フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

フローサイトメトリーによる免疫細胞の亜集団と定義されたナノ粒子の相互作用の解析。

この手順の全体的な目標は、フローサイトメトリーによって初代免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子相互作用を検出することです。これは、まず目的の細胞をナノ粒子で処理することによって達成されます。次のステップでは、細胞を細胞特異的な表面マーカーに対する抗体で標識し、フローサイトメトリーで分析します。

最終的には、ナノ粒子と個々の免疫細胞集団との相互作用を測定することができます。顕微鏡法のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、この技術を用いて、ナノ粒子によって誘導される蛍光強度の変動を非接着性細胞集団で定量化できることである。12ウェルプレートの各ウェルに。

次に、新たに調製した10マイクロリットルの作業用蛍光二酸化ケイ素ナノ粒子懸濁液を各実験ウェルに加え、この時点でも未処理のコントロールウェルに等量の完全な培地を加えます。摂氏37度で1時間の内在化の後、サンプルを個々の1.5ミリリットルポリプロピレンチューブに移し、次にサンプルを6、000倍Gおよび室温で3分間スピンダウンして、CD14で細胞を染色します 青いインキュベートを介してCD 14で細胞をインキュベートします ヒト抗体の10マイクロリットルで各細胞懸濁液の100マイクロリットルを1対11の比率で 1 対 11の比率で、摂氏4度で10分間実行緩衝液。未結合の抗体を1ミリリットルのランニングバッファーで洗い流した後、細胞を200マイクロリットルの新鮮なランニングバッファーに再懸濁してフローサイトメトリー分析を行います。

次に、スペクトルスピルオーバー補正を設定するには、フローサイトメトリーソフトウェアの装置設定ボックスを開き、抗体非標識ナノ粒子フリーサンプルを低速で取得します。蛍光ナノ粒子の存在下での補正設定の調整は、ナノ粒子が側方散乱に干渉して成功を確実にする可能性があるため、手順の最もトリッキーな部分であり、目的の細胞集団のゲートを定義する必要があります。次に、目的の細胞集団の周囲に適切な大きなゲートを描画します。

ラベルのない別のサンプルをロードし、機器設定ボックスの補正タブを開きます。スピルオーバーチャネルの蛍光強度が蛍光色素陽性集団と蛍光陰性集団でほぼ同じになるまで、取り込み中に補償係数を調整します。最後に、染色された各蛍光色素コントロールチューブの補正を調整した後、ナノ粒子に応答した白血球の挙動をより良く特徴付けるために、ナノ粒子処理されたサンプルを読み取り、今実証したように内部化アッセイを行った。

例えば、この代表的な実験では、PBMC単離後の前方散乱と側方散乱により、3つの主要な血液白血球亜集団が明確に同定されました。さらに、fz二酸化ケイ素処理後、リンパ球、単球、および顆粒球は、蛍光強度で示されるように異なるナノ粒子内在化速度を示しました。これらの画像では、pbmcから精製された初代CD14陽性単球においてナノ粒子の内在化が実証されています。

これらの散布図は、フィッツの二酸化ケイ素ナノ粒子の存在下でCD14陽性単球を示しています。ヒストグラムは、蛍光強度として表される適合陽性細胞の定量を示しています。同様の内在化実験を、TP One単球をフィッツの二酸化ケイ素ナノ粒子の濃度を上げて処理し、未処理の細胞をネガティブコントロールとして行った。

ドットプロットは、ナノ粒子の内在化後のTP細胞株の前方散乱が変化しない場合の側方散乱の用量依存的な増加を示しています。これらのグラフからのデータは、フィッツの二酸化ケイ素ナノ粒子による処理が、免疫細胞とナノ粒子との間の相互作用についてのさらなる洞察を得るために細胞内粒度の向上によって強調された単球における用量依存的な内在化を誘導することを示唆しており、ミクログリアをin vitroで7日間培養し、ナノ粒子と1時間インキュベートした。蛍光顕微鏡法では、多数のGFP陰性非接着性アストロサイトおよび一部のGFP陽性細胞を有する混合初代グリア細胞培養が示された。

この代表的な実験では、3つのグリア亜集団を、単一のCD 11 B抗体染色CD11 B、陰性のGFP陰性星状細胞および他のグリア細胞のミクログリアCD11 B陽性GFP陰性細胞、およびCD 11 B陽性GFP陽性亜集団を用いたフローサイトメトリーによって区別することができた。後者の2つの亜集団は、GFP陽性集団によるわずかに増加した欠損でナノ粒子を内在化することができます。ナノ粒子の内在化は、ロッドドミン二酸化ケイ素ナノ粒子を使用して、この画像で示されているように、共焦点顕微鏡によってさらに検証できます。

この手順を試行する際は、蛍光色素の漂白を避けるためにサンプルを暗所に保管し、抗体インキュベーション中はサンプルを4度に保つことを忘れないでください。この手順に続いて、共焦点顕微鏡などの他の方法を実行して、ナノ粒子の細胞内局在に関する追加の質問に答えることができます。