シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入
May 10th, 2020
ここで、 piggyBacベースのドナープラスミドとCas9ニッカーゼ変異体を用いたヒト多能性幹細胞におけるシームレスな遺伝子編集のための詳細な方法について述べる。ヒト胚性幹細胞(hESC)の肝細胞核因子4α(HNF4α)遺伝子座のエクソン8に2点変異を導入した。
ヒト多能性幹細胞の遺伝子編集は困難です。このプロトコルは、標的ベクターと組み合わせたペアのCas-90ケースを使用して、これらの細胞におけるゲノム編集の詳細な手順を提供します。信頼性が高く、フォローしやすいです。
このプロトコルの主な利点は、シームレスなゲノム編集であることです。2段階の選択により、標的細胞を増やすことができ、ジェノタイピングスクリーニングがより効率的になりました。ヒト多能性幹細胞をmTeSR1培地中の組換えラミニン21コード表面上に維持します。
細胞は、1〜3の分割比の72時間後に70〜85%のコンフルエンシーに達するはずです。トランスフェクションの日には、24ウェルプレートの十分なウェルに300マイクロリットルのラミニン521溶液をコーティングし、プレートを摂氏37度で少なくとも2時間インキュベートします。インキュベーション後、コーティング溶液を静かに除去し、すぐに300マイクロリットルの新鮮なmTeSR1培地を各ウェルに10マイクロモルのROCK阻害剤を加えます。
その後、プレートをインキュベーターに戻します。ストックヒト多能性幹細胞をインキュベーターから取り出します。使用済みの培地を取り除き、1ミリリットルの滅菌DPBSで細胞を1回洗浄します。
次に、1ミリリットルの穏やかな細胞解離試薬を各ウェルに加え、摂氏37度で6〜8分間インキュベートして細胞を解離します。プレートを軽くたたいて、細胞が簡単に剥がれることを確認します。次に、P1000チップを使用して、ピペッティングで上下に動かして細胞を持ち上げます。
2ミリリットルのmTeSR1培地とROCK阻害剤を添加して、解離を終了します。懸濁液をよく混合し、50ミリリットルのチューブに移します。細胞を200 Gで3分間遠心分離します。
次に、上清を取り除き、ROCK阻害剤を含む2ミリリットルのmTeSR1培地に細胞を再懸濁します。血球計算盤とトリパンブルーを使用して細胞を数えます。各ヌクレオフェクション反応について、800,000〜100万個の細胞を1.5ミリリットルのチューブに移し、それらを200Gで3分間遠心分離します。
次に、上清を慎重に吸引します。ヒト幹細胞ヌクレオフェクションキットの混合ヌクレオフェクション溶液100マイクロリットルに、ペアになったCas-9nシングルガイドRNA発現プラスミド3マイクログラムとターゲティングベクタープラスミド5マイクログラムを混合します。GFPコントロールプラスミドミックスも調製します。
DNAミックスで細胞を再懸濁し、エレクトロポレーションキュベットに移し、気泡を避けます。ヒト多能性幹細胞に最適化された条件を用いて、ヌクレオフェクションデバイスを用いて細胞をエレクトロポレーションします。すぐに、10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した500マイクロリットルの新鮮で温かいmTeSR1培地をエレクトロポレーション細胞に加えます。
次に、混合物を事前に調製した24ウェルプレートの2つのウェルに移します。プレートを5%の二酸化炭素が供給された摂氏37度のインキュベーターに入れて、細胞が回復するのを待ちます。12〜16時間後に細胞維持培地を交換し、細胞が細胞間接触を確立した場合はROCK阻害剤を回収します。
24〜48時間後、コントロール細胞でのGFP発現を調べて、ヌクレオフェクション効率を確認します。ヌクレオフェクションの48時間後に、mTeSR1培地に1ミリリットルあたり1マイクログラムのピューロマイシンを補充して、細胞の選択を開始します。72時間後、培地に0.5マイクログラム/ミリリットルのピューロマイシンを補給します。
