Name: 器官培養における神経雪崩のマルチ電極アレイの録音 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 1 s
Description: 学ぶ 神経雪崩の自己組織化をマルチ電極アレイを用いた大脳皮質と中脳の共培養システムで観察する方法。この技術は神経ネットワークの動態と臨界状態を理解する上で重要である。

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この研究は、国立精神衛生研究所、国立衛生研究所の学内研究プログラムの部門（DIRP）によって賄われていた。

<ol><li>Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activity+in+early+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical activity in early neuronal development.</a> Nature. 444, 707-712 (2006).</li>
<li>Beggs, J. M., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+avalanches+in+neocortical+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal avalanches in neocortical circuits.</a> J. Neurosci. 23, 11167-11177 (2003).</li>
<li>Beggs, J. M., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+avalanches+are+diverse+and+precise+activity+patterns+that+are+stable+for+many+hours+in+cortical+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal avalanches are diverse and precise activity patterns that are stable for many hours in cortical slice cultures.</a> J Neurosci. 24, 5216-5229 (2004).</li>
<li>Stewart, C. V., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted-U+profile+of+dopamine-NMDA-mediated+spontaneous+avalanche+recurrence+in+superficial+layers+of+rat+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inverted-U profile of dopamine-NMDA-mediated spontaneous avalanche recurrence in superficial layers of rat prefrontal cortex.</a> J. Neurosci. 26, 8148-8159 (2006).</li>
<li>Stewart, C. V., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostasis+of+neuronal+avalanches+during+postnatal+cortex+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Homeostasis of neuronal avalanches during postnatal cortex development in vitro.</a> J. Neurosci. Meth. 169, 405-416 (2007).</li>
<li>Gireesh, E. D., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+avalanches+organize+as+nested+theta-+and+beta%2Fgamma-oscillations+during+development+of+cortical+layer+2%2F3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal avalanches organize as nested theta- and beta/gamma-oscillations during development of cortical layer 2/3.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 7576-7581 (2008).</li>
<li>Petermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+cortical+activity+in+awake+monkeys+composed+of+neuronal+avalanches%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Spontaneous cortical activity in awake monkeys composed of neuronal avalanches.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 15921-15926 (2009).</li>
<li>Kinouchi, O., Copelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+dynamical+range+of+excitable+networks+at+criticality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Optimal dynamical range of excitable networks at criticality.</a> Nature Physics. 2, 348-351 (2006).</li>
