Name: タンパク質のメンブレンオーバーレイアッセイ：可溶性および不溶性タンパク質間の相互作用をテストするためのプロトコル in vitroで /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-14T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学ぶメンブレンオーバーレイアッセイによるタンパク質間相互作用解析法。不溶性タンパク質をニトロセルロース膜に固定し、可溶性タンパク質と免疫ブロッティングで検出します。in vitroで信頼性の高い結合評価が可能です。

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当研究室での作業はNIH、食と農のUSDA国立研究所、NSF、BARD、DOE、及びBSFか​​らVCへの補助金によってサポートされています

1。タンパク質の発現と抽出<ol><li>差彼らの検出をテストするタンパク質にタグを付ける。大きいサイズ（例えば、GST）のタグ付き膜（ProIM）上に固定化するタンパク質にラベルを付け、そして融合していないタグが固定されたネガティブコントロール（ProIMnc）として使用することができます。大規模または小規模なタグのいずれかを持つ水溶性プローブ​​（ProSOL）として使用するタンパク質にラベルを付けます。適切な陰性対照可溶性タンパク質（ProSOLnc）に同じタグを融合し、検出された結合の特異性を確認するために、相互作用のアッセイに含まれています。 </li><li>すなわち、E.、タグ付きタンパク質を発現する蛋白質の発現系を選択します。 大腸菌 、バキュロウイルス、等、タンパク質の潜在的な翻訳後修飾と収量のための要件に応じて。 </li><li>プロテイナーゼ阻害剤カクテルを含むSDS - PAGEローディングバッファー（20％グリセロール、4％SDS、20mMトリス- HCl、pH6.8）を用いて選択肢の生物（ステップ1.2）からProIMとProIM ncを抽出する。 15分間室温で細胞懸濁液のまま、2 - メルカプトエタノールおよび5分間沸騰の0.5％を追加。 </li><li>標準プロトコル16を使用して選択肢の生物（ステップ1.2）からProSOLとProSOL ncを抽出する。これらのタンパク質は、ステップ4.1で使用される結合バッファー（140mMのNaCl、10mMのトリス塩酸pH7.4の、2mMのEDTA、2mMのDTT、1％BSA、0.1％のTween 20）で容易に溶解する必要があります。 </li><li>このようなバイオラッドのプロテインアッセイキットなどの標準的な方法を用いて組換えタンパク質の濃度を決定する。バイオラッドのプロテインアッセイキットなど。粗抽出物ではなく、タンパク質の精製は、アッセイに使用されている場合は、クマシーブリリアントブルーR - 250と、既知の使用に染色したSDS -ポリアクリルアミドゲル上の対応するバンドの密度測定をスキャンすることにより、この抽出物中の目的のタンパク質の濃度を推定リファレンスとしてBSAの濃度。 </li></ol> 2。メンブレン上のProIMとProIMncの固定化<ol><li>抽出物の2セット標準プロトコル16に記載のSDS -ポリアクリルアミドゲル上ProIMとProIM NC1μgを含む各を解決します。 </li><li>電気泳動後、転送バッファの100ml（60 mMグリシン、10mMのトリス、0.0006パーセントSDS、20％メタノール）で、転送のゲルを置き、室温で20分間穏やかに撹拌しながらインキュベートする。 </li><li>標準プロトコル16に記載のニトロセルロース膜にゲルに含まれるタンパク質をElectrotransfer。 </li></ol> 3。膜結合タンパク質の再折りたたみ<ol><li> electrotransferした後、バッファー15ml中に15分間メンブレンをインキュベート（30 mMトリス- HCl pH7.4の、0.05％ツイーン20）残SDSを除去するために穏やかに振とうさせながら。 </li><li>慎重に排出した後、変性バッファー（7 Mグアニジン塩酸塩、2mMのEDTA、50mMのDTT、50mMのTris - HCl pH8.3）を25mlのに膜を転送する。と穏やかに撹拌しながら室温で2時間インキュベートする。 （注：変性バッファー中でインキュベートしたとき、ニトロセルロース膜が不透明になる）。と穏やかに撹拌しながら室温で2時間インキュベートする。 </li><li> 25 TBSの液（10mMのTris - HCl、150mMのNaCl、pH7.4）に、5分間穏やかに振とうさせながらインキュベートする膜を転送する（注：このステップでは、膜は元の白い色を取り戻す）。 </li><li>結合バッファーの25mlにメンブレンを移し（ステップ1.2参照）、4℃でインキュベート一晩穏やかに撹拌しながらC。 </li></ol> 4。 ProSOLでProIMをプロービング<ol><li> 2つのストリップ、両方を含むProIMとProIM NCに膜を切り取ります。 </li><li>新鮮な結合緩衝液10mlでProSOLまたはProSOLncどちら1-10μgの準備を希釈することによりProSOLとProSOLncハイブリダイゼーション溶液を加えます。 ProSOLまたはProSOLncハイブリダイゼーション溶液中にそれぞれの膜を転送し、穏やかに撹拌しながら室温で1.5時間インキュベートする。 </li><li>ハイブリダイゼーション溶液から膜を削除し、TBSで各15分を3回すすいでください。 </li></ol> 5。免疫ブロッティングによりタンパク質間相互作用の可視化<ol><li>室温で1時間TBSTでは2.5％スキムミルク（10mMトリス- HCl、140mMのNaCl、0.05％ツイーン20、pH7.4）でメンブレンをブロックする。メーカーが推奨する濃度でTBSTで0.5％スキムミルクで一次抗体（抗strepIIポリクローナルウサギ抗体）を希釈します。 </li><li>抗体溶液でブロックされた膜を配置し、4℃、室温で1時間または一晩インキュベート℃で穏やかに振とうさせながら。 </li><li> 15分間、2回穏やかに撹拌しながら室温で5分間、20mlのTBSTで膜を洗浄します。 </li><li>メーカーが推奨する濃度でTBSTで0.5％スキムミルクでホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）を結合させた二次抗体（抗ウサギIgG抗体）希釈します。二次抗体のメンブレンを置きソリューションと穏やかに撹拌しながら室温で1時間インキュベートする。 </li><li> 15分間、2回穏やかに撹拌しながら室温で5分間、20mlのTBSTで膜を洗浄します。最終的には、TBSで洗浄後、HRPの化学発光基質（例えば、ミリポアイモビロン西部化学発光HRP基質）を用いて、タンパク質 - タンパク質相互作用を可視化する。 </li><li>ステップ5.4から5.1で説明したように、適切な二次抗体が続くProIMに融合されたタグ用の一次抗体と同じ膜を、プローブ。視覚化ProIMとProIMncは、タンパク質の膜のオーバーレイアッセイ（ステップ5.5）で得られたバンドのアイデンティティを検証するためにステップ5.5で説明。この段階で得られた信号は、ステップ5.5から得られる残差信号よりもはるかに強力であるため、ほとんどの場合、ストリッピングは、必要ありません。 </li></ol> 6。代表的な結果： ANK - MPとの対話は、タバコ表皮細胞（図1A）にBiFCで観察された。 MPは、細菌や植物において発現する高度に不溶性のタンパク質であるため、タンパク質の膜のオーバーレイアッセイは 、in vitro（図1B） におけるこの相互作用を検証するために採択されました。 GST - MP（ProIM）または非融合GST（ProIM NC）1μgを含むタンパク質抽出物は、ニトロセルロース膜にelectrotransfer続いて、SDS -ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。これらProIMsは、水溶性ANK - strepII（ProSOL）、GST - MPが、融合していないではないGSTでプローブ結合展示されたとき（図1B、レーン1、2、レーン5、6に比較して）。また、ProIMsの同じセットが無関係ProSOLnc、すなわち、strepII（NADH3 - strepII）タグ付けされたシロイヌナズナ細胞質 NADHキナーゼでプローブしたときに、バインディングが観察されていない、さらにANK - MPの相互作用（図1B、レーンの特異性を実証3、4）。 <img src="/files/ftp_upload/2961/2961fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。in vivoおよび in vitro における TMV MPのタバコANKの特異的結合。 BiFCによって検出されたとしてタバコ表皮細胞を生体内に（A）ANK - MPとの対話。 MPとANKは、C末端とそれぞれYFPのN末端半分、に融合されたとき強いYFP信号が再構成され、それらのコードする遺伝子のmicrobombardment以下のタバコの表皮に共発現させた。プラスモデスム15の診断である細胞の周囲、で涙点に蓄積されたこのBiFC信号。 in vitroでの （B）ANK - MPの相互作用などの蛋白質の膜のオーバーレイアッセイによって検出。 GST - MP（ProIM）または非融合GST（ProIMnc）1μgを含むタンパク質抽出物は、ニトロセルロース膜上にelectrotransfer続いて15％SDS -ポリアクリルアミドゲル上で分離した。 GST - MPProIMとGSTProIMncはANK - strepII（ProSOL）0.5μg/ mlのと共にインキュベートし、ANKの結合は、への結合抗ウサギIgG + M二次抗体に続いて、抗strepIIウサギポリクローナル抗体と膜をプローブによって検出されたHRP（レーン1および2）。 GST - MPProIMもGSTProIMncどちらもstrepIIタグ（ProSOLnc、レーン3および4）に融合された無関係なタンパク質、 シロイヌナズナ細胞質NADHキナーゼと相互作用する。このアッセイにおいて観察されたバンドのアイデンティティは、抗GST抗体（レーン5および6）を持つ膜をプロービングにより確認された。 GST - MPおよびGST続きですタンパク質抽出物に含まれている正体不明の蛋白質が重要性を実証、ANK - strepIIと反応しながら膜を緩衝液で洗浄されることなく、変性バッファーで処理した場合、ANKにGST - MPの結合は、失われステップ3.1の前に、変性過程（レーン7および8）。

