細胞の成熟せずに樹状細胞の効率的なトランスフェクションに最適化されたプロトコル

この手順の全体的な目標は、SI RNAトランスフェクションによってDCSにおける標的遺伝子発現をノックダウンすることです。これは、最初に AM Maxin Nucleo エフェクターをプログラミングすることで実現されます。手順の2番目のステップは、DCSとsiRNAを混合し、得られた細胞溶液をNucleo QVEモジュールにピペットで移すことです。

手順の3番目のステップは、プレートをamaxaシャトルトレイに配置してトランスフェクションプロセスを開始することです。手順の最後のステップは、細胞にウイルスを感染させてインターフェロン応答を活性化することです。最終的には、定量的なR-T-P-C-Rおよびウェスタンブロッティングを通じて遺伝子のノックダウンを示す結果を得ることができます。

この技術は、樹状突起細胞のシグナル伝達経路を特徴付けるために価値があり、樹状突起細胞ベースの免疫療法の開発に貢献する可能性があります。Maxon 96ウェルシャトル核因子をDCトランスフェクション用にプログラムするには、新しいパラメータファイルを開きます。標準トランスフェクションに使用するウェルの数を選択するには、カーソルを96ウェルプレートダイアグラム上にドラッグします。

各実験サンプルのプールには、最低3つのウェルを使用します。次に、パート1にプログラムコードを入力し、F、F、およびiパート2を選択し、プルダウンメニューから1 68を選択します。次に、ソリューションボックスから、制御オプションで次に単球ヒトを選択し、標準を選択し、適用をクリックします。

トランスフェクションなしコントロールを含めるには、ダイアグラムから追加のウェルを選択する必要があります。次に、制御オプションから[プログラム制御なし]を選択し、もう一度[適用]をクリックします。核酸の愛情液を混合した後、室温まで温めます。

必要な数の nucleo vete モジュールをここに示すように正しい向きで nucleo VETE プレートにセットし、最初のモジュールをローズ 1 と 2 に挿入し、次に後続のすべてのチューブに挿入します。トランスフェクションのためにウェルあたり500, 000個の細胞を持つために、細胞培養フラスコから50ミリリットルのチューブに十分なDCSを移し、細胞を摂氏4度で400Gで10分間遠心分離し、次いで上清を慎重に除去する。次に、チューブに核愛情溶液を加え、数回ピペッティングしてDCSを再懸濁します。

次に、実施する特定の処理に従ってDPHチューブを標識し、再懸濁した細胞を標識したチューブに分割します。SI RNAを最終濃度0.25マイクログラム/500, 000細胞で適切なエピエンドルフチューブに添加し、次いでピペッティングで細胞懸濁液を混合する。トランスフェクションなしのコントロールサンプルには、非標的SI RNAを使用してください。

次に、以前にプログラムされた実験レイアウトに従って、20マイクロリットルのSI RA DC細胞懸濁液を核燃焼モジュールにピペットで移動させ、液体がウェルの底に供給されることを確認して、核燃焼プレートを蓋で覆い、プレートを硬い表面に数回軽くたたいて、気泡の除去を促進してDCをトランスフェクションします。調製したヌクレオイベットプレートをヌクレオエフェクター96ウェルシャトルトレイに挿入します。次に、[アップロードして開始]ボタンをクリックします。

トランスフェクションプロセスの進行状況をディスプレイで追跡します。緑の背景に黒い十字は、その井戸でのトランスフェクションが成功したことを示し、赤い背景に黒いバーは、細胞がトランスフェクションされている間に失敗したことを意味します。プレウォームDC増殖培地 トランスフェクションプロセスが完了したら、プレートを取り外し、各ウェルに80マイクロリットルのプレウォームDC増殖培地を加えます。

マルチチャンネルピペットを使用して、プレートを摂氏37度、CO2 5%で10分間インキュベートします。インキュベーション期間中に、100マイクロリットルのプレウォームDC成長培地を、セットアップした核キュベットプレートと同じ向きでマトリックスチューブに加えます。インキュベーション期間後、細胞懸濁液の100マイクロリットルすべてを核CVEから事前に調製されたマトリックスチューブに移します。

次に、トランスフェクションが起こらなかったチューブを取り外して廃棄します。最後に、マトリックスチューブを24時間またはその他の所望の時間間隔でインキュベートします。インキュベートマトリックスチューブのそれぞれにeinor tubeを標識します。

次に、マトリックスチューブをインキュベーターから細胞培養フードに移し、各実験サンプルのマトリックスチューブを事前に標識されたeend dfsにプールします。次に、eend DPHチューブを卓上遠心分離機で10分間回転させることにより、細胞を穏やかにペレット化します。400 Gで、スナットを取り外し、ニューカッスル病ウイルスまたはNDVを含む無血清増殖培地に細胞をMOI1で緩く再懸濁します。

エピエンドルフィンを無菌状態で覆い、チューブを45分間インキュベートします。このインキュベーション期間の後、900マイクロリットルのDC増殖培地を追加し、チューブをさらに8〜10時間再インキュベートします。トランスフェクションされ感染したdcを収穫するため。

前と同様に卓上遠心分離機でeinorチューブを回転させることにより細胞をペレット化し、スナット単球dcsを除去し、IRNAを標的とするRIG Iまたは非特異的グローirnaのいずれかでトランスフェクションし、プラス記号で示されるようにNDVに感染したか、または定量的R-T-P-C-R-Aによって検出されたようにマイナス記号で示されるように非感染のままであったR RGAのノックダウン75%転写レベルでは、の発現における同様の減少が観察された。インターフェロンベータ。インターフェロンシグナル伝達カスケードにおけるRGAの下流エフェクターも観察されました。さらに、非感染対照トランスフェクト細胞におけるインターフェロンベータの発現は検出されませんでした。

一方、MXAおよびインターフェロンベータダウンストリーム応答遺伝子のそれは最小限でした。ここは。この実験では、前の図のように irna を標的とした rigi を用いた DCS の 2 回目のトランスフェクションのデータが示されています。しかし、すべての細胞がNDVに感染しており、未切除の単球DCSを用いた追加のコントロールが組み込まれた。

遺伝子サイレンシングの結果は、前の図で観察された結果と同様でした。RGAについてプローブしたウェスタンブロットにより、この遺伝子のタンパク質発現が完全にブロックされていることが明らかになりました。レーン 1 と 2 は、未切除細胞のライセートのデータを示しています。

レーン3と4はグローirnaトランスフェクション細胞からのライセートを示し、レーン5とレーン6はS irnaを標的とするRIG Iでトランスフェクションされた細胞からのライセートを示しています 一度習得すると、この技術は1時間で完了し、多くの遺伝子を同時にノックダウンすることができます。