Name: タンパク質のメンブレンオーバーレイアッセイ：可溶性および不溶性タンパク質間の相互作用をテストするためのプロトコル in vitroで /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-14T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学ぶメンブレンオーバーレイアッセイによるタンパク質間相互作用解析法。不溶性タンパク質をニトロセルロース膜に固定し、可溶性タンパク質と免疫ブロッティングで検出します。in vitroで信頼性の高い結合評価が可能です。

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当研究室での作業はNIH、食と農のUSDA国立研究所、NSF、BARD、DOE、及びBSFか​​らVCへの補助金によってサポートされています

1。タンパク質の発現と抽出<ol><li>差彼らの検出をテストするタンパク質にタグを付ける。大きいサイズ（例えば、GST）のタグ付き膜（ProIM）上に固定化するタンパク質にラベルを付け、そして融合していないタグが固定されたネガティブコントロール（ProIMnc）として使用することができます。大規模または小規模なタグのいずれかを持つ水溶性プローブ​​（ProSOL）として使用するタンパク質にラベルを付けます。適切な陰性対照可溶性タンパク質（ProSOLnc）に同じタグを融合し、検出された結合の特異性を確認するために、相互作用のアッセイに含まれています。 </li><li>すなわち、E.、タグ付きタンパク質を発現する蛋白質の発現系を選択します。 大腸菌 、バキュロウイルス、等、タンパク質の潜在的な翻訳後修飾と収量のための要件に応じて。 </li><li>プロテイナーゼ阻害剤カクテルを含むSDS - PAGEローディングバッファー（20％グリセロール、4％SDS、20mMトリス- HCl、pH6.8）を用いて選択肢の生物（ステップ1.2）からProIMとProIM ncを抽出する。 15分間室温で細胞懸濁液のまま、2 - メルカプトエタノールおよび5分間沸騰の0.5％を追加。 </li><li>標準プロトコル16を使用して選択肢の生物（ステップ1.2）からProSOLとProSOL ncを抽出する。これらのタンパク質は、ステップ4.1で使用される結合バッファー（140mMのNaCl、10mMのトリス塩酸pH7.4の、2mMのEDTA、2mMのDTT、1％BSA、0.1％のTween 20）で容易に溶解する必要があります。 </li><li>このようなバイオラッドのプロテインアッセイキットなどの標準的な方法を用いて組換えタンパク質の濃度を決定する。バイオラッドのプロテインアッセイキットなど。粗抽出物ではなく、タンパク質の精製は、アッセイに使用されている場合は、クマシーブリリアントブルーR - 250と、既知の使用に染色したSDS -ポリアクリルアミドゲル上の対応するバンドの密度測定をスキャンすることにより、この抽出物中の目的のタンパク質の濃度を推定リファレンスとしてBSAの濃度。 </li></ol> 2。メンブレン上のProIMとProIMncの固定化<ol><li>抽出物の2セット標準プロトコル16に記載のSDS -ポリアクリルアミドゲル上ProIMとProIM NC1μgを含む各を解決します。 </li><li>電気泳動後、転送バッファの100ml（60 mMグリシン、10mMのトリス、0.0006パーセントSDS、20％メタノール）で、転送のゲルを置き、室温で20分間穏やかに撹拌しながらインキュベートする。 </li><li>標準プロトコル16に記載のニトロセルロース膜にゲルに含まれるタンパク質をElectrotransfer。 </li></ol> 3。膜結合タンパク質の再折りたたみ<ol><li> electrotransferした後、バッファー15ml中に15分間メンブレンをインキュベート（30 mMトリス- HCl pH7.4の、0.05％ツイーン20）残SDSを除去するために穏やかに振とうさせながら。 </li><li>慎重に排出した後、変性バッファー（7 Mグアニジン塩酸塩、2mMのEDTA、50mMのDTT、50mMのTris - HCl pH8.3）を25mlのに膜を転送する。と穏やかに撹拌しながら室温で2時間インキュベートする。 （注：変性バッファー中でインキュベートしたとき、ニトロセルロース膜が不透明になる）。と穏やかに撹拌しながら室温で2時間インキュベートする。 </li><li> 25 TBSの液（10mMのTris - HCl、150mMのNaCl、pH7.4）に、5分間穏やかに振とうさせながらインキュベートする膜を転送する（注：このステップでは、膜は元の白い色を取り戻す）。 </li><li>結合バッファーの25mlにメンブレンを移し（ステップ1.2参照）、4℃でインキュベート一晩穏やかに撹拌しながらC。 </li></ol> 4。 ProSOLでProIMをプロービング<ol><li> 2つのストリップ、両方を含むProIMとProIM NCに膜を切り取ります。 </li><li>新鮮な結合緩衝液10mlでProSOLまたはProSOLncどちら1-10μgの準備を希釈することによりProSOLとProSOLncハイブリダイゼーション溶液を加えます。 ProSOLまたはProSOLncハイブリダイゼーション溶液中にそれぞれの膜を転送し、穏やかに撹拌しながら室温で1.5時間インキュベートする。 </li><li>ハイブリダイゼーション溶液から膜を削除し、TBSで各15分を3回すすいでください。 </li></ol> 5。免疫ブロッティングによりタンパク質間相互作用の可視化<ol><li>室温で1時間TBSTでは2.5％スキムミルク（10mMトリス- HCl、140mMのNaCl、0.05％ツイーン20、pH7.4）でメンブレンをブロックする。メーカーが推奨する濃度でTBSTで0.5％スキムミルクで一次抗体（抗strepIIポリクローナルウサギ抗体）を希釈します。 </li><li>抗体溶液でブロックされた膜を配置し、4℃、室温で1時間または一晩インキュベート℃で穏やかに振とうさせながら。 </li><li> 15分間、2回穏やかに撹拌しながら室温で5分間、20mlのTBSTで膜を洗浄します。 </li><li>メーカーが推奨する濃度でTBSTで0.5％スキムミルクでホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）を結合させた二次抗体（抗ウサギIgG抗体）希釈します。二次抗体のメンブレンを置きソリューションと穏やかに撹拌しながら室温で1時間インキュベートする。 </li><li> 15分間、2回穏やかに撹拌しながら室温で5分間、20mlのTBSTで膜を洗浄します。最終的には、TBSで洗浄後、HRPの化学発光基質（例えば、ミリポアイモビロン西部化学発光HRP基質）を用いて、タンパク質 - タンパク質相互作用を可視化する。 </li><li>ステップ5.4から5.1で説明したように、適切な二次抗体が続くProIMに融合されたタグ用の一次抗体と同じ膜を、プローブ。視覚化ProIMとProIMncは、タンパク質の膜のオーバーレイアッセイ（ステップ5.5）で得られたバンドのアイデンティティを検証するためにステップ5.5で説明。この段階で得られた信号は、ステップ5.5から得られる残差信号よりもはるかに強力であるため、ほとんどの場合、ストリッピングは、必要ありません。 </li></ol> 6。代表的な結果： ANK - MPとの対話は、タバコ表皮細胞（図1A）にBiFCで観察された。 MPは、細菌や植物において発現する高度に不溶性のタンパク質であるため、タンパク質の膜のオーバーレイアッセイは 、in vitro（図1B） におけるこの相互作用を検証するために採択されました。 GST - MP（ProIM）または非融合GST（ProIM NC）1μgを含むタンパク質抽出物は、ニトロセルロース膜にelectrotransfer続いて、SDS -ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。これらProIMsは、水溶性ANK - strepII（ProSOL）、GST - MPが、融合していないではないGSTでプローブ結合展示されたとき（図1B、レーン1、2、レーン5、6に比較して）。また、ProIMsの同じセットが無関係ProSOLnc、すなわち、strepII（NADH3 - strepII）タグ付けされたシロイヌナズナ細胞質 NADHキナーゼでプローブしたときに、バインディングが観察されていない、さらにANK - MPの相互作用（図1B、レーンの特異性を実証3、4）。 <img src="/files/ftp_upload/2961/2961fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。in vivoおよび in vitro における TMV MPのタバコANKの特異的結合。 BiFCによって検出されたとしてタバコ表皮細胞を生体内に（A）ANK - MPとの対話。 MPとANKは、C末端とそれぞれYFPのN末端半分、に融合されたとき強いYFP信号が再構成され、それらのコードする遺伝子のmicrobombardment以下のタバコの表皮に共発現させた。プラスモデスム15の診断である細胞の周囲、で涙点に蓄積されたこのBiFC信号。 in vitroでの （B）ANK - MPの相互作用などの蛋白質の膜のオーバーレイアッセイによって検出。 GST - MP（ProIM）または非融合GST（ProIMnc）1μgを含むタンパク質抽出物は、ニトロセルロース膜上にelectrotransfer続いて15％SDS -ポリアクリルアミドゲル上で分離した。 GST - MPProIMとGSTProIMncはANK - strepII（ProSOL）0.5μg/ mlのと共にインキュベートし、ANKの結合は、への結合抗ウサギIgG + M二次抗体に続いて、抗strepIIウサギポリクローナル抗体と膜をプローブによって検出されたHRP（レーン1および2）。 GST - MPProIMもGSTProIMncどちらもstrepIIタグ（ProSOLnc、レーン3および4）に融合された無関係なタンパク質、 シロイヌナズナ細胞質NADHキナーゼと相互作用する。このアッセイにおいて観察されたバンドのアイデンティティは、抗GST抗体（レーン5および6）を持つ膜をプロービングにより確認された。 GST - MPおよびGST続きですタンパク質抽出物に含まれている正体不明の蛋白質が重要性を実証、ANK - strepIIと反応しながら膜を緩衝液で洗浄されることなく、変性バッファーで処理した場合、ANKにGST - MPの結合は、失われステップ3.1の前に、変性過程（レーン7および8）。