<ol><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li>
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<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+Caenorhabditis+elegans+using+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis.</a> Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).</li>
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<li>Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+by+immunogold+cytochemistry+of+the+virus+coded+30+K+protein+in+plasmodesmata+of+leaves+infected+with+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Localization by immunogold cytochemistry of the virus coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus.</a> Virology. 160, 363-371 (1987).</li>
<li>Ding, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+plasmodesmata+are+specific+sites+of+localization+of+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+in+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants.</a> Plant Cell. 4, 915-928 (1992).</li>
<li>Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+the+30+kd+protein+of+tobacco+mosaic+virus%3A+involvement+in+cell-to-cell+movement+and+dispensability+for+replication%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication.</a> EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).</li>
<li>Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+modifies+plasmodesmatal+size+exclusion+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit.</a> Science. 246, 377-379 (1989).</li>
<li>Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+functional+assay+for+tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein+and+identification+of+a+domain+involved+in+increasing+plasmodesmal+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).</li>
<li>Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANK%2C+a+host+cytoplasmic+receptor+for+the+Tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein%2C+facilitates+intercellular+transport+through+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata.</a> PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).</li>
<li>Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. Taylor, G. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VIP1%2C+an+Arabidopsis+protein+that+interacts+with+Agrobacterium+VirE2%2C+is+involved+in+VirE2+nuclear+import+and+Agrobacterium+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity.</a> EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).</li>
<li>Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+and+host+cell+pectin+methylesterases+is+required+for+viral+cell-to-cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement.</a> EMBO J. 19, 913-920 (2000).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このアプローチは、タンパク質の組み合わせの間のタンパク質-タンパク質相互作用をテストするのに適している、タンパク質の際に少なくとも一つは、結合バッファーに容易に可溶であり、成功したタンパク質17,18の他の組み合わせに適用した。これらの条件下で両方に不溶であるタンパク質の間iInteractionsは、このプロトコルでテストすることはできません。 また、ProIMの成功したリフォールディングは、アッセイのための非常に重要です。残留SDSが変性/再生プロセスを損なう可能性があるためelectrotransfer後にTBSで膜を洗浄すると、重要なステップです。 最後に、非特異的結合を避けるために、結合バッファーでProSOLの濃度は1μg/ mlを超えてはならない。あまりにも集中しているProSOLはProIMへの非特異的結合を示すことができる。また、ProSOLに膜固定化したタンパク質の非特異的結合をブロックするために、ステップ4.2の間に使用されるハイブリダイゼーションバッファー中のBSAは、スキムミルク...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>タンパク質アッセイキット</td><td> Bio - Rad社</td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td>プロテイナーゼ阻害剤カクテル</td><td> SIGMA </td><td> S8820 </td></tr><tr><td>ミニプロティアンシステム</td><td> BIO - RAD </td><td> 165-8000 </td></tr><tr><td>セミドライウェスタンブロッティングSD electrotransferシステム</td><td> BIO - RAD </td><td> 170-3940 </td></tr><tr><td>西洋ワサビペルオキシダーゼと結合抗ウサギIgG抗体</td><td> GenScript </td><td> A00098 </td></tr><tr><td>抗GSTウサギポリクローナル抗体</td><td> GenScript </td><td> A00097 </td></tr><tr><td>アンチstrepII </td><td> GenScript </td><td> A00626 </td></tr><tr><td> BioTrace、NTニトロセルロース転写膜</td><td>ポールサイエンティフィック</td><td> 27377-000 </td></tr><tr><td>イモビロン西部化学発光HRP基質</td><td>ミリポア</td><td> WBKL S0 050 </td></tr></tbody></table>

