て免疫学的方法の研究、Vol.360、47〜55（2010）9から転載。 <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。揺れや添付法によるマクロファージ様細胞の選択的分離。細胞は、フラスコを振とうすることにより培養液に懸濁し、その後、非組織培養グレードのプラスチック製の皿に移し、37℃でインキュベートした。他の混入繊維芽細胞が中断されたままながら、めっき後の10分には早くも、マクロファージ様細胞は、皿の表面に付着。 PBSで洗浄した後、高度に精製されたマクロファージの人口が得られた。これらの細胞は、培養の40分後に典型的なマクロファージの形態を獲得し、有糸分裂細胞は、頻繁に（矢印）が観察された。異なる培養期間におけるフラスコから回収した細胞数に変更があった場合、それが表示されます。値は3〜5フラスコに、平均± SDである。実験を3回繰り返していたし、データは別の記号で示されます。スケールバー= 100μmの。エルゼビアから許可を得て免疫学的方法の研究、Vol.360、47〜55（2010）9から転載。 <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4ラットマクロファージに対するモノクローナル抗体を用いたマクロファージ様細胞の免疫染色。 <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5。マクロファージ様細胞によるFITC標識マイクロビーズの貪食。

<ol><li>Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+as+a+lymphoid+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The liver as a lymphoid organ.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 147-163 (2009).</li>
<li>Roberts, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+Kupffer+cell+in+mediating+hepatic+toxicity+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of the Kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis.</a> Toxicol. Sci. 96, 2-15 (2007).</li>
<li>Gao, B., Jeong, W. I., Tian, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver%3A+An+organ+with+predominant+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver: An organ with predominant innate immunity.</a> Hepatology. 47, 729-736 (2008).</li>
<li>Janousek, J., Strmen, E., Gervais, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+murine+Kupffer+cells+by+centrifugal+elutriation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of murine Kupffer cells by centrifugal elutriation.</a> J. Immunol. Methods. 164, 109-117 (1993).</li>
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<li>Heuff, G., Meyer, S., Beelen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rat+and+human+Kupffer+cells+by+a+modified+enzymatic+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of rat and human Kupffer cells by a modified enzymatic assay.</a> J. Immunol. Methods. 174, 61-65 (1994).</li>
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<li>Yoshioka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+expression+of+cytokine+mRNAs+by+lipopolysaccharide+in+bovine+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Primary culture and expression of cytokine mRNAs by lipopolysaccharide in bovine Kupffer cells.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 155-163 (1997).</li>
<li>Kitani, H., Takenouchi, T., Sato, M., Yoshioka, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+isolation+method+for+macrophage-like+cells+from+mixed+primary+cultures+of+adult+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel isolation method for macrophage-like cells from mixed primary cultures of adult rat liver cells.</a> J. Immunol. Methods. 360, 47-55 (2010).</li>
<li>Gorrell, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+fibrosis%3A+the+hepatocyte+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver fibrosis: the hepatocyte revisited.</a> Hepatology. 46, 1659-1661 (2007).</li>
</ol>