<ol><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li>
<li>Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J Mol Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+Caenorhabditis+elegans+using+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis.</a> Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).</li>
<li>Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localizing+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> Methods. 45, 196-206 (2008).</li>
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<li>Ding, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+plasmodesmata+are+specific+sites+of+localization+of+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+in+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants.</a> Plant Cell. 4, 915-928 (1992).</li>
<li>Meshi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+the+30+kd+protein+of+tobacco+mosaic+virus%3A+involvement+in+cell-to-cell+movement+and+dispensability+for+replication%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication.</a> EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).</li>
<li>Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+protein+of+tobacco+mosaic+virus+modifies+plasmodesmatal+size+exclusion+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit.</a> Science. 246, 377-379 (1989).</li>
<li>Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+functional+assay+for+tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein+and+identification+of+a+domain+involved+in+increasing+plasmodesmal+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).</li>
<li>Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANK%2C+a+host+cytoplasmic+receptor+for+the+Tobacco+mosaic+virus+cell-to-cell+movement+protein%2C+facilitates+intercellular+transport+through+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata.</a> PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).</li>
<li>Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. Taylor, G. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VIP1%2C+an+Arabidopsis+protein+that+interacts+with+Agrobacterium+VirE2%2C+is+involved+in+VirE2+nuclear+import+and+Agrobacterium+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity.</a> EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).</li>
<li>Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+tobacco+mosaic+virus+movement+protein+and+host+cell+pectin+methylesterases+is+required+for+viral+cell-to-cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement.</a> EMBO J. 19, 913-920 (2000).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このアプローチは、タンパク質の組み合わせの間のタンパク質-タンパク質相互作用をテストするのに適している、タンパク質の際に少なくとも一つは、結合バッファーに容易に可溶であり、成功したタンパク質17,18の他の組み合わせに適用した。これらの条件下で両方に不溶であるタンパク質の間iInteractionsは、このプロトコルでテストすることはできません。 また、ProIMの成功したリフォールディングは、アッセイのための非常に重要です。残留SDSが変性/再生プロセスを損なう可能性があるためelectrotransfer後にTBSで膜を洗浄すると、重要なステップです。 最後に、非特異的結合を避けるために、結合バッファーでProSOLの濃度は1μg/ mlを超えてはならない。あまりにも集中しているProSOLはProIMへの非特異的結合を示すことができる。また、ProSOLに膜固定化したタンパク質の非特異的結合をブロックするために、ステップ4.2の間に使用されるハイブリダイゼーションバッファー中のBSAは、スキムミルク...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>タンパク質アッセイキット</td><td> Bio - Rad社</td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td>プロテイナーゼ阻害剤カクテル</td><td> SIGMA </td><td> S8820 </td></tr><tr><td>ミニプロティアンシステム</td><td> BIO - RAD </td><td> 165-8000 </td></tr><tr><td>セミドライウェスタンブロッティングSD electrotransferシステム</td><td> BIO - RAD </td><td> 170-3940 </td></tr><tr><td>西洋ワサビペルオキシダーゼと結合抗ウサギIgG抗体</td><td> GenScript </td><td> A00098 </td></tr><tr><td>抗GSTウサギポリクローナル抗体</td><td> GenScript </td><td> A00097 </td></tr><tr><td>アンチstrepII </td><td> GenScript </td><td> A00626 </td></tr><tr><td> BioTrace、NTニトロセルロース転写膜</td><td>ポールサイエンティフィック</td><td> 27377-000 </td></tr><tr><td>イモビロン西部化学発光HRP基質</td><td>ミリポア</td><td> WBKL S0 050 </td></tr></tbody></table>