タンパク質のメンブレンオーバーレイアッセイ：可溶性および不溶性タンパク質間の相互作用をテストするためのプロトコル in vitroで</em

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

異なるタンパク質間の相互作用を検証することは、分子レベルでそれらの生物学的機能の研究に不可欠です。そこに結合タンパク質を評価するためのin vitroおよび in vivo の両方でいくつかの方法では、、であり、そしてお互いの欠点を補完少なくとも二つの方法は信頼性の高い洞察を得るために行われるべきである。 in vivoアッセイの場合は、二分子蛍光相補性（BiFC）アッセイは、生きた細胞内のタンパク質-タンパク質相互作用を検出するだけでなく、相互作用するタンパク質の1,2の細胞内局在を識別できる、最も人気があり、最も侵襲的なアプローチを表しています。このアッセイでは、非蛍光性のN -およびGFPまたはその変異体のC末端の半分がテストされたタンパク質に融合させ、そして2つの融合タンパク質が原因でテストタンパク質&quot;相互作用するために一緒に持って来られる時、蛍光シグナルが3-6を再構成する。その信号は、落射蛍光または共焦点顕微鏡によって容易に検出可能であるため、BiFCは、生きた細胞3のタンパク質間相互作用について研究するための細胞生物学者の間で選択の強力なツールとして登場しました。このアッセイは、しかし、時には偽陽性の結果を生成することができます。例えば、蛍光シグナルは限りお互いから7 nmが小さいため細胞内コンパートメントに梱包閉じるには、むしろそのため、特定の相互作用7のように配置された2つのGFPフラグメントによって再構成することができる。 これらの制限のため、生細胞イメージング技術から得られた結果は、タンパク質相互作用を検出するための別の原理に基づいて、独立したアプローチによって確認されるべきである。共免疫沈降法（共同IP）またはグルタチオントランスフェラーゼ（GST）プルダウンアッセイ一般的にin vitroでのタンパク質-タンパク質相互作用を分析するために使用されているような代替方法を表しています。しかし、これらのアッセイIIN、しかし、テストしたタンパク質は、結合反応のためにsupportsusedバッファーに容易に溶解する必要があります。したがって、不溶性のタンパク質が関与する特異的な相互作用は、これらの手法によって評価することができます。 ここで、我々はこの困難を回避する有効な蛋白質の膜のオーバーレイ結合アッセイ、プロトコルを示しています。タンパク質の一つが細胞膜のマトリックス上に固定化されているため、この手法では、水溶性と不溶性のタンパク質間の相互作用を確実にテストすることができます。このメソッドは、そのようなBiFCなどのin vivo実験、 のとの組み合わせで、水溶性と不溶性のタンパク質の間で忠実に相互作用を調査し、特徴付けるために信頼性の高いアプローチを提供します。この記事では、ウイルスの細胞間輸送8-14、および最近同定された植物細胞の相互作用、タバコアンキリン反復を含むタンパク質（ANK中に複数の機能を発揮するタバコモザイクウイルス（TMV）移行タンパク質（MP）、の間の結合）15は 、このテクニックを使用して示されています。

テストのタンパク質 - タンパク質相互作用は、タンパク質の機能の解離のために不可欠である。ここでは、導入<em&gt; in vitroで</em可溶性タンパク質と膜固定化タンパク質を調べるために&gt;タンパク質 - タンパク質結合アッセイ。このアッセイは、不溶性タンパク質と溶液中のタンパク質間の相互作用をテストするために信頼性の高い方法を提供する。