<li>Shew, W. L., Yang, H., Petermann, T., Roy, R., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+avalanches+imply+maximum+dynamic+range+in+cortical+networks+at+criticality%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal avalanches imply maximum dynamic range in cortical networks at criticality.</a> J. Neurosci. 29, 15595-15600 (2009).</li>
<li>Shew, W. L., Yang, H., Yu, S., Roy, R., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+capacity+is+maximized+in+balanced+cortical+networks+with+neuronal+avalanches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Information capacity is maximized in balanced cortical networks with neuronal avalanches.</a> J Neurosci. 5, 55-63 (2011).</li>
<li>Karpiak, V., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+maintenance+of+organotypic+cultures+for+multi-electrode+array+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preparation and maintenance of organotypic cultures for multi-electrode array recordings.</a> Current Protocols in Neuroscience. 1, 6-6 (2002).</li>
<li>Hammerle, H., Egert, U., Mohr, A., Nisch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+recording+in+neuronal+networks+with+substrate+integrated+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Extracellular recording in neuronal networks with substrate integrated microelectrode arrays.</a> Biosens. Bioelectron. 9, 691-696 (1994).</li>
<li>Nisch, W., Bock, J., Egert, U., Hammerle, H., Mohr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin+film+microelectrode+array+for+monitoring+extracellular+neuronal+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A thin film microelectrode array for monitoring extracellular neuronal activity in vitro.</a> Biosens. Bioelectron. 9, 737-741 (1994).</li>
<li>Egert, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+organotypic+long-term+culture+of+the+rat+hippocampus+on+substrate-integrated+multielectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays.</a> Brain Res. Protoc. 2, 229-242 (1998).</li>
<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+J+%22Atlas+of+Prenatal+Rat+Brain+Development%22">Atlas of Prenatal Rat Brain Development</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1995).</li>
<li>Clauset, A., Shalizi, C. R., Newman, M. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power-law+distributions+in+empirical+data%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Power-law distributions in empirical data.</a> arXiv. , (2009).</li>
<li>Plenz, D., Thiagarajan, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organizing+principles+of+neuronal+avalanches%3A+cell+assemblies+in+the+cortex%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The organizing principles of neuronal avalanches: cell assemblies in the cortex?</a> Trends Neurosci. 30, 101-110 (2007).</li>