タンパク質のメンブレンオーバーレイアッセイ：可溶性および不溶性タンパク質間の相互作用をテストするためのプロトコル in vitroで</em

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

異なるタンパク質間の相互作用を検証することは、分子レベルでそれらの生物学的機能の研究に不可欠です。そこに結合タンパク質を評価するためのin vitroおよび in vivo の両方でいくつかの方法では、、であり、そしてお互いの欠点を補完少なくとも二つの方法は信頼性の高い洞察を得るために行われるべきである。 in vivoアッセイの場合は、二分子蛍光相補性（BiFC）アッセイは、生きた細胞内のタンパク質-タンパク質相互作用を検出するだけでなく、相互作用するタンパク質の1,2の細胞内局在を識別できる、最も人気があり、最も侵襲的なアプローチを表しています。このアッセイでは、非蛍光性のN -およびGFPまたはその変異体のC末端の半分がテストされたタンパク質に融合させ、そして2つの融合タンパク質が原因でテストタンパク質&quot;相互作用するために一緒に持って来られる時、蛍光シグナルが3-6を再構成する。その信号は、落射蛍光または共焦点顕微鏡によって容易に検出可能であるため、BiFCは、生きた細胞3のタンパク質間相互作用について研究するための細胞生物学者の間で選択の強力なツールとして登場しました。このアッセイは、しかし、時には偽陽性の結果を生成することができます。例えば、蛍光シグナルは限りお互いから7 nmが小さいため細胞内コンパートメントに梱包閉じるには、むしろそのため、特定の相互作用7のように配置された2つのGFPフラグメントによって再構成することができる。 これらの制限のため、生細胞イメージング技術から得られた結果は、タンパク質相互作用を検出するための別の原理に基づいて、独立したアプローチによって確認されるべきである。共免疫沈降法（共同IP）またはグルタチオントランスフェラーゼ（GST）プルダウンアッセイ一般的にin vitroでのタンパク質-タンパク質相互作用を分析するために使用されているような代替方法を表しています。しかし、これらのアッセイIIN、しかし、テストしたタンパク質は、結合反応のためにsupportsusedバッファーに容易に溶解する必要があります。したがって、不溶性のタンパク質が関与する特異的な相互作用は、これらの手法によって評価することができます。 ここで、我々はこの困難を回避する有効な蛋白質の膜のオーバーレイ結合アッセイ、プロトコルを示しています。タンパク質の一つが細胞膜のマトリックス上に固定化されているため、この手法では、水溶性と不溶性のタンパク質間の相互作用を確実にテストすることができます。このメソッドは、そのようなBiFCなどのin vivo実験、 のとの組み合わせで、水溶性と不溶性のタンパク質の間で忠実に相互作用を調査し、特徴付けるために信頼性の高いアプローチを提供します。この記事では、ウイルスの細胞間輸送8-14、および最近同定された植物細胞の相互作用、タバコアンキリン反復を含むタンパク質（ANK中に複数の機能を発揮するタバコモザイクウイルス（TMV）移行タンパク質（MP）、の間の結合）15は 、このテクニックを使用して示されています。

テストのタンパク質 - タンパク質相互作用は、タンパク質の機能の解離のために不可欠である。ここでは、導入<em&gt; in vitroで</em可溶性タンパク質と膜固定化タンパク質を調べるために&gt;タンパク質 - タンパク質結合アッセイ。このアッセイは、不溶性タンパク質と溶液中のタンパク質間の相互作用をテストするために信頼性の高い方法を提供する。

異なるタンパク質間の相互作用を検証することは、分子レベルでそれらの生物学的機能を研究する上で極めて重要である。いくつかの...

