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Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

タンパク質のメンブレンオーバーレイアッセイ：可溶性および不溶性タンパク質間の相互作用をテストするためのプロトコル in vitroで

Full Text

22,371 Views

08:38 min

August 14, 2011

DOI: 10.3791/2961-v

Shoko Ueki¹, Benoît Lacroix¹, Vitaly Citovsky¹

¹Department of Biochemistry and Cell Biology,State University of New York

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

テストのタンパク質 - タンパク質相互作用は、タンパク質の機能の解離のために不可欠である。ここでは、導入

Transcript

タンパク質のテスト。タンパク質の相互作用は、タンパク質の機能の解剖に不可欠です。このビデオでは、膜と固定化タンパク質と可溶性タンパク質との相互作用を試験するためのin vitroタンパク質結合アッセイを紹介します。

まず、融合タンパク質をクローニング、発現、抽出します。タグが付けられた不溶性タンパク質をニトロセルロースメンブレンに固定化し、その天然の確認にリフォールドするように処理します。次に、メンブレンをタグ付き可溶性タンパク質でプローブし、免疫ブロッティングを行ってタンパク質を検出します。

タグ付きタンパク質が相互作用すると、膜に固定化されたタンパク質によって捕捉され、免疫ブロッティングからのシグナルが観察されます。したがって、このアッセイは、不溶性タンパク質と溶液中のタンパク質との間の相互作用を試験するための信頼性の高い方法を提供します。GSTプルダウンのような既存の容器に対するこの手法の主な利点は、不溶性タンパク質と可溶性タンパク質との間の結合をin vitroで確実に評価できることです。

この手順の最初のステップは、検出用の遺伝的にタグ付けされたタンパク質を生成することです。まず、膜に固定化するタンパク質をクローニングします。ここでは、GSTのような大きなタグをコードする発現ベクターに固定化タンパク質のpro Imといい、タグのみをコードする空の発現ベクターは、固定化タンパク質のネガティブコントロールとして使用され、pro IM ncと称する。

次に、可溶性プローブとして使用されるタンパク質を発現ベクターにクローニングし、連鎖球菌2などの異なるタグをコードします。これは、ネガティブコントロールとしての可溶性タンパク質のプロソル、クローン、ネガティブコントロールの可溶性タンパク質を同じ発現ベクターに呼びます。これは、可溶性タンパク質陰性制御のためのProsol NCと呼ばれます。

次に、大腸菌またはバロウイルスなどのタンパク質発現系を使用して、タグ付きタンパク質を発現する発現系は、翻訳後修飾の要件に基づいて慎重に選択されるべきである。発現したタンパク質を選択した生物から抽出します。プロIMおよびプロI mnc Resus用。

プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むSDSページローディングバッファーに細胞を懸濁します。次に、細胞を5分間煮沸し、遠心分離機で沈殿物を除去してProsolとprosol NCを抽出します。標準的な手順を使用します。pro IMSは、タンパク質がニトロセルロース膜に固定化された後にリフォールドされるため、変性条件下で抽出できます。

ただし、プロソルは、タグ付きタンパク質が抽出されると結合バッファーに追加されるため、ネイティブな確認を得るために抽出する必要があります。組換えタンパク質の濃度は、BioRad タンパク質アッセイキットなどの標準的な方法を使用して測定します。精製されたタンパク質ではなく粗抽出物がアッセイに使用される場合。

クマシ染色したSDSポリアクリルアミドゲル上の対応するバンドのデンシトメトリーを走査することにより、目的のタンパク質の濃度を推定します。既知の濃度のBSAを参照として使用します。次に、BSAの走査型デンシトメトリーで測定したシグナル強度に基づいて標準曲線をプロットし、粗抽出物に含まれるタンパク質の量を計算します。

手順の次のステップは、膜上にproIamとproIAMNCを固定することです。まず、1マイクログラム、proIamおよびproIAMNC抽出物のそれぞれをSDSポリアクリルアミドゲルに重複してロードします。電気泳動後、ガラスプレートからゲルを取り出し、100ミリリットルの転写緩衝液に入れ、室温で20分間穏やかに撹拌しながらインキュベー