すべての動物は、動物実験のための機関の委員会が定めたガイドラインと規則に従って、動物衛生研究所の動物施設に保持され、運営された。

ここで、我々は、成体ラットの肝細胞の混合一次培養物からマクロファージを得るために簡単かつ効率的な方法を報告する。私たちの方法は、マクロファージ9として、その生物学的特性に基づいてこれらの細胞のその後の単離および精製してラットの肝細胞の混合培養におけるマクロファージの小説増殖活性に最初に依存しており、。それは、大人の肝臓の細胞の混合初代培養で増殖したマクロファージはクッパーまたは肝実質細胞の画分に汚染された関連する細胞由来のかもしれない可能性があります。マクロファージが混在初代培養における実質肝細胞10と他の繊維芽細胞の形質転換に起因する特定の環境の変化に対応している場合があります。 結論として、私たちの方法は、高度な機器や技術的なスキルを用いてラット肝臓cellswithoutの初代培養から十分な数と純度のマクロファージ様細胞の分離を提供します。さらに、分離手順は、2週間以上同じ培養フラスコで繰り返すことができます。このメソッドは、他の哺乳動物種に適用できるかもしれない。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウムソリューション</td><td>共立製薬</td><td> Somnopentylインジェクション</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液（HBSS） </td><td>インビトロジェン</td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール四酢酸（EGTA） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> E - 4378 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>和光純薬</td><td> 032から10534 </td><td>細胞解離グレード （ロットチェックに必要） </td></tr><tr><td>トリプシン阻害剤</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T - 9128 </td><td></td></tr><tr><td>イーグルの最小必須培地（MEM） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M - 4655 </td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコは変更されている イーグル培地（DMEM） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D - 6459 </td><td>高グルコース型</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FCS） </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> 56で不活性化熱℃で30分間。 （ロットチェックに必要） </td></tr><tr><td> TrypLEエクスプレス</td><td>インビトロジェン</td><td> 12605 </td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（PBS） </td><td>インビトロジェン</td><td> 14190 </td><td>のCa 2 +とMg 2 +フリー</td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M - 7522 </td><td>在庫：蒸留水に100mMの</td></tr><tr><td>インスリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> I - 5500 </td><td>在庫：0.1N塩酸で10 mg / mlの</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 352360 </td><td>メッシュサイズ：100μm以下</td></tr><tr><td>組織培養フラスコ</td><td>住友ベークライト株式会社</td><td> MS - 21250 </td><td>表面積：75 cm 2と </td></tr><tr><td>非組織培養プラスチック皿</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td>セルスクレイパー</td><td>コー​​ニング（株） </td><td> 3010 </td><td></td></tr><tr><td>逆数シェーカー</td><td>タイテック</td><td> NR - 1 </td><td></td></tr></tbody></table>

成人肝細胞の混合初代培養からマクロファージを分離するためにシンプルかつ効率的な方法

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

クッパー細胞は肝臓特異常駐マクロファージであると1-3肝臓の生理学的および病理学的機能において重要な役割を果たしている。肝臓のマクロファージの単離方法は4-6をよく説明されてきたが、これらのメソッドのほとんどは、遠心水簸機や技能などの高度な機器を、必要とする。模式的に図1に示すように、ここで、我々は、成体ラットの肝細胞の混合一次培養物から十分な数と純度で肝臓のマクロファージを取得するための新しい方法を提供する。 二段階灌流法7,8により肝細胞の解離した後、主に肝実質細胞で構成される画分を調製し、DMEM、10％FCS.Parenchymal肝細胞で構成される培地とT75組織培養フラスコに播種されると、上皮細胞の形態を失う文化の中で数日以内に、変性または線維芽細胞様細胞（図2）に変換する。位相コントラスト - 明るい6日目の周りの文化が進む、、として、ラウンドマクロファージ様細胞は、線維芽細胞シート（図2）で増殖し始める。マクロファージ様細胞の増殖は、フラスコの表面上に細胞シートをカバーする、継続すると一日約12最大レベルに達する。培養フラスコを振とうすることにより、マクロファージは、容易に培養培地中に懸濁させる。のような他の汚染細胞が中断されたままマクロファージ（図3）、の選択的接着のプラスチック製の皿の結果でその後の転送と短いインキュベーション。 PBSでいくつかのリンスした後、添付されたマクロファージが収穫されます。 10以上の6個の細胞が二週間以上（図3）をそれぞれ2〜3日間隔で同じT75組織培養フラスコから繰り返し収穫することができる。フローサイトメトリーにより評価として孤立マクロファージの純度は、95〜99パーセントだったかラットマクロファージ特異的抗体（図4）と免疫細胞化学は。分離した細胞は、LPSで刺激、との形成時にポリスチレンビーズのアクティブな食作用（図5）、組換えGM - CSFに対する増殖応答、​​炎症/抗炎症性サイトカインの分泌を示す多核巨細胞9。 結論として、我々は複雑な装置なしで十分な数と純度で肝臓のマクロファージを得るために簡単かつ効率的な方法を提供し、skills.This方法は、他の哺乳動物種に適用できるかもしれない。

ラット肝細胞の初代培養からマクロファージを取得するための新しい方法が記載されている。このメソッドは、プラスチック製の皿に選択的付着によって培養フラスコ及び精製の揺れが続く文化におけるマクロファージの増殖を、利用しています。この手法は、効率的に複雑な装置やスキルがなくても肝臓のマクロファージを提供します。

クッパー細胞は肝臓特異的な常在性マクロファージであり、肝臓の生理的および病理的機能において重要な役割を果たしている1-3。しかしながら、...

