網膜ミクログリアの貪食機能を評価します

この手順の全体的な目的は、生体内（in vivo）における網膜ミクログリアの貪食機能を評価することです。この手法は、特定の化合物が生理学的環境においてミクログリアの貪食機能を変化させるかどうかなど、眼科学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、フローサイトメトリーを用いることで、ミクログリアの貪食作用の迅速かつ精密な定量分析が可能であることです。

私の研究室のポストドクターである作本進氏に、手順のデモンストレーションを補助してもらいます。まず、33ゲージの針とシリンジに、蛍光標識粒子溶液を0.5 µL充填します。次に、麻酔をかけたマウスを手術用顕微鏡下の柔らかい素材の上に横向きに置き、足指をつまんで反応がないことを確認して、適切な鎮静レベルにあることを確認します。

次に、ピンセットを用いて一方の眼瞼の周囲を慎重に圧迫し、眼球が眼窩からわずかに飛び出すようにします。その後、耳のすぐ上の部分と動物の下顎を2本の指で掴み、眼瞼と平行に皮膚を緩やかに伸ばして、眼球がわずかに突出した状態を維持します。硝子体内注射は困難であり、正しく行われないと結果に偏りやばらつきが生じます。

眼への損傷を軽減するため、頭部の動きを最小限に抑え、動物を安定した状態で保持します。眼球を穿刺するために、片手でマウスを優しく保持します。次に、角膜と強膜の接合部である角膜縁を確認します。有色マウスでは、ここは灰色の円として見えます。

もう一方の手でシリンジを持ち、針を角膜輪部に刺入します。次に、針をわずかに引き戻して少量の硝子体液を排出し、ゆっくりとプランジャーを押し下げて粒子を注入します。すべてのビーズを注入し終えたら、注入した物質の逆流を防ぐためにシリンジをゆっくりと引き抜き、眼球が元の位置に戻った後、保湿点眼薬を投与して眼球の水分を維持します。

その後、動物を個別のケージ内のヒーティングパッドの上に置き、完全に回復するまで観察します。硝子体内注射から3時間後、45度角度ピンセットを用いて眼瞼を軽く押し、眼球を脱出させます。ピンセットを眼球の後方に配置して牽引します。

次に、解剖顕微鏡下で、カルシウムおよびマグネシウムを含む少量のPBSを入れたペトリ皿の乾燥したエリアに眼球を移します。そして、超極細ピンセットの先端を用いて、角膜輪部を穿孔します。続いて、眼球を45度角度付きの精細ピンセットで固定し、円周の約半分が切れるまで、スプリングシザーで角膜輪部周辺を切開します。

眼球をPBSに移し、2組目の45度角度付き精密切断鉗子を用いて、角膜と強膜を切り離します。これにより、水晶体と網膜がそのまま取り出されます。水晶体と網膜が確実に分離していることを確認し、網膜をカルシウムおよびマグネシウムを含む2 mLのPBSが入った5.4 mLポリスチレン製試験管に移します。

網膜細胞の単一細胞懸濁液を得るには、製造元の指示に従って神経組織解離キットを使用し、細胞を 200 µL の染色バッファーに再懸濁します。次に、サンプルを 96ウェルU底プレートの1ウェルに移します。遠心分離後、プレートを反転させて上清を除去し、CD16、CD32抗体を含む染色バッファーを1ウェルあたり 25 µL 加え、室温で5分間静置してFC受容体をブロッキングします。

次に、目的の抗体を用いて細胞を室温・暗所で15分間ラベルします。その後、細胞をペレット化し、各ウェルに200 µLの新鮮な染色バッファーを加えて洗浄します。次いで、ペレットを200 µLの染色バッファーおよび生存率染料で再懸濁し、サンプルを1.2 mLマイクロタイターチューブに移します。

その後、ウェルをさらに100 µLの染色バッファーおよび生存率染料で洗浄し、洗浄液を対応するサンプルと合わせて回収し、フローサイトメトリーで解析します。この手法は、生後10〜20日または成体マウスで使用でき、化合物による影響や、マイクログリアの食作用に対する遺伝的操作の効果を検証するために適応させることが可能です。例えば、本実験において、LPSを異なる用量で腹腔内投与したところ、溶媒のみを投与した対照群と比較して、1.42 mg/kgのLPS投与により、食細胞化したマイクログリアの割合が統計的に有意に増加することが確認されました。

この手法を習得すれば、適切に実施することで6時間以内に完了できます。本手順に続き、細胞ソーティング後のqPCRやプロテオミクス解析などの他の手法を用いることで、網膜における食作用を持つミクログリアとそうでないミクログリアの違いについて、さらに詳細な疑問を検討することが可能です。本手法の開発により、視覚および神経科学の研究者が、生理学的に関連のある状況下で、in situにおけるミクログリアの食細胞機能についてさらに探究することが可能になると期待しています。