網膜ミクログリアの貪食機能を評価しますインビボフローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました
2016年10月18日
組織の恒常性と不十分な食細胞機能の維持が病態に関与しているためにミクログリアの貪食作用が重要です。しかしながら、 インビボでのミクログリアの機能を評価することは技術的に困難です。私たちは、正確に監視し、生理的な環境の中でミクログリアの貪食の可能性を定量化するためのシンプルでありながら堅牢な技術を開発しました。
この手順の全体的な目標は、in vivo で網膜ミクログリアの食作用機能を評価することです。この方法は、特定の化合物が生理学的環境でミクログリアの食作用機能を変化させるかどうかなど、眼科分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、フローサイトメトリーを使用しているため、ミクログリア食作用の迅速かつ正確な定量分析が可能になることです。
この手順のデモンストレーションを手伝ってくれるのは、私の研究室のポスドクである崎本進です。まず、33ゲージの針とシリンジに0.5マイクロリットルの蛍光標識粒子溶液を装填します。次に、麻酔をかけたマウスを手術用顕微鏡で柔らかい材料の上に横向きに置き、つま先のつま先をつまむことに反応しないことで適切な鎮静レベルを確認します。
次に、鉗子を使って片方のまぶたの周りに慎重に圧力をかけ、眼球がソケットからわずかに飛び出すようにします。次に、耳のすぐ上と動物の顎のそばにある2本の指で頭をつかみ、まぶたと平行に皮膚をそっと伸ばして、目がソケットからわずかに膨らむようにします。硝子体内注射は困難であり、正しく行わないと偏りのある変動する結果につながります。
目への外傷を減らすために、頭の動きを最小限に抑えて動物を安定した位置に保持します。眼球に穴を開けるには、片手でマウスをそっとつかみます。次に、角膜と強膜が接続する角膜辺縁部を見つけます(色素沈着マウスでは灰色の円として見えます)。
もう一方の手でシリンジを持って、針をリンバスに挿入します。次に、針を少し引っ込めて少量の硝子体液を排出し、プランジャーをゆっくりと押し下げて粒子を注入します。すべてのビーズが送達されたら、注射器をゆっくりと引き抜いて注入された材料の逆流を防ぎ、目が元の位置に戻ったら、保湿液を塗布して目の水分を保ちます。
次に、動物を完全に回復するまで監視しながら、動物を自分のケージの加熱パッドに置きます。硝子体内注射の3時間後、45度の角度の鉗子を使用してまぶたを優しく押し、眼球を支えます。鉗子を眼球の後ろに置き、引っ張ります。
次に、眼球をシャーレの乾燥領域に移し、少量のPBSとカルシウムとマグネシウムを含ませたものを解剖顕微鏡で観察します。そして、極細鉗子の先端を1本使用して、角膜輪部に眼を穿孔します。次に、45度の角度の細かい鉗子で眼球を保持し、スプリングハサミを使用して角膜辺縁部の周りを円周の約半分が切断されるまで切断します。
眼球をPBSに移し、2組目の細い45度の角度の鉗子を使用して角膜と強膜を引き裂きます。レンズと網膜は無傷で出てきます。レンズと網膜が分離されていることを確認し、網膜をカルシウムとマグネシウムを含む2ミリリットルのPBSを含む5.4ミリリットルのポリスチレン試験管に移します。
網膜細胞の単一細胞懸濁液を得るには、製造元の指示に従ってニューロン組織解離キットを使用し、細胞を200マイクロリットルの染色緩衝液に再懸濁します。次に、サンプルを96ウェルU底プレートの1つのウェルに移します。遠心分離後、プレートを反転させて上清を廃棄し、室温で5分間、ウェルあたりCD16、CD32抗体を含む25マイクロリットルの染色緩衝液でFC受容体をブロックします。
次に、目的の抗体で細胞を標識し、室温の暗所で15分間。次に、細胞をペレット化し、これに続いてウェルあたり200マイクロリットルの新鮮な染色緩衝液で洗浄します。次に、ペレットを200マイクロリットルの染色緩衝液と生存率染料に再懸濁し、サンプルを1.2ミリリットルのマイクロタイターチューブに移します。
次に、さらに100マイクロリットルの染色バッファーと生存率色素でウェルを洗浄し、フローサイトメトリーによる分析のために対応するサンプルと洗浄液をプールします。この方法は、出生後10〜20日齢のマウスまたは成体マウスに使用でき、化合物の影響および/またはミクログリア食作用の遺伝子操作をテストするために適合させることができます。たとえば、さまざまな用量の LPS を使用した腹腔内チャレンジ後のこの実験では、1 キログラムあたり 1.42 ミリグラムの LPS 用量で、ビヒクル チャレンジ コントロールと比較して、食作用性ミクログリアの割合が統計的に有意に増加することが決定されました。
このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば6時間で完了することができます。この手順に続いて、細胞ソーティングとそれに続くqPCRまたはプロテオミクス分析などの他の方法を使用して、網膜の食作用性ミクログリアと非食作用性ミクログリアの違いに関するさらなる質問に答えることができます。この技術を開発することで、視覚科学者や神経科学者が、その場で生理学的に重要な状況でミクログリアの食作用機能をさらに探求することを可能にする
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概要
この記事では、網膜ミクログリアの食作用機能をin vivoで評価する新しい技術を紹介します。フローサイトメトリーを用いて、研究者はミクログリアの食作用の速くて正確な定量分析を達成でき、これは組織のホメオスタシスと病理を理解する上で不可欠です。
主要な研究要素
科学分野
- 神経科学
- 眼科学
- 細胞生物学
背景
- ミクログリアの食作用は組織のホメオスタシスを維持するために不可欠です。
- 不十分な食作用機能は様々な病理と関連しています。
- in vivoでのミクログリア機能の評価には技術的な課題があります。
- フローサイトメトリーは分析のための堅牢な方法を提供します。
研究目的
- 生理学的環境下での網膜ミクログリアの食作用機能を評価すること。
- 特定の化合物がミクログリアの食作用に与える影響を決定すること。
- 眼科学の将来の研究のための信頼できる方法を提供すること。
使用された方法
- 蛍光標識された粒子溶液を33ゲージの針に充填すること。
- 精密な観察のために外科用顕微鏡を使用すること。
- 適切な鎮静を確保するために麻酔をかけたマウスをモニタリングすること。
- 定量分析のためにフローサイトメトリーを採用すること。
主な結果
- この技術により、ミクログリアの食作用の正確な測定が可能になります。
- フローサイトメトリーは従来の方法と比較して迅速な結果を提供します。
- 化合物が食作用機能に与える潜在的な影響を評価できます。
- この方法は健康と疾病におけるミクログリアの役割の理解を深めます。
結論
- 開発された技術はミクログリア機能の研究のための重要な進歩です。