本実験の全体的な目的は、複雑な装置や技術を必要とせずに、ラット肝細胞の混合一次培養から複数のマクロファージ培養を得ることです。まず、コラゲナーゼ灌流によって成体ラットの肝細胞を解離させ、続いて実質細胞である肝細胞画分を分離します。次に、これらの細胞を増殖培地とともにT 75組織培養フラスコ内で培養し、肝細胞の混合一次培養を確立させます。その後10〜12日間培養し、培養フラスコを振盪してマクロファージをプラスチック皿に転移させ、短時間のインキュベーション後、選択的接着により回収します。最終的に、同一のT 75組織培養フラスコから、2〜3日おきに2週間以上にわたって、6個以上の細胞を繰り返し回収することが可能です。肝マクロファージの分離方法は十分に記述されています。しかしながら、従来の手法の多くは、遠心分画装置のような高度な設備や、熟練した技術的スキルを必要とします。本研究では、特別な設備や高度な実験スキルを必要とせず、成体の肝細胞の混合一次培養から十分な数と純度の肝マクロファージを得るための、簡便で新しい手法を提示します。動物の解剖、肝臓の灌流、および細胞の調製について、国立動物衛生研究所のNorco博士、山中博士、および吉岡美子博士によって実演します。次に、国立農業生物科学院のTaketo Takeno博士による、培養組織からの肝マクロファージの単離および精製について説明します。それでは始めましょう。ラット肝臓の灌流の準備として、まず洗浄液1瓶とコラゲナーゼ溶液1瓶を予熱してください。次に、皮膚をつまんで鎮静を確認した後、麻酔をかけた成体雄ラットをステンレス製パンに入れ、腹部と胸部に70% ethanolをスプレーします。続いて、解剖用はさみで腹部中央に小さな切開を加え、皮膚を剥離します。その後、はさみで腹腔を開き、門脈の位置を確認します。次に、門脈の下に手術用糸を通し、緩く締め付けます。続いて、肝臓への血液逆流を防ぐため、下大静脈の遠位端と腸間膜静脈を蚊式鉗子でクランプします。横隔膜をはさみで切開して胸腔を開き、心臓を露出させます。その後、眼科用はさみで門脈に小さな切開を加え、2 mmのプラスチックカテーテルを静脈内に挿入し、カテーテルの周囲で糸をしっかりと締め付けます。灌流システムに予熱した洗浄液を充填し、カテーテルに接続します。10 milliliters per minuteの速度でC twoの灌流を開始します。同時に、解剖用ハサミを用いて右心房壁を切開します。灌流を10分間継続し、その後、灌流液をコラゲナーゼ溶液に切り替えて10〜20分間灌流します。1分間あたり10 mLの速度で、滅菌ビーカーに25 mLのコラゲナーゼ溶液を満たします。次に、灌流した肝臓を取り出し、注意深くビーカーに入れます。ハサミを用いて肝臓を細かく刻みます。得られた細胞懸濁液に冷えたMEMを75 milliliters加えます。緩やかにピペッティングした後、懸濁液を100 micrometerのセルストレーナーでろ過します。未消化の組織断片から結合組織を除去するため、ろ液を50 mLコニカルチューブに回収します。ろ液を50 mLコニカルチューブに移し、まず4°Cで50 Gで1分間遠心分離して細胞を沈殿させ、この操作による洗浄を4回繰り返します。ブレーキをオフにした状態で上清を慎重に廃棄し、ペレットを冷えたMEMで再懸濁させ、最後の洗浄後に再度細胞を遠心分離して沈殿させます。肝細胞を増殖培地で再懸濁します。次に、細胞を5〜10本のT 75組織培養フラスコに、6.7 × 10⁴ cells/cm²の密度で播種します。培養フラスコをインキュベーターに入れ、2〜3日ごとに増殖培地を交換してください。1日間の培養後、実質肝細胞はフラスコ表面に広がり、1つまたは2つの円形核を持つ、典型的な多角形のコパル石状の形態を示します。培養後数日で、実質肝細胞は上皮細胞としての形態を失い、より扁平な線維芽細胞様細胞へと変化します。6日目頃になると、位相差顕微鏡下で明るく円形のマクロファージ様細胞が、線維芽細胞様細胞のシート上で増殖し始めます。マクロファージ様細胞の増殖は、12日目頃に最大レベルに達します。線維芽細胞シートが変性し始める19日目頃に、マクロファージ様細胞の数が減少します。そのため、培養7〜10日目頃に、細胞シート上で増殖したマクロファージを、培養フラスコを30分間交互に振盪して培養液中に懸濁させます。2本のT 75フラスコ分の中身を、100 mmの非組織培養グレードプラスチックディッシュにそれぞれ分注してください。培養フラスコに増殖培地を補充し、インキュベーターに戻します。培養期間終了後、プラスチックディッシュを30分間インキュベートし、培地を吸引してPBSで優しくすすぐ洗浄操作を3回行います。ここに示すように、マクロファージ様細胞を播種してから10分も経てば、これらの細胞はディッシュ表面に接着しますが、混入している他の線維芽細胞は懸濁したままとなります。PBSで洗浄することで、高純度なマクロファージ集団が得られます。この図に見られるように、細胞は40分間の培養後に典型的なマクロファージの形態となり、矢印で示されるように有糸分裂細胞が頻繁に観察されます。この新たに高純度化されたマクロファージ集団を回収するために、洗浄した細胞に1 mLのTrypLE Express溶液を加え、ディッシュをインキュベーターに戻してさらに10分間静置します。このインキュベーション後、9 mLの増殖培地を加え、セルスクレーパーで付着したマクロファージをやさしく剥離させて15 mLコニカルチューブに移し、遠心分離して上清を捨てます。1 mLの増殖培地を加え、激しくピペッティングすることで再懸濁した細胞塊を単一細胞へと分散させ、このグラフに示すように血球計数器を用いて細胞数を計測します。T 75培養フラスコから2〜3日おきに繰り返し回収することで、2週間以上にわたり10^6個以上の細胞を回収でき、T 75培養フラスコ1本あたり合計10^7個の細胞収量を得ることが可能です。これらの画像に示すように、単離された細胞は、CD 68またはED 1、およびCD 1 72 AまたはOX 41などのラットマクロファージ抗原に対するモノクローナル抗体で免疫染色されています。これらの細胞は、FITC標識マイクロビーズの能動的な食作用など、マクロファージとしての機能的特性を有していました。本ビデオでは、成体赤肝細胞の混合一次培養からマクロファージを得るための、シンプルで効率的な手法を提示しました。本手順は複雑な装置や技術を必要としませんが、同一のブラス培養から繰り返し回収可能な、十分な数の純粋なマクロファージを提供します。この手法は、他の哺乳類種にも適用可能です。ビデオをご視聴いただきありがとうございました。今後の実験の成功をお祈りしております。それでは。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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低酸素環境下におけるヒトのマクロファージ偏光のプロテオーム解析

