TALEN媒介標的遺伝子組み込み:hiPS細胞への蛍光タンパク質遺伝子の精密挿入のための遺伝子組換え配列特異的ヌクレアーゼの使用

培地中のヒト人工多能性幹細胞またはhiPS細胞懸濁液から始めます。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼまたはTALENをコードするプラスミドのペアを追加します。蛍光タンパク質遺伝子を有するドナープラスミドを、抗生物質耐性遺伝子と結合させ、標的遺伝子座への特異的アライメントのための隣接する相同性アームを添加します。

混合物をエレクトロポレートして細胞膜に一過性の細孔を生成し、プラスミドの内在化を可能にします。細胞内に入ると、TALENをコードするプラスミドが処理され、非特異的FokI制限エンドヌクレアーゼ切断ドメインに融合した部位特異的なTALE DNA結合ドメインで構成されるキメラタンパク質であるTALENが生成されます。

各TALENモノマーは、タンデムアミノ酸リピートモジュールを含むDNA結合ドメインを介して、スペーサー配列で分離された反対の方向の各DNA鎖上の標的遺伝子座(ヌクレオチドごとに1つのモジュール)を認識して結合します。次に、FokIドメインはスペーサー配列内でDNAを二量体化して切断し、オーバーハングを伴う二本鎖切断を作成します。

切断部位に隣接する領域に相補的な相同性アームを含むドナープラスミドの存在下では、相同配列をDNA修復合成のテンプレートとして利用して二本鎖切断を橋渡しする相同性指向修復が発生します。ニックのライゲーションに続いて、介在する蛍光タンパク質と抗生物質耐性遺伝子が宿主ゲノムに組み込まれます。

増殖をサポートするためにフィーダー細胞層に播種されたhiPS細胞を抗生物質含有培地で処理します。プロモーターレス抗生物質耐性遺伝子は、上流の内因性プロモーターによって駆動され、TALEN編集細胞の選択を容易

まず、iPS細胞培養物をPBSで1回ずつ洗浄し、次に1ミリリットルの摂氏37度の穏やかな細胞解離試薬を各ウェルに加え、細胞を摂氏37度で約5分間インキュベートします。細胞の50%以上が培養容器から解離した場合は、P1000ピペットを使用して、残っている細胞の塊または付着した細胞を機械的に破壊します。次に、各ウェルに2ミリリットルのE8培地を加え、10ミリリットルのピペットを使用して培養物をさらに単一細胞懸濁液に分解します。

次に、採取した細胞を15ミリリットルの円錐形のチューブに注ぎ、回転させます。ペレットを最小量のE8培地に再懸濁して計数します。次に、トリパンブルー排除による培養物の生存率と十分な解離を確認した後、300万個の細胞を2本の15ミリリットルの円錐形チューブにそれぞれ移します。

細胞が遠心分離している間に、エレクトロポレーションシステムをヒト胚性幹細胞株H9の細胞型特異的プログラムに設定します。次に、対照サンプルには10マイクログラムの相同組換えドナーを単独で1ペレットに加え、実験サンプルには10マイクログラムの相同組換えドナープラスミドと各TALENプラスミド5マイクログラム

次に、100マイクロリットルの室温完全P3初代細胞トランスフェクション溶液を対照ペレットと実験ペレットのそれぞれに加え、細胞を再懸濁します。サンプルを個々のキュベットに移し、サンプルをエレクトロポレートします。トランスフェクションの直後に、500マイクロリットルの室温E8培地を各キュベットに加え、次に、トランセクトされたiPS細胞サンプルをDR4マウス胚性線維芽細胞を含む個々の10センチメートルの皿に滴下移します。