In Vitro食作用アッセイ:リアルタイムのアストロサイト媒介性シナプトソーム食作用を研究するためのライブイメージングベースの方法

シナプトソームは、シナプス小胞に富む単離されたニューロン画分です。これらのシナプトソームは、食作用として知られるプロセスによって、脳内の免疫細胞の集団であるアストロサイトに飲み込まれます。

アストロサイトを介した食作用をin vitroで研究するには、アストロサイトの単層を含む培養プレートを採取することから始めます。次に、pH指示薬共役シナプトソーム懸濁液をプレートに加えます。この指示色素は、低pHでのみ蛍光を発する性質を持っています。プレートを所望の時間インキュベートします。

インキュベーション中、シナプトソームの外膜に存在するホスファチジルセリンまたはPSは、星状細胞膜上の対応するPS受容体に結合することを可能にする。これにより、基部でのシナプトソームの定着が容易になります。使用済み培地を、結合していないシナプトソームとともにプレートから吸引します。

次に、プレートに食作用促進因子を補充し、インキュベートします。続いて、蛍光顕微鏡を用いてプレートを画像化する。表面に結合すると、アストロサイトがシナプトソームを飲み込み、ファゴソームに侵入します。ファゴソーム内に入ると、pHが低いと、指示色素分子が明るく蛍光を発します。

リアルタイムイメージングにより、アストロサイトに飲み込まれたpH指示薬共役シナプトソームに対応する明るい蛍光スポットの存在が明らかになります。最終的に、これらのスポットは消え、シナプトソームの分解が成功したことを示しています。

シナプトソームの巻き込みのライブイメージングでは、まず、コンフルエント星状細胞培養の各ウェルから上清を除去し、洗浄ごとに1ミリリットルのDPBSで細胞を3回すばやく洗浄します。最後の洗浄後、300マイクロリットルの免疫パン化アストロサイト塩基性培地と5マイクロリットルのpHインジケーター結合シナプトソーム、およびグリア細胞の食作用を調節できる追加の因子を追加します。

シナプトソームがウェルの底に落ち着き、摂氏37度、二酸化炭素5%でアストロサイトのホスファチジルセリン受容体に付着します。40分後、上清を捨て、洗浄ごとに1ミリリットルのDPBSでウェルをすばやく、しかし穏やかに3回洗浄します。

最後の洗浄後、目的の因子を添加した500マイクロリットルの新鮮な培地を適切なウェルに加え、プレートをライブイメージング装置に移します。イメージング位置を選択し、フォーカス、露光時間、明るさ、LEDパワーを調整し、実験的に適切なライブイメージングの画像フォーマット、時間間隔、および合計サイクル数を設定します。次に、食作用実験のライブイメージングを開始します。