器官培養における神経雪崩のマルチ電極アレイの録音

この実験の目標は、健康な脳活動が神経細胞の雪崩に自己組織化し、皮質の臨界状態ダイナミクスの特徴を研究することです。これは、冠状層状皮質スライスと中脳スライスを組み合わせることによって達成され、これは皮質に発達的に重要なドーパミン作動性入力を提供します。第2のステップとして、Cortex中脳共培養はマルチ電極アレイ上で増殖し、培養中のニューロン活動のマルチサイト刺激と記録を可能にします。

次に、最初の1〜2週間は、カスタム設計のインキュベーターで共培養物を平らにし、膨張させ、MEA表面に付着させます。これにより、通常の空気と培養物にさらされることで培養物が循環します。ニューロンの雪崩に突入する時空間的な局所電位の自発的な自己組織化を示す流体結果が得られます。MEAの記録とオフラインの雪崩解析に基づいており、雪崩サイズのべき乗則を特定します。

この手法が、dis associated culturesなどの既存の方法よりも優れている主な利点は、そのシステム、神経科学の側面です。私たちは多くの脳領域を一緒に共培養することができ、これらの多領域培養は、皮質層や投影システムなどの大きなスケールで正しい脳組織を確立します。この手法の応用は、ニューロノ雪崩の研究にとどまりません。

例えば、精密に制御されたin vitro条件下で、ネットワークレベルで応答する刺激を研究することができます。血漿トロンビン混合物の適切な適用とMEA上の組織の配置を学ぶのが難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。これらの手順には、適切なタイミング、適切な温度勾配、およびデリケートなMEA表面に直接触れないようにする必要があります。

録音用の滅菌シール可能なガラスチャンバーを準備するには、まず、ねじ山の底から約2ミリメートルのところにテフロンプラスチックキャップでねじ山ガラスシリンダーを切断します。これらは、培養チャンバーをしっかりと閉鎖するために必要です。次に、ガラスリングを水で3回すすぎ、200プルーフのエチルアルコールで5分間沸騰させて洗浄します。

これらを乾燥させるために脇に置いておきます シリコン溶液 ガラスリングをMEA表面に取り付けるために必要です。セルガード180 4シリコンエラストマーキットを使用し、パーツAとBの15ミリリットルを十分に混合します。その後、15分間座って気泡を取り除きましょう。

溶液を1ミリリットルのEloquaに分け、将来の使用のために摂氏マイナス20度で保管します。次に、小さなゲージ針が付いた注射器で摂氏23度で1ミリリットルのシリコンを採取し、ガラスリングの研磨されていない切断面に適用することにより、ガラスリングをMEAに接着します。次に、ガラスリングをMEAの中央に配置し、リングの外側にシリコンの層を追加して、より強力なシールを実現します。

これをホットプレートで摂氏約60度で1〜2時間硬化させます。次に、最後のすすぎのために70%アルコールで3回よりも脱イオン水で3回すすいで、薄層流フードの下のMEAチャンバーとチャンバーキャップを滅菌します。チャンバーをアルコールに10分間置いておきます。

これに続いて、チャンバーとキャップの内部を10分間UV光にさらします。摂氏120度で45分間オートクレーブします。滅菌したら、これらを乾かします。

次に、培養チャンバー内のMEA表面をポリDリジンでコーティングします。この実験で使用された新しい測定は、どちらかというと親油性であるため、液滴を繰り返してコーティングします。電極グリッドからの溶液の吸引。

キャップを取り付けて、保管および将来の使用のためにMEAチャンバーをシールします。この手順では、約12の共培養のための皮質およびVTA切片をもたらし、健康な出生後1〜2日の動物を使用して無菌条件下で薄層流フード内で実施されるべきであり、組織収集のための合計時間は1時間未満であるべきである。斬首後、最初に頭皮から皮膚を取り除くために2つの横はさみの切り傷を作ることにより、脳の除去を開始します。

頭蓋骨を取り外してから、細かいアイハサミを使用して頭蓋骨を切り開き、皮質小脳接合部で1つの冠状に1つの矢状正中線をカットします。これらの4つの頭蓋骨フラップをすべて裏返して、脳を露出させます。次に、尖ったヘラで、嗅球を通して正面に切ります。

次に、へらを脳の下に四半期ごとに進めます。脳を頭蓋骨からそっと持ち上げ、冷静な視線に滑り込ませます。急速冷却と一時保管のためのソリューション。

さらに2つの脳について上記の手順を繰り返します。VTA組織を採取するには、脳を滅菌済みの乾燥シャーレに移します。小さなヘラを使って、各脳を約1cm横にそっとスライドさせて余分な水分を取り除きます。

次に、かみそりの刃を使用して、小脳のレベルで冠状垂直に切り込むことにより、脳幹を取り除きます。次に、寒天ブロックを取り付けディスクに接着して、スライス手順中に脳を機械的に安定させます。次に、ディスク上の寒天ブロックの数ミリメートル前に瞬間接着剤の細い線を置きますが、小さなヘラを使用して接着剤が寒天に触れないようにします。

各脳の前頭ポールを下にして移して取り付けます。正面のポールが取り付けディスクに接着されていること、および腹側の側面が接着剤の残留物なしで寒天に接触していることを確認します。これにより、切断中の適切な機械的安定化が保証され、切断スライスの持ち上げが容易になります。

