成人肝細胞の混合初代培養からマクロファージを分離するためにシンプルかつ効率的な方法

本実験の全体的な目的は、複雑な装置や技術を必要とせずに、ラット肝細胞の混合一次培養から複数のマクロファージ培養を得ることです。まず、コラゲナーゼ灌流によって成体ラットの肝細胞を解離させ、次いで実質肝細胞分画を単離することでこれを達成します。その後、細胞を増殖培地とともにT 75組織培養フラスコ内でインキュベートし、肝細胞の混合一次培養を確立させます。

その後10〜12日間培養し、培養フラスコを揺らしてマクロファージをプラスチックディッシュに転移させます。その後、短時間のインキュベーションを経て、選択的接着によりマクロファージを回収します。最終的に、1つのT 75組織培養フラスコから、2〜3日おきに2週間以上にわたって繰り返し、10個以上の細胞を回収することが可能です。肝マクロファージの単離方法は十分に記載されています。

しかしながら、従来の手法の多くは、遠心分画装置のような高度な設備や、洗練された技術的なスキルを必要としていました。本手法では、特別な設備や高度な実験スキルを必要とせず、成体ラットの肝細胞の混合一次培養から、十分な数と純度の肝マクロファージを得るための簡便かつ斬新な方法を提示します。動物の解剖、肝臓の灌流、および細胞の調製について、国立動物衛生研究所のNorco博士、山中博士、および吉岡美子博士によって実演されます。

次に、国立農業生物科学院の竹野武人博士によって、培養組織からの肝マクロファージの単離および精製について解説します。それでは始めましょう。ラット肝臓の灌流準備として、まず洗浄液1瓶とコラゲナーゼ溶液1瓶を予熱します。

次に、皮膚をピンチして鎮静を確認した後、麻酔をかけた成体雄ラットをステンレス製パンに置き、腹部と胸部に70% ethanolをスプレーします。続いて、解剖用ハサミで腹部中央に小さな切開を加え、皮膚を剥がします。その後、ハサミで腹部を開き、門脈の位置を確認します。

次に、外科用縫合糸を門脈の下に通し、ゆるく締め付けます。続いて、肝臓への血液逆流を防ぐため、下大静脈の遠位部と腸間膜静脈をモスキートクランプで的に遮断します。ハサミで横隔膜を切開して胸腔を開き、心臓を露出させます。その後、眼科用ハサミで門脈に小さな切開を加え、2 mmのプラスチックカテーテルを静脈内に挿入し、カテーテルの周囲で縫合糸をしっかりと締め付けます。

あらかじめ加温した洗浄液を灌流システムに充填し、それをカテーテルに接続します。10 milliliters per minuteの速度でC twoの灌流を開始します。同時に、解剖用ハサミを用いて右心房壁を切開します。

さらに10分間灌流を続け、その後、灌流液をコラゲナーゼ溶液に切り替えて10～20分間灌流します。1分間に10 mLの速度で、滅菌ビーカーに25 mLのコラゲナーゼ溶液を満たします。次に、灌流した肝臓を取り出し、慎重にビーカーに入れます。

ハサミを用いて肝臓を小さく切断します。得られた細胞懸濁液に、冷やしたMEMを75 milliliters加えます。緩やかにピペッティングした後、懸濁液を100 micrometerのセルストレーナーでろ過します。

未消化の組織片から結合組織を除去するために、ろ液を50 mLコニカルチューブに回収します。ろ液を50 mLコニカルチューブに移し、まず4 °Cで50 G、1分間遠心分離して細胞を沈殿させ、この洗浄操作を4回繰り返します。ブレーキをオフにして慎重に上清を捨て、ペレットを冷えたMEMで再懸濁させ、最後の洗浄後に再び細胞を遠心分離して沈殿させます。

肝細胞を増殖培地で再懸濁します。次に、細胞を5〜10本のT 75組織培養フラスコに、6.7 × 10⁴ cells/cm²の密度で播種します。培養フラスコをインキュベーターに入れ、2〜3日ごとに増殖培地を交換してください。

1日間の培養後、実質肝細胞はフラスコの表面に広がり、1つまたは2つの円形核を持つ、典型的な多角形のコパルストーン様形態を示します。培養開始から数日以内に、実質肝細胞は上皮細胞としての形態を失い、より扁平な線維芽細胞様細胞へと変化します。6日目あたりから、位相差顕微鏡下で明るく円形のマクロファージ様細胞が、線維芽細胞様の細胞シート上に増殖し始めます。マクロファージ様細胞の増殖は、12日目あたりに最大レベルに達します。

線維芽細胞シートが変性とし始める19日目あたりに、マクロファージ様細胞の数は減少します。そのため、培養から7〜10日後、細胞シート上で増殖したマクロファージを、培養フラスコを30分間交互に振盪して再懸濁し、培養液中に回収します。2本のT 75フラスコから回収した培養液を、100 mmの非組織培養用プラスチック皿にそれぞれ分注します。

培養フラスコに増殖培地を補充し、インキュベーターに戻します。インキュベーション期間の後、プラスチックディッシュを30分間インキュベートし、培地を吸引してPBSでプラスチックディッシュを穏やかにすすぐ洗浄操作を3回繰り返します。ここで示すように、マクロファージ様細胞を播種してから10分も経過すれば、これらの細胞はディッシュ表面に接着し、一方で混入している線維芽細胞は浮遊状態のままとなります。PBSによる洗浄後、高度に精製されたマクロファージ集団が得られます。

この図に見られるように、細胞は40分間の培養後に典型的なマクロファージの形態を呈し、矢印で示されているように分裂細胞が頻繁に観察されます。この新しく高度に精製されたマクロファージ集団を回収するため、洗浄後の細胞に1 mLのTrypLE Express溶液を加え、ディッシュをインキュベーターに戻してさらに10分間静置します。このインキュベーション後、9 mLの増殖培地を加え、セルスクレーパーで付着したマクロファージを穏やかに剥離し、15 mLのコニカルチューブに移して遠心分離し、上清を除きます。

1 mLの増殖培地を加え、激しくピペッティングすることで再懸濁された細胞塊を単一細胞に解離させ、このグラフに示すようにヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。T 75培養フラスコから、2〜3日おきの間隔で2週間以上にわたって繰り返し、6×10⁷個以上の細胞を回収することができ、T 75培養フラスコ1本あたり合計10⁷個の細胞収量を得ることが可能です。これらの画像に示されているように、単離された細胞は、CD 68またはED 1、およびCD 1 72 AまたはOX 41などのラットマクロファージ抗原に対するモノクローナル抗体で免疫染色されています。これらの細胞は、FITC標識マイクロビーズの能動的な食作用など、マクロファージとしての機能的特性を有していました。

このビデオでは、成体の赤色肝細胞の混合一次培養からマクロファージを得るための、シンプルで効率的な方法を紹介しました。本手法は複雑な装置や技術を必要とせず、同一の培養系から繰り返し回収可能な、十分な数の純粋なマクロファージを提供します。この方法は、他の哺乳類種にも適用可能です。

ビデオをご視聴いただきありがとうございました。今後の実験の成功をお祈りいたします。