タンパク質の試験。タンパク質の機能解析において、タンパク質間相互作用の解明は不可欠です。本ビデオでは、膜に固定化されたタンパク質と可溶性タンパク質の相互作用を試験するための、in vitro タンパク質結合アッセイを紹介します。まず、融合タンパク質をクローニングし、発現させ、抽出します。タグ付きの不溶性タンパク質をニトロセルロース膜上に固定し、天然の状態の構造にリフォールディングさせる処理を行います。その後、膜をタグ付き可溶性タンパク質でプローブし、免疫ブロッティングを行ってタンパク質を検出します。タグ付きタンパク質が相互作用する場合、それらは膜上に固定化されたタンパク質によって捕捉され、免疫ブロッティングによるシグナルが観察されます。したがって、このアッセイは、不溶性タンパク質と溶液中のタンパク質との相互作用を検証するための信頼性の高い方法となります。GSTプルダウンなどの既存の手法に対する本技術の主な利点は、不溶性タンパク質と可溶性タンパク質との結合をin vitroで確実に評価できることです。この手順の最初のステップは、検出のための遺伝子タグ付きタンパク質を作製することです。まず、メンブレン上に固定化するタンパク質をクローニングします。固定化タンパク質をpro Imと定義し、GSTなどの大きなタグをコードする発現ベクターに組み込みます。タグのみをコードする空の発現ベクターを固定化タンパク質のネガティブコントロールとして使用し、これをpro IM ncと呼びます。次に、可溶性プローブとして使用するタンパク質を、Strep-tag IIなどの異なるタグをコードする発現ベクターにクローニングします。これを可溶性タンパク質の略称としてprosolと呼びます。陰性対照として、陰性対照用可溶性タンパク質を同じ発現ベクターにクローニングします。これを可溶性タンパク質陰性対照の略称としてProsol NCと呼びます。次に、E. coliやバクロウイルスなどのタンパク質発現システムを用いて、タグ付きタンパク質を発現させます。使用する発現システムは、翻訳後修飾の必要性に基づいて慎重に選択してください。選択した生物から発現したタンパク質を抽出します。pro IMおよびpro I mnc Resusについては、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むSDS-PAGE用試料調製バッファーで細胞を懸濁させます。次に、細胞を5分間煮沸し、遠心分離して沈殿物を除去することで、Prosolおよびprosol NCを抽出します。標準的な手順に従ってください。タンパク質はニトロセルロース膜に固定された後にリフォールディングされるため、pro IMSは変性条件下で抽出することが可能です。ただし、タグ付きタンパク質を抽出した後に結合バッファーに添加するため、天然の状態を確認するためにプロソルを抽出しておく必要があります。BioRadタンパク質アッセイキットなどの標準的な方法を用いて、組換えタンパク質の濃度を決定してください。アッセイに精製タンパク質ではなく粗抽出液を使用する場合の手順は以下の通りです。クマシー染色したSDSポリアクリルアミドゲルの対応するバンドをスキャニングデンシトメトリーで測定し、目的タンパク質の濃度を推定します。その際、既知濃度のBSAをリファレンスとして使用します。次に、BSAのスキャニングデンシトメトリーで測定された信号強度に基づいて標準曲線をプロットし、粗抽出液に含まれるタンパク質量を算出します。手順の次のステップは、pro Iamおよびpro IAM NCをメンブレン上に固定することです。まず、pro Iamおよびpro IAM NCの抽出物をそれぞれ1 µgずつ、SDSポリアクリルアミドゲルに二連でロードします。電気泳動後、ガラスプレートからゲルを取り出して100 mLの転写バッファーに入れ、室温で20分間、緩やかに攪拌しながらインキュベートします。インキュベーション後、ウェスタンブロットを行い、タンパク質をニトロセルロース膜に転写します。転写後、膜に結合したタンパク質をリフォールディングさせます。膜を15 millilitersのバッファーAに入れ、緩やかに振盪しながらインキュベートします。残留したSDSを除去するため、室温で15分間、緩やかに振盪しながらインキュベートしてください。インキュベーション後、緩衝液からメンブレンを注意深く取り出します。次に、メンブレンを25 millilitersの変性緩衝液に入れます。室温で緩やかに攪拌しながら2時間インキュベートします。