<li>Cäser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+development+of+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex.</a> Exp. Brain Res. 477, 234-244 (1989).</li>
<li>Cäser, M., Schüz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+neurons+in+neocortical+slice+cultures.+A+light+and+electron+microscopic+study+on+in+situ+and+in+vitro+material%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hirnforsch%22%5BJournal%5D)">Maturation of neurons in neocortical slice cultures. A light and electron microscopic study on in situ and in vitro material.</a> J. Hirnforsch. 33, 429-443 (1992).</li>
<li>Götz, M., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+vasoactive+intestinal+polypeptide+%28VIP%29-containing+neurons+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Development of vasoactive intestinal polypeptide (VIP)-containing neurons in organotypic slice cultures from rat visual cortex.</a> Neurosci. Lett. 107, 6-11 (1989).</li>
<li>Götz, M., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+Preservation+of+cortical+layers+in+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Formation and Preservation of cortical layers in slice cultures.</a> J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).</li>
<li>Bolz, J., Novak, N., Götz, M., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+target-specific+neuronal+projections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation of target-specific neuronal projections in organotypic slice cultures from rat visual cortex.</a> Nature. 346, 359-362 (1990).</li>
<li>Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+specific+afferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus.</a> J. Neurosci. 12, 3054-3070 (1992).</li>
<li>Novak, N., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+specific+efferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus+and+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formation of specific efferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus and superior colliculus.</a> Eur. J. Neurosci. 5, 15-24 (1993).</li>
<li>Plenz, D., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+dynamics+in+cortex-striatum+co-cultures.+I.+Anatomy+and+electrophysiology+of+neuronal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural dynamics in cortex-striatum co-cultures. I. Anatomy and electrophysiology of neuronal cell types.</a> Neurosci. 70, 861-891 (1996).</li>
<li>Plenz, D., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+dynamics+in+cortex-striatum+co-cultures.+II.+Spatio-temporal+characteristics+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal dynamics in cortex-striatum co-cultures. II. Spatio-temporal characteristics of neuronal activity.</a> Neurosci. 70, 893-924 (1996).</li>