- これは神経炎症と網膜の健康に関する研究の新たな道を開きます。
- 将来の研究はこの方法を活用して治療介入を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of retinal microglial phagocytic function using flow cytometry addresses a critical gap in CNS target validation and mechanistic de-risking for neuroinflammatory and neurodegenerative disease pipelines. This approach enables precise, reproducible measurement of microglial activity in physiologically relevant settings, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. The method's adaptability and speed facilitate robust compound evaluation and portfolio triage for CNS and ophthalmology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of microglial phagocytic function in vivo for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying functional responses to genetic or pharmacological perturbations.
- Facilitates predictive confidence in CNS and retinal disease models by providing quantitative readouts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, physiologically relevant microglial systems for downstream compound screening.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative phagocytosis measurements via flow cytometry.
- Enables rapid assessment of compound effects on microglial function, supporting scalable screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker development in neurodegeneration and retinal disorders.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling in vivo functional assays.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative microglial activity data.
Pipeline & Workflow Integration
This flow cytometry-based assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing, compound screening, and translational research in CNS and ophthalmology pipelines.
- Discovery Biology: Quantifies microglial phagocytosis to clarify pathway function and de-risk biological hypotheses.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in validated in vivo systems.
- Analytics: Generates statistically robust measurements for comparing experimental conditions and compound effects.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical studies by enabling functional biomarker alignment in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to various CNS and retinal research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microglial target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, rapid, and scalable phagocytosis assays for cross-team use.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust functional data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of CNS and ophthalmology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent ocular procedures and flow cytometry analysis.
- Needs access to surgical microscopes, flow cytometers, and validated antibody panels.
- Demands cross-team standardization of injection and analysis protocols for reproducibility.
- Adaptable to different rodent ages and potentially other CNS tissues with protocol optimization.
- Dependent on precise intravitreal injection technique to minimize variability and bias.