インキュベーション中、ニトロセルロース膜は不透明になります。次に、ピンセットを使用して膜を25 millilitersのTBSに移し、穏やかに振盪しながら5分間インキュベートします。このステップで、膜は元の白色に戻ります。次に、メンブレンを25 mLの結合バッファーに移します。4 °Cで緩やかに振盪しながら一晩インキュベートします。続いて、可溶性タンパク質を用いて、固定化タンパク質のメンブレン上のプローブを行います。まず、ハイブリダイゼーションバッファーを調製します。10 mLの新鮮な結合バッファーを含む別々のチューブに、1～10 µgのprosolおよびprosol NCを希釈します。その後、バッファーをハイブリダイゼーションバッグに移します。次に、メンブレンを2本のストリップに切り分け、それぞれにpro IMおよびpro IAM ncを含ませます。これらの膜をハイブリダイゼーションバッファーに入れます。各膜をprosolまたはprosol NCハイブリダイゼーション溶液に移し、室温で緩やかに攪拌しながら1.5時間インキュベートします。膜をハイブリダイゼーション溶液から取り出し、TBSで15分間の洗浄を3回行います。タンパク質間相互作用を可視化するために、2.5%スキムミルクを含むTBSTでメンブレンを1時間ブロッキングします。インキュベーション後、ブロッキングしたメンブレンを一次抗体溶液に入れます。ここでは、anti-strep twoポリクローナルウサギ抗体を使用します。緩やかな攪拌を行いながら、室温で1時間インキュベートします。その後、20 mLのTBSTで15分間、さらに室温で緩やかな攪拌を行いながら5分間を2回、メンブレンを洗浄します。次に、メンブレンをHRP標識二次抗体溶液に浸します。ここでは、HRP標識抗 rabbit IgG抗体を使用します。室温で緩やかに攪拌しながら1時間インキュベートします。メンブレンを20 mLのTBSTで15分間洗浄し、その後、同様に室温で緩やかに攪拌しながら5分間の洗浄を2回行います。最後にTBSで洗浄した後、HRP化学発光基質（Millipore社製 Molan Western Chemiluminescent）を用いてタンパク質間相互作用を可視化します。プロソールのイムノブロッティング後、HRP基質を使用します。メンブレンをTBSTで室温にて15分間1回、その後5分間2回すすぎます。次に、タグに対する一次抗体を用いてメンブレンを再プローブします。続いて、適切な二次抗体を加えます。タンパク質膜オーバーレイアッセイで得られたバンドの同一性を検証するため、化学発光を検出してPRO Iおよびpro Im NNCを可視化します。タンパク質AおよびKと、YFPおよびMP CYFPとの相互作用を、ここに示す本ビデオで説明した方法を用いてタバコ表皮細胞で評価しました。バイオ分子蛍光相補法により評価したところ、強いYFP信号が再構成されました。このBFC信号は細胞辺縁のPuntaに蓄積しており、MPが極めて不溶性のタンパク質であることを踏まえると、これは細胞膜に存在することを示しています。細菌または植物で発現させた際には、この相互作用を検証するためにタンパク質膜オーバーレイアッセイを採用しました。1 µgのGST MPまたは非融合GSTを含むin vitroタンパク質抽出液をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、その後ニトロセルロースメンブレンに電気的に転写しました。これらのプロテイン膜を可溶性a nnk strep twoでプローブしたところ、非融合GSTではなくGST mpに結合が認められました。さらに、同一のプロテイン膜を、関連のないpro saw nc IE Arabidopsis Cytoplasmic, NADH kinase tagged strep twoでプローブしたところ、結合は観察されず、A NK MP相互作用の特異性がさらに実証されました。この手順を行う際は、提示されたプロトコルに従い、固定化タンパク質を適切に補充することを忘れないでください。

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タンパク質のメンブレンオーバーレイアッセイ：可溶性および不溶性タンパク質間の相互作用をテストするためのプロトコル in vitroで

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