<li>Plenz, D., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cortex-striatum-mesencephalon+cultures%3A+the+nigro-striatal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Organotypic cortex-striatum-mesencephalon cultures: the nigro-striatal pathway.</a> Neurosci. Lett. 209, 177-180 (1996).</li>
<li>Plenz, D., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up%27+and+%27down%27+states+in+striatal+medium+spiny+neurons+simultaneously+recorded+with+spontaneous+activity+in+fast-spiking+interneurons+studied+in+cortex-striatum-substantia+nigra+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Up' and 'down' states in striatal medium spiny neurons simultaneously recorded with spontaneous activity in fast-spiking interneurons studied in cortex-striatum-substantia nigra organotypic cultures.</a> J. Neurosci. 18, 266-283 (1998).</li>
<li>Plenz, D., Herrera-Marschitz, M., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+organization+of+the+globus+pallidus-subthalamic+nucleus+system+studied+in+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Morphological organization of the globus pallidus-subthalamic nucleus system studied in organotypic cultures.</a> J. Comp. Neurol. 397, 437-457 (1998).</li>
<li>Plenz, D., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+basal+ganglia+pacemaker+formed+by+the+subthalamic+nucleus+and+external+globus+pallidus+%5Bsee+comments%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A basal ganglia pacemaker formed by the subthalamic nucleus and external globus pallidus [see comments].</a> Nature. 400, 677-682 (1999).</li>
<li>Plenz, D., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+high-frequency+oscillations+in+local+circuits+of+rat+somatosensory+cortex+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Generation of high-frequency oscillations in local circuits of rat somatosensory cortex cultures.</a> J Neurophysiol. 76, 4180-4184 (1996).</li>
<li>Klostermann, O., Wahle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+spontaneous+activity+and+morphology+of+interneuron+types+in+organotypic+cortex+and+thalamus-cortex+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Patterns of spontaneous activity and morphology of interneuron types in organotypic cortex and thalamus-cortex cultures.</a> Neurosci. 92, 1243-1259 (1999).</li>
<li>Cowan, R. L., Wilson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+firing+patterns+and+axonal+projections+of+single+cortico-striatal+neurons+in+the+rat+medial+agranular+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous firing patterns and axonal projections of single cortico-striatal neurons in the rat medial agranular cortex.</a> J. Neurophysiol. 71, 17-32 (1994).</li>
<li>Porter, L. L., Rizzo, E., Hornung, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+affects+parvalbumin+expression+during+cortical+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine affects parvalbumin expression during cortical development in vitro.</a> J Neurosci. 19, 8990-9003 (1999).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