トします。

インキュベーション後、ウェスタンブロットを行い、転写後にタンパク質をニトロセルロースメンブレンに移し、メンブレン結合タンパク質がリフォールディングできるようにします。メンブレンを15ミリリットルの緩衝液Aに置き、穏やかに攪拌しながらインキュベートします。残留SDSを除去するには、室温で15分間、穏やかに攪拌しながらインキュベートします。

インキュベーション後、ブレンをバッファーから慎重に取り除きます。次に、メンブレンを25ミリリットルの変性緩衝液に入れます。室温で2時間、穏やかに攪拌しながらインキュベートします。

インキュベーション中、ニトロセルロース膜は不透明になります。次に、鉗子を使用して、メンブレンを25ミリリットルのTBSに移し、穏やかに攪拌しながら5分間インキュベートします。このステップでは、メンブレンは元の白色に戻ります。

次に、メンブレンを25ミリリットルの結合緩衝液に移します。摂氏4度で穏やかに攪拌しながら一晩インキュベートします。次に、可溶性タンパク質を使用して、固定化されたタンパク質の膜をプローブします。

まず、ハイブリダイゼーションバッファーを調製し、10ミリリットルの新鮮な結合バッファーを含む別々のチューブで1〜10マイクログラムのプロソルとプロソルNCを希釈します。次に、バッファーをハイブリダイゼーションバッグに移します。次に、メンブレンを2つのストリップにカットし、両方にproIMとproIAMNCが含まれています。

これらのメンブレンは、ハイブリダイゼーションバッファーに入れられます。各メンブレンをプロソルまたはプロソルNCハイブリダイゼーション溶液に移し、室温で1.5時間静かに攪拌しながらインキュベートします。ハイブリダイゼーション溶液からメンブレンを取り出し、TBSで15分間3回すすぎます。

タンパク質タンパク質の相互作用を可視化するには、TBST中の2.5%スキムミルクでメンブレンを1時間ブロックします。インキュベーション後、ブロックしたメンブレンを一次抗体溶液に入れます。ここでは、抗連鎖球菌2ポリクローナルウサギ抗体を使用します。

インキュベーション後、穏やかに攪拌しながら室温で1時間インキュベートします。20ミリリットルのTBSTでメンブレンを15分間、室温で5分間2回、穏やかに攪拌しながらすすぎます。次に、HRP標識二次抗体溶液中にメンブレンを配置し、ここでは、HRPに標識した抗ウサギIgG抗体を使用する。

室温で1時間、穏やかに攪拌しながらインキュベートします。TBSでの最後のすすぎ後、TBSでの最後のすすぎ後、前と同様に穏やかに攪拌しながら室温で15分間および2回、TBS、HRP化学発光基質Hereミリポアを使用してタンパク質タンパク質相互作用を視覚化します。Im Molanウエスタン化学発光。

HRP基質は、プロソルの免疫ブロッティング後に使用されます。メンブレンとTBSTを室温で15分間、5分間2回すすぎます。次に、タグの一次抗体でメンブレンを再プローブしてプロにします。

その後、適切な二次抗体を投与します。化学発光を検出することにより、PRO Iおよびpro Im NNCを可視化し、タンパク質膜オーバーレイアッセイで得られたバンドの同一性を検証します。タンパク質AとK、およびYFPとMP CYFPとの間の相互作用は、ここに示すように、このビデオで説明されている方法を使用してタバコ表皮細胞で評価されました。

生体分子蛍光相補性を評価したところ、強いYFPシグナルが再構築されました。このBFCシグナルは細胞末梢のプンタに蓄積され、MPは非常に不溶性タンパク質であるため、血漿deの診断となります。細菌または植物で発現する場合、この相互作用を検証するためにタンパク質膜オーバーレイアッセイが採用されました。

1 マイクログラムの GST MP または未融合 GST を含む in vitro タンパク質抽出物を、SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動とニトロセルロースメンブレンへの電気転写により分離しました。これらのタンパク質を可溶性nnk連鎖球菌2GSTmpでプローブしたとき、しかし未融合ではなかったが、GSTは結合を示した。さらに、同じセットのプロIMSを無関係のプロソーnc IEシロイヌナズナ細胞質でプローブしたとき、NADHキナーゼタグ付き連鎖球菌2、結合は観察されず、さらにNK MP相互作用の特異性を実証しましたこの手順を試みる間、提示されたプロトコルに従って固定化されたタンパク質を適切に補充することを覚えておくことが重要です。

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