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タンパク質の試験。タンパク質の機能解析において、タンパク質間相互作用の解明は不可欠です。本ビデオでは、膜に固定化されたタンパク質と可溶性タンパク質の相互作用を試験するための、in vitro タンパク質結合アッセイを紹介します。まず、融合タンパク質をクローニングし、発現させ、抽出します。タグ付きの不溶性タンパク質をニトロセルロース膜上に固定し、天然の状態の構造にリフォールディングさせる処理を行います。その後、膜をタグ付き可溶性タンパク質でプローブし、免疫ブロッティングを行ってタンパク質を検出します。タグ付きタンパク質が相互作用する場合、それらは膜上に固定化されたタンパク質によって捕捉され、免疫ブロッティングによるシグナルが観察されます。したがって、このアッセイは、不溶性タンパク質と溶液中のタンパク質との相互作用を検証するための信頼性の高い方法となります。GSTプルダウンなどの既存の手法に対する本技術の主な利点は、不溶性タンパク質と可溶性タンパク質との結合をin vitroで確実に評価できることです。この手順の最初のステップは、検出のための遺伝子タグ付きタンパク質を作製することです。まず、メンブレン上に固定化するタンパク質をクローニングします。固定化タンパク質をpro Imと定義し、GSTなどの大きなタグをコードする発現ベクターに組み込みます。タグのみをコードする空の発現ベクターを固定化タンパク質のネガティブコントロールとして使用し、これをpro IM ncと呼びます。次に、可溶性プローブとして使用するタンパク質を、Strep-tag IIなどの異なるタグをコードする発現ベクターにクローニングします。これを可溶性タンパク質の略称としてprosolと呼びます。陰性対照として、陰性対照用可溶性タンパク質を同じ発現ベクターにクローニングします。これを可溶性タンパク質陰性対照の略称としてProsol NCと呼びます。次に、E. coliやバクロウイルスなどのタンパク質発現システムを用いて、タグ付きタンパク質を発現させます。使用する発現システムは、翻訳後修飾の必要性に基づいて慎重に選択してください。選択した生物から発現したタンパク質を抽出します。pro IMおよびpro I mnc Resusについては、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むSDS-PAGE用試料調製バッファーで細胞を懸濁させます。次に、細胞を5分間煮沸し、遠心分離して沈殿物を除去することで、Prosolおよびprosol NCを抽出します。標準的な手順に従ってください。タンパク質はニトロセルロース膜に固定された後にリフォールディングされるため、pro IMSは変性条件下で抽出することが可能です。ただし、タグ付きタンパク質を抽出した後に結合バッファーに添加するため、天然の状態を確認するためにプロソルを抽出して

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細胞内貯蔵からのCa2+放出を媒介するホモ四量体イオンチャネルであるリアノジン受容体のオリゴマー化は、骨格筋と心筋の収縮に重要です。ここでは、タンパク質の自己会合を検出し、ホモオリゴマー化学量論を決定するための補完的なin vivoおよびin...

以下のための遺伝学的および生化学的アプローチ<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;タンパク質のオリゴマーの評価：リアノジン受容体のケーススタディ

ここでは、co 免疫沈降法及び酵素採用し酵素活性細胞膜受容体の特定のタンパク質ドメインの貢献を同時に勉強するビーズの酵素活性測定のためのプロトコルを提案する.

受容体と酵素間の機能的相互作用を研究するため Co 免疫沈降分析

ここでは、質量分析用サンプルの調製のための膜上消化技術のプロトコルを提示する。この技術は、タンパク質とタンパク質の相互作用の便利な分析を容易にします。...

膜上消化技術を用いてのタンパク質・タンパク質相互作用の評価

このプロトコルは、イノシトールリン酸塩またはホスホイノシチドに結合するタンパク質の同定に焦点を当てています。これは、アガロースまたは磁気ビーズにストレプトアビジンを介して固定化されたバイオチン化イノシトールリン酸塩またはリンオイノシチドとの親和性クロマトグラフィーを使用しています。イノシトールリン酸塩またはホスオイノシチド結合タンパク質は、ウェスタンブロッティングまたは質量分析によって同定される。...

アフィニティクロマトグラフィーによるインノシトールリン酸塩またはホスホイノシチド相互作用タンパク質の同定

ここでは、蛍光顕微鏡を用いた異種細胞系におけるトランスにおけるリガンド-受容体相互作用を迅速かつ半定量的に測定するための最適化されたプロトコルを提示する。...

異種細胞系におけるタンパク質凝集による細胞間相互作用の測定

ここで提示される電子顕微鏡法と組み合わせてネイティブ細胞膜ナノ粒子系を利用する膜蛋白質のオリゴマー状態の決定のためのプロトコルです。...

膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

学ぶメンブレンオーバーレイアッセイによるタンパク質間相互作用解析法。不溶性タンパク質をニトロセルロース膜に固定し、可溶性タンパク質と免疫ブロッティングで検出します。in vitroで信頼性の高い結合評価が可能です。

タンパク質のメンブレンオーバーレイアッセイ：可溶性および不溶性タンパク質間の相互作用をテストするためのプロトコル in vitroで

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