1。技術的な問題： <ol><li> 無菌テクニック。多国間環境協定と文化の準備の準備はすべて無菌条件下で層流フード内で実行されます。神経活動に影響を与える抗生物質は、準備および文化プロセス中にいつでも使用されていません。 </li><li> MEA上のMEA。組織の生存上のプラズマ/トロンビン凝固や組織の付着は、プラズマ/トロンビン凝固及び大気への組織暴露の時に必要な時間の間で注意深くバランスを取る必要。大気中に長時間暴露は、組織の変性をトリガしながら短い凝固時間は、MEAからセクションの早期の剥離をリスク。トロンビン溶液の強さは、凝固プロセスの速度を決定するので、それは成功したMEAの表面に、健全な文化を取り付けるための非常に重要なパラメータです。我々は、1000単位（; 1 NIHのユニット= 0.324 ± 0.073 mgの1,000個ロット）を使用して最良の結果を得る。重要なことは、培養中にプラズマ破裂を促進する空間的に不均質凝固におけるプラズマ/トロンビン溶液の結果の不完全混合。これらのプラズマ&quot;の穴は&quot;深刻な文化の健康に影響を与えると微小電極から文化を切り離し、それによって電気生理学的記録の品質を損なう。 MEA /組織の組み立て時の冷却板での作業凝固を遅らせ、プラズマ/トロンビンソリューションおよび組織切片の適切な配置の均質な混合が可能になります。 同様に、凝固のわずか5分後に水没文化に培養チャンバーに、単一液滴の培地を添加することにより、大幅に表面張力に起因する組織の剥離の危険性を低減します。成功する文化がMEAに平らにし、わずかに不完全な組織- MEAの接触または組織の変性（例えば、図1D）のいずれかの主要な徴候なしに、数週間のための健全な成長を示す展開されます。 </li><li> 組織の解剖。マイクロナイフは非常に私たちの解剖のプロセスを改善している。我々は約2 mm幅の&quot;ブレード&quot;を使用してペンチを分割し、メスホルダーでそれらを保持しているから、我々は、ダブルエッジのカミソリの刃（100050〜00 - - 壊れやすいメス刃ファイン科学のツール）を使用してください。それによって大幅に起因する文化の健康を改善する総合的な組織を引っ張るために機械的ストレスを低減するブレードの滑らかな、縦の企業の動きを使用して冠状スライスから解剖組織サンプル。 </li><li>組織の冷却。準備中にスライスし、組織切片の適切な冷却は、文化の成功に不可欠です。我々は、金属板の下側取り付けられたペルチェ素子で構成されたカスタムメイドのコールドプレートを使用してください。ペルチェ素子によって発生する熱は、冷水の血流を介して削除されます。これは、大幅に準備時間を短縮し、準備の各段階で冷却を標準化する（DOLD研究所エンジニアリング131プランテーション博士セガン、TX 78155;（830）560〜1471））。 </li><li> インキュベーターの条件。カスタムメイドのインキュベーター高精度の内部揺動条件では、MEAの上のスライスを育成における当社の成功のための最も重要な鍵だった。 （現在ではない市販）Multichannelsystemsの社内デザインのオリジナルに基づいて、内部のロッキングデバイスには二つの大きな側面の車輪に接続されているトレイで構成されています。ステッピングモータとコンピュータのコントロールは、（速度の揺動角度を揺らし、、と断続的に一時停止します）正確なロッキングの軌跡を可能にする。最終的に、スライス培養は遅い交替の雰囲気と文化メディアに公開する必要があります。伝統的なアプローチは、徐々にそこに長い軸に沿って回転する細いチューブにスライス培養を配置することです。ここで、ゆっくりと回転は回転自体に起因する機械的ストレスを生成しませんし、回転速度が約5の最適な&quot;摂食/呼吸&quot;サイクルを得るために十分に高いです - 10分の時間を。 MEA室、〜2 ccのその合計量、そして組織自体が培地空調に必要な小規模な培養培地の容積のよりコンパクトなインテリアは、重要な課題となっています。 ±〜70 °の角度（サイクルタイム：〜200秒）の間にMEAを揺らすことによって、している液相と大気との間の文化の遷移に応じ揺動速度を減速し、大気への長時間曝露のために極端な角度で揺動を停止文化の生存に必須であった。 </li></ol> 2。神経雪崩を研究するために皮質の文化の発達年齢ラットの大脳皮質からの急性スライスは一般的にPND 0で取られる - 1とMEA上で多くの週間培養する。初期の研究は明らかに単一の皮質の切片培養は、in vitroで数週間後、容易にin vivoでの細胞のクラス18,18-21 のに比較することができる識別可能な細胞の種類と階層構造を維持することを明らかにした。 in vitroの系でこの中の層状組織が ​​便利に視床を研究するために使用されています開発22〜24時の大脳皮質の神経支配、だけでなく、線条体25,26のような皮質下構造を駆動するための。実際には、脳の領域内および組織間の神経接続の形成の特異性は、例えば皮質-大脳基底核回路27から30までのもの、多数の詳細な投影システムを奪還in vitro系における複合体の構築が可能になります。 4の後に- in vitroでの6週間、単一の皮質スライス31および皮質スライスが線条体26または視床32と共培養自発的には、上下を示す典型的にはウレタン麻酔ラット33に生体内で使用されるステート 。これらのアップ状態の微細な時間的な組織では、錐体ニューロンと速いスパイクGABA作動性介在ニューロン31の電気生理学的に成熟したネットワークのネストされたθ-とγ-振動を示すの特徴を負いません。重要なのは、ドーパミンD2受容体刺激の非存在下で、パルブアルブミン陽性皮質介在ニューロンの成熟は、大脳皮質のスライス培養34に約2週間遅れで表示しています。皮質スライスをする投射ドーパミン作動性ニューロンを含む腹側被蓋野（VTA）、共培養しているときにこれらの知見に沿って、ネストされたθ-、β-およびγ-振動の発達時間のコースが生体内でそれに一致さ皮質6。 これらの研究は極めて成熟した高速なGABA作動性抑制に依存すると皮質2,4の浅層に配置されている神経雪崩を、勉強するときに、細心の注意が皮質組織の適切な成熟を ​​確保するために取られる必要があることを示している。