ここでは、HIVに感染した個体および健全なコントロールからヒト一次単球を分離、培養、トランスフェクション、および区別するための最適化されたプロトコルです。...

原発性ヒト単球の単離、トランスフェクション、培養

このプロトコルは、生きている、大人、人間の脳組織から原発ミクログリアを単離する効率的で費用対効果が高く、堅牢な方法です。孤立した原発性ヒトミクログリアは、恒常性および疾患における細胞プロセスを研究するためのツールとして役立つ。...

成人ヒト脳組織からのヒトミクログリアの取得

本プロトコールは、マウスからの骨髄由来マクロファージの単離および培養について記載している。...

マウス由来骨髄由来マクロファージの単離と培養

ここでは、3次元(3D)コラーゲンIマトリックス中の初代ヒト単球由来マクロファージと腫瘍スフェロイドとの相互作用を調査するためのプロトコルを提示し、微小環境の可溶性および物理的特性が細胞浸潤に与える影響を比較する可能性を示します。...

マクロファージ-腫瘍スフェロイド共浸潤アッセイ

学ぶ ラット肝細胞の混合初代培養からマクロファージを分離する簡便な方法。コラゲナーゼ灌流と選択的付着を用いて、複雑な装置なしに高純度のマクロファージを繰り返し収集できます。

成人肝細胞の混合初代培養からマクロファージを分離するためにシンプルかつ効率的な方法

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