次に、マウントディスクを慎重に沈め、マウントされた脳を冷やした視線溶液で満たされたビブラムトレイに固定します。次に、慎重に洗浄されたかみそりの刃で、吸引バルブ付きの倒立パスタピペットを使用して、中脳の400マイクロメートルの厚さの冠状切片を最高振動周波数と比較的低い前進速度で切断し、VTAを含むスライスを収集して、皮質切片用の滅菌冷視液で満たされた35 x 10ミリメートルのペトリ皿に移します。前のスライス手順を繰り返しますが、皮質と小脳の間に垂直の切り込みを入れ、前頭ポールを上にして4つの脳を取り付けます。

線条体の高さから始めて、厚さ350マイクロメートルの冠状スライスを約3つ集めます。次に、壊れたカミソリの刃で作られたマイクロナイフを使用して、前頭皮質とVTAを含む中脳領域の幅約2ミリメートルの冠状部分を実体顕微鏡で解剖します。ティッシュ切片を冷やした視線溶液で満たされた小さな皿に別々に集めます。

MEAチャンバーの最初の位置に組織をマウントするには、電極アレイに焦点が合った状態で室温でMEAを実体顕微鏡下に置きます。次に、25マイクロリットルのプラズマ液滴を、清潔でほこりのない無菌の電極アレイマトリックスの中央に配置します。小さなヘラを使用して、皮質とVTAセクションを血漿液滴に慎重にスライドさせます。

次に、MEAを冷却プレートに置き、ビューの焦点を合わせ直します。これを約15秒間冷やしてから、血漿液滴に25マイクロリットルのトロンビンを追加します。.次に、トロンビンピペットチップを使用して、血漿トロンビン混合物をMEA全体に小さな円運動で慎重に広げます。

脆性電極アレイに直接触れないように注意してください。次に、背側の境界をアレイの2番目の電極列に沿って、皮質をアレイ上に静かに配置します。このようにして、発達中の表層は最終的にアレイの残りの部分をカバーします。

次に、VTAを皮質セクションの腹側境界に隣接して配置します。次に、MEAチャンバーにキャップをしてゆるく閉じ、高湿度を維持します。MEA培養アセンブリを室温でフード内に約6分間置いて、血漿トロンビン、凝固、高揚を可能にします。

その間に、この手順を繰り返して、さらに3つの培養物を準備します。次に、小さな液滴で、25×5の8分の1ゲージの針が付いた1ccのシリンジを使用して、600マイクロリットルの培地を培養室に慎重に加えます。次に、MEAチャンバーをしっかりと閉じ、MEA培養アセンブリをインキュベーター内のロッキングストレージトレイに置きます。

2日後、in vitroで、10マイクロリットルの有糸分裂阻害剤を追加します。その後、in vitroで4日間、その後は4日ごとに培地を60%更新します。通常の成長時には、培養物は大幅に平らになり、わずかに背側に拡大します。

表在皮質層の発達により、健康な培養物は明視野中のその不透明な灰色がかった組織によって識別されます。逆に、明るい反射小胞は、培養物を準備してから約10〜12日後に死んだ変性細胞の特徴であり、記録と刺激の準備が整います。録音セッションを開始するために、MEAはストレージトレイから録音ヘッドステージに転送されます。

ローカル電界電位(LFP)を記録するには、1〜200ヘルツのバンドパスフィルタを使用します。マルチユニット活性は、300〜3000ヘルツのバンドパスフィルターを使用して研究することもできます。健康的な自発的な活動は、さまざまなサイズと期間のバーストで発生する傾向があります。

LFPとユニットアクティビティの関係を研究するために、LFPのスパイクトリガー平均を計算する場合があります。これらの皮質培養では、負のLFP偏向はニューロンのスパイクと相関し、刺激誘発活動を記録します。まず、刺激の時間波形と振幅を、刺激発生器を制御するソフトウェアで指定します。

有用な刺激パラダイムは、バイポーラ方形波を持つ電流制御電荷中性シングルショックです。次に、刺激を送達するために使用される電極が選択されます。典型的な刺激誘発LFP反応は、自発的な活動バーストと同様に現れます。

ブランキング回路は、刺激中にアンプを切断して、刺激アーチファクトを減らし、アンプの飽和を防ぎます。刺激電極は、刺激から回復するのに数秒かかるため、応答活動の記録には使用できません。MEAでは、1つの電極での活動を伴う時空間クラスターに出現する傾向があり、多くの場合、他の場所での活動を伴います。

同時に、このような活動期間中のLFPの典型的な波形は、各クラスタに対して数秒間隔で発生する3つのクラスタを重ねてプロットすることによってここに示されています。複数の負のSDの閾値を超えるNLFPピークを抽出すると、1秒以内に複数の電極で負のLFP偏向が見られ、NLFPピーク時間の形での活動は、ドットの列がさまざまな電極でほぼ一致するNPSを表すRastaで便利に視覚化されます。この活動の時空間的な構成はかなり複雑です。

低い時間分解能で多かれ少なかれ均質に見える列は、高い時間分解能では別々のクラスタで構成されます。宇宙クラスター、GEOTEMPORAL クラスター、LFP クラスターの出現は、皮質ネットワークで高度に組織化されています。より具体的には、組織はニューロンの雪崩に対して異なるスケールです。

これは、特定の時間分解能でのクラスター サイズの確率を計算することによって実証されます。Delta T.Here クラスターは、同じまたは連続する時間ビンで発生する NL FPS で構成され、そのようなクラスターのサイズがクラスターあたりの NFPS の合計数またはクラスターあたりの積分された NLFP 振幅で表され、クラスター サイズ分布は、指数がマイナス 1.5 に近いべき乗則を明らかにします。このビデオを見れば、神経活動の自己組織化を研究するために、脳組織を慎重に解剖し、多電極アレイ上で培養する方法を十分に理解できるはずです。

これらの方法は、皮質ネットワークにおける自発的活動と刺激誘発活動との関係を研究するためにも使用されています。