神経雪崩が2の時の経過とともに、単一の皮質培養で発生しながら- 5週間4、in vivoでの開発のためにマッチした開発時間の経過を必要とするときに、皮質スライスは、共培養皮質スライスによって、例えば適切なドーパミン受容体の刺激を、必要VTA 6と。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>統合された平面多電極アレイ</td><td>マルチチャンネルシステム（ <a href="http://www.multichannelsystems.com">www.multichannelsystems.com</a> ） ALAサイエンティフィックインスツルメンツ （www.alascience.com） </td><td> <a href="http://www.multichannelsystems.com/products-mea/product-details/products/158/20030ir-ito-wo.html">200/30iR-ITO-w/o</a> </td><td>チタンの硝酸塩（TiN）の電極（直径30mm）は、低インピーダンス（1 kHzで〜1.5kΩの）と優れたワイドバンドレコーディング（ - リングなしW / O）で、その結果大規模な表面を持っている</td></tr><tr><td>チャンバーガラス</td><td> www.aceglass.com </td><td> 7620〜32 </td><td>スレッドのガラスシリンダー</td></tr><tr><td>チャンバーキャップ</td><td> www.aceglass.com </td><td> 7622-114 </td><td>テフロンインサート付きプラスチック製キャップ</td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> www.wpiinc.com </td><td> SYLG184 </td><td> 2つの部分から成るシリコーンエラストマー</td></tr><tr><td>ポリ- D -リジン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P6407 - 5mgの</td><td> γ線照射、凍結乾燥粉末、テストされ培養された細胞。使用前に5ミリリットルの脱イオン水で再構成。 </td></tr><tr><td> Geyの平衡塩類溶液</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G9779 - 500mLに</td><td>滅菌濾過し、培養試験</td></tr><tr><td>鶏血漿</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P3266 - 5mLの</td><td>使用する前に、5 mLの脱イオン水で凍結乾燥、再構成する。 </td></tr><tr><td>トロンビン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T6634 - 1,000個</td><td>ウシ血漿、凍結乾燥粉末の形から。 </td></tr><tr><td>馬血清</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> H1138 - 100mLの</td><td>ドナーの群れ、熱不活性化、細胞培養テスト済み</td></tr><tr><td>基礎培地イーグル</td><td>インビトロジェン</td><td> 21010-046 </td><td> 1 ×、500ミリリットル - （+）アールの塩、（ - ）L -グルタミン）、 </td></tr><tr><td>ハンクス緩衝生理食塩溶液</td><td>インビトロジェン</td><td> 24020-117 </td><td> 500ミリリットル - （+）マグネシウム、（+）、カルシウム、W /フェノールレッド） </td></tr><tr><td>チャンバースライド</td><td>無菌ラボテックチャンバースライドW /カバー（Nunc社）、 </td><td> 177429 </td><td></td></tr><tr><td>ウリジン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> U3003 </td><td></td></tr><tr><td> ARA - Cシトシン-β- D -アラビノフラノシド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C6645 </td><td></td></tr><tr><td> 5 - フルオロ-2&#39; - デオキシウリジン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> F0503 </td><td></td></tr></tbody></table>

器官培養における神経雪崩のマルチ電極アレイの録音

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

皮質はさらに、特定の入力またはモーターの出力がない状態で、自発的にアクティブになります。開発中は、この活動は、皮質の細胞型と神経の接続1の形成の遊走と分化に重要である。成熟した動物では、継続的な活動は、過去と感覚刺激がシームレスに将来の行動を計算するために統合された動物の現状を反映している。このように、継続的な、すなわち自発活動の組織を明確に理解することは、皮質の機能を理解することが前提条件です。 数々の記録技術は、皮質における継続的な活動が、その個々の活動一過性に細胞外微小電極で局所電場電位（LFP）で検出することができる大規模なイベントに合計、または脳波（EEG）、脳磁気図（MEGの多くのニューロンから構成されていることを明らかに）、そして機能的磁気共鳴画像（fMRI）からBOLD信号。メゾスコピックスケール（ニューロン数千）での高時間および空間分解能で神経集団の活動を研究するときにLFPは、現在の選択の方法です。細胞外微小電極では、局所的にマイクロボルトから数百までのLFPの急激なたわみの空間的neighboredニューロンの結果の活動を同期化。微小電極のアレイを使用する場合は、このような偏向の団体は、便利な空間と時間で監視することができます。 神経雪崩は脳2,3の継続的なニューロン活動のスケール不変時空間構成について説明します。 in vitroで 4,5 で 、麻酔ラット6のin vivoで 、と目を覚ましサル7に設立されたとして、それらは皮質の浅層に固有のものです。重要なことは、理論的実証的研究2,8-10両方の神経雪崩の情報伝達と情報の処理を最適化する皮質の絶妙バランスの臨界状態のダイナミクスを示すことを示唆している。 彼らは正確に制御された条件下で雪崩の活動の安定的な録音を可能と神経雪崩の開発、保守、および規制のメカニズムを研究するためには、in vitroでの製剤で 、非常に有益です。現在のプロトコルは、平面、統合された微小電極アレイ（;も11-14を参照してMEA）上に成長した器官皮質の培養、すなわちスライス培養で浅層の開発を活用することによって、in vitroで神経雪崩を勉強する方法について説明します。

皮質における臨界​​状態のダイナミクスを示す神経雪崩、すなわちスケール不変時空間アクティビティのバーストを、勉強するための確実な方法。雪崩は、正確に制御された条件下で平面統合マルチ電極アレイ（MEA）との活動の長期的な測定を可能にする培養皮質の浅層の開発に自発的に出現する。

皮質は、特定の入力や運動出力がない状態であっても、自発的に活動しています。発達過程において、この活動は...にとって重要です。

この実験の目的は、皮質における臨界状態ダイナミクスの特徴である、正常な脳活動がニューロナルアバランシェ（神経雪崩）へと自己組織化される様子を研究することです。これは、冠状断面の層構造を持つ皮質スライスと、皮質へ発生上重要なドーパミン作動性入力を提供する中脳スライスを組み合わせることで実現されます。第二のステップとして、皮質と中脳の共培養物をマルチ電極アレイ（MEA）上で育成し、培養物内のニューロン活動の多点刺激および記録を可能にします。次に、共培養物をカスタム設計のインキュベーター内で1〜2週間静置し、平坦化、拡大、およびMEA表面への接着を促進させます。このインキュベーターは、培養物を通常の空気と培養液に交互に曝露させるサイクルを備えています。その結果、時空間的な局所電位バーストがニューロンアバランシェへと自発的に自己組織化することが示されました。これは、MEA記録および、アバランシェサイズのべき乗則を特定するオフラインアバランシェ解析に基づいて導き出されました。解離培養などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、システム神経科学的な側面があることです。多くの脳領域を共培養することができ、これらの多領域培養では、皮質層や投射系などの大きなスケールで正しい脳組織構造が構築されます。この技術の応用範囲は、単なるニューロンアバランシェの研究にとどまりません。例えば、厳密に制御されたin vitro条件下で、ネットワークレベルでの刺激に対する反応を研究することができます。プラズマトロンビン混合液の適切な適用や、MEAへの組織の配置を習得するのは困難であるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。これらのステップでは、適切なタイミングと正確な温度勾配が必要であり、繊細なMEA表面に直接触れないようにすることが求められます。記録用の滅菌可能な密封ガラスチャンバーを準備するには、まず、テフロン製プラスチックキャップ付きのネジ付きガラスシリンダーを、ネジの下端から約2 mmのところで切断します。これは、培養チャンバーを確実かつ密閉して閉じるために必要です。次に、ガラスリングを水で3回すすいで洗浄し、200 proofのエチルアルコール中で5分間煮沸します。これらを脇に置いて乾燥させます。ガラスリングをMEA表面に取り付けるには、シリコン溶液が必要です。Cell Guard 180 4シリコンエラストマーキットを使用し、パートAとBを各15 milliliters十分に混合します。その後、気泡を除去するため、15分間静置します。溶液を1 mLずつEloquaに分注し、今後の使用に備えて-20 °Cで保存します。次に、23 °Cのシリコン1 mLを細いゲージの針付きシリンジで吸い取り、ガラスリングの研磨されていない切断面に塗布して、MEAに接着させます。その後、ガラスリングをMEAの中央に配置し、密封性を高めるためにリングの外周にさらにシリコンを塗布します。これをホットプレート上で約60°Cで1〜2時間硬化させます。次に、ラミナーフローフード内で、MEAチャンバーとチャンバーキャップを脱イオン水で3回、その後70%アルコールで3回すすぎ、滅菌します。最後のすすぎの後、チャンバーをアルコールに10分間浸漬させておきます。続いて、チャンバーとキャップの内部をUVライトに10分間曝露させます。120 °Cで45分間オートクレーブ滅菌します。滅菌後、これらを乾燥させます。次に、培養チャンバー内のMEA表面をポリDリシンでコーティングします。本実験で使用した新しいMEAはかなり親油性であるため、溶液を繰り返し滴下してコーティングを行ってください。その後、電極グリッドから溶液を吸引除去します。保存および今後の使用に備え、キャップを取り付けてMEAチャンバーを密閉します。この手順により、約12個の共培養用の皮質およびVTA切片が得られます。操作は、生後1〜2日の健康な動物を用い、滅菌条件下でラミナーフローフード内で行ってください。組織採取に要する合計時間は1時間未満とする必要があります。斬首後、まず頭皮から皮膚を取り除くために、ハサミで左右に2箇所切開し、脳の摘出を開始します。細い眼科用ハサミを用いて頭蓋骨を取り除き、小脳皮質接合部で正中矢状方向に1回、冠状方向に1回切り込みを入れます。これらの4つの頭蓋骨フラップを反転させて脳を露出させます。次に、鋭利なスパチュラを用いて、嗅球を前方から切断します。次に、スパチュラを脳の下に四分の一間隔で差し込みます。脳を頭蓋骨からゆっくりと持ち上げ、急速冷却および一時保存用の冷却したガゼ溶液の中へ滑り込ませます。上記の手順をさらに2つの脳で繰り返します。VTA組織を採取するため、脳を滅菌済みの乾燥したペトリ皿に移します。小型のスパチュラを使用し、各脳を約1 cm横にゆっくりとずらして、過剰な液体を除去します。次に、カミソリを用いて、小脳の高さで冠状面に垂直に切断し、脳幹を除去します。次に、スライス操作中に脳を機械的に固定するため、アガロースブロックをマウンティングディスクに接着します。その後、小型スパチュラを用いて、ディスク上のアガロースブロックの数ミリ前方にシアノアクリレート系接着剤を薄く塗布します。この際、接着剤がアガロースに触れないように注意してください。各脳を前頭極を下にして移し、固定します。前頭極が固定ディスクに接着されており、腹側が接着剤の残渣なくアガロースに接していることを確認してください。これにより、切断時の適切な機械的安定性が確保され、切断した切片を容易に回収することが可能になります。次に、脳を固定したマウンティングディスクを、冷却したgaze溶液を満たしたバイブラートレイに慎重に浸し、固定します。その後、入念に洗浄したカミソリを用いて、最高振動周波数および比較的低速の前進速度で、中脳の厚さ400 $\mu$mの冠状切片を作成します。吸引バルブ付きの逆ピペットを用いて、VTAを含む切片を回収し、滅菌済みの冷却gaze溶液を満たした35 $\times$ 10 mmのペトリ皿に移し、皮質切片として保存します。前のスライス工程を繰り返しますが、皮質と小脳の間で垂直に切断し、4つの脳を前極を上にして固定します。線条体のレベルから、厚さ 350 µm の冠状断切片を約3枚採取します。次に、カミソリの刃で作製したマイクロナイフを用い、実体顕微鏡下で、前頭前皮質および VTA を含む中脳領域の幅約 2 mm の冠状断切片を切り出します。組織切片は、冷却した gaze solution を満たした小さなディッシュにそれぞれ分けて回収します。MEAチャンバーの第1ポジションに組織を固定し始めるには、まずステレオ顕微鏡下で、電極アレイに焦点を合わせて室温のMEAを配置します。次に、清潔で塵がなく、滅菌された電極アレイマトリックスの中央に、25 µLのプラズマ液を滴下します。小さなスパチュラを使用して、皮質およびVTAの切片をプラズマ液の滴の中へ慎重に滑り込ませます。次に、MEAを冷却プレートの上に置き、視野を再調整します。約15秒間冷却した後、血漿ドロップに25 µLのトロンビンを加えます。その後、トロンビンを使用したピペットチップを用いて、血漿とトロンビンの混合液をMEA全体に小さな円を描くように慎重に広げます。脆い電極アレイに直接触れないように注意してください。次に、皮質の背側縁がアレイの2列目の電極に沿うようにして、皮質をアレイ上にそっと配置します。これにより、発達中の表層が最終的にアレイの残りの部分を覆うことになります。次に、VTAを皮質切片の腹側に隣接させて配置します。ここで、高湿度を維持するために、MEAチャンバーにキャップをして緩く閉じます。血漿トロンビンの凝固を促進させるため、MEA培養アセンブリをフード内の室温で約6分間静置します。その間に、同様の手順を繰り返して、さらに3つの培養物を準備します。次に、1 ccシリンジに25G 5/8インチの針を装着し、培養チャンバーに培養液を600 µLずつ慎重に滴下します。その後、MEAチャンバーをしっかりと密閉し、MEA培養アセンブリをインキュベーター内のロッキング保存トレイに設置します。in vitroで2日後、有糸分裂阻害剤を10 µL添加します。その後、in vitroで4日目、およびそれ以降4日ごとに、培養液の60%を交換します。正常な成長過程において、培養物は大幅に扁平化し、背側へわずかに拡大します。浅層皮質層の発達により、健全な培養物は明視野において不透明な灰色色の組織として識別されます。対照的に、培養準備から約10〜12日後に現れる死滅した変性細胞の特徴である、明るく反射する小胞が見られれば、記録および刺激を行う準備が整ったことになります。記録セッションを開始するには、MEAを保管トレイから記録用ヘッドステージに移動させます。局所フィールド電位（LFP）を記録するには、1～200 Hzのバンドパスフィルターを使用します。また、300～3000 Hzのバンドパスフィルターを用いて、マルチユニット活動を解析することも可能です。正常な自発活動は、大きさや持続時間が多様なバースト状に発生する傾向があります。LFPとユニット活動の関係を調べるため、LFPのスパイク誘発平均を算出します。これらの皮質培養細胞では、刺激誘発活動を記録する場合、負のLFP偏向がニューロンのスパイクと相関します。まず、刺激発生装置を制御するソフトウェアを用いて、刺激の時間的波形と振幅を指定します。有用な刺激パラダイムとして、双極矩形波を用いた電流制御電荷中性単回衝撃が挙げられます。次に、刺激の提示に使用する電極を選択します。典型的な刺激誘発LFP反応は、自発的な活動バーストと同様の外観を示します。ブランキング回路は、刺激アーチファクトを低減し、アンプの飽和を防ぐために、刺激中にアンプを切り離します。刺激電極は刺激から回復するまでに数秒を要するため、応答活性の記録に使用することはできません。MEA上では、ある電極での活性が他の部位での活性を伴うことが多く、時空間的なクラスターとして現れる傾向があります。同時に、このような活動期間中のLFPの典型的な波形を、各クラスターについて数秒の間隔で発生した3つのクラスターを重ね書きしてここに示します。負の標準偏差（sd）の倍数という閾値を越えるNLFPピークを抽出すると、1秒のウィンドウ内で複数の電極に負のLFP偏向が見られます。NLFPピークの時間形式による活動は、ドットの列がさまざまな電極におけるほぼ同時期のNPSを表すラスタプロットによって便利に可視化されます。この活動の時空間的な構成はかなり複雑です。低い時間解像度ではほぼ均質に見えるカラムも、より高い時間解像度では個別のクラスターで構成されており、以下同様です。空間的、GEOTEMPORAL、およびLFPクラスターの出現は、皮質ネットワークにおいて高度に組織化されています。より具体的には、この組織化はニューロナルアバランチ（神経細胞アバランチ）においてスケール不変です。これは、特定の時間分解能（Delta T）におけるクラスターサイズの確率を算出することによって実証されます。ここでのクラスターは、同じまたは連続するタイムビンで発生したNL FPSで構成されています。このようなクラスターのサイズを、クラスターあたりの総NFPS数またはクラスターあたりの統合NLFP振幅で表すと、クラスターサイズ分布はマイナス1.5に近い指数を持つべき乗則を示します。このビデオを視聴することで、神経活動の自己組織化を研究するために、脳組織を慎重に解剖し、マルチ電極アレイ上で培養する方法について十分に理解できるはずです。これらの手法は、皮質ネットワークにおける自発活性と刺激誘発活性との関係を研究するためにも用いられてきました。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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