細胞の密度が30%未満の場合は、培地に10マイクロモルのROCK阻害剤も補充します。ヌクレオフェクションの4〜6日後、ピューロマイシン耐性細胞をウェルあたり0.8細胞の濃度で10〜15個の96ウェルプレートに継代する。培地にはROCK阻害剤とピューロマイシンを必ず補充してください。
細胞を摂氏37度と二酸化炭素10%に10〜12日間維持して、単一細胞由来のコロニーを形成します。播種から7日後に培地を補充します。1つのコロニーを含むウェルに印を付け、培地を1ミリリットルあたり0.5マイクログラムのピューロマイシンを含む新鮮なmTeSR1培地と交換しますが、ROCK阻害剤は含みません。
細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%でさらに2日間成長させます。次に、未分化コロニーを含むウェルの培地を変更します。コロニーを静かにこすり落とし、細胞懸濁液を1つのコロニーから別々の96ウェルプレート上の2つの新しいウェルに移します。
1つはジェノタイピング用、もう1つはメンテナンス用です。ジェノタイピング細胞のコンフルエンシーが50%以上に達したら、使用済みの培地を捨て、細胞をDPBSで一度洗浄します。Bradley Lysis Bufferで細胞を溶解し、各ウェルからゲノムDNAを単離します。
3つのプライマージャンクションPCRを実施し、製品のシーケンシングを行った後、コロニーを正しい遺伝子型に保ち、残りは廃棄します。連続的なピューロマイシン選択の下で正しいコロニーを拡大し、できるだけ早く凍結します。このプロトコルは、肝細胞核因子4α遺伝子のエクソン8に2つの点変異を導入するために使用されました。
3プライマーベースのPCR法を使用して、正しく標的化された細胞をスクリーニングし、PCR結果を確認するためにサンガーシーケンシングを実施しました。選択カセットの除去後、改変された領域を再度シーケンシングして、所望の点突然変異の正しい導入を確認しました。正しい遺伝子型のコロニーを選択し、さらなる分析の前に細胞を特徴付けました。
編集された細胞は親細胞と同じ形態を持ち、転写因子NanogやOct4などの代表的なヒト多能性幹細胞マーカー、細胞表面マーカーであるSSEA-4やTRA-160を発現しています。この手順を試みるときは、最初の24時間でピューロマイシン選択後の細胞の密度を確認することを忘れないでください。中央値をROCK阻害剤で補うことが不可欠です。
細胞の密度が30%未満の場合、細胞を続けます。ゲノム編集された多能性幹細胞株が確立されると、遺伝子機能や指向性分化の研究に使用できます。この手法は、研究者が遺伝子の特定の機能や遺伝性疾患の標的遺伝子修正など、さまざまな問題を研究するための道を開きます。
概要
この記事では、piggyBacベースのドナープラスミドとCas9ニッカーゼ変異体を使用して、ヒト多能性幹細胞におけるシームレスな遺伝子編集の詳細なプロトコルを提示します。この方法は、ヒト胚芽幹細胞のHNF4α遺伝子座に2つの点変異を導入することに成功しました。
主要な研究要素
科学の分野
- 遺伝子編集
- 幹細胞生物学
- ゲノミクス
背景
- ヒト多能性幹細胞における遺伝子編集は複雑です。
- ペア化されたCas9ニッカーゼは信頼性の高い編集方法を提供します。
- シームレスなゲノム編集は精密な修正に有利です。
- 効率的なジェノタイピングスクリーニングは成功した編集に不可欠です。
研究の目的
- ヒト多能性幹細胞における精密な遺伝子編集の方法を開発すること。
- HNF4α遺伝子に特定の変異を導入すること。
- 編集された細胞の選択効率を向上させること。
使用された方法
- 組換えラミニン表面上での幹細胞の維持。
- Cas9とターゲティングベクタープラスミドを用いた細胞の核内導入。
- 成功した編集細胞を分離するためのプブロマイシン選択の使用。
- 成功した編集を確認するためのジェノタイピングとシーケンシング。
主な結果
- HNF4α遺伝子座に2つの点変異が成功裏に導入されました。
- 編集後の細胞は多能性の特性を維持しました。
- 効率的な選択とジェノタイピングの方法が確立されました。
- 編集された細胞は重要な多能性マーカーを発現しました。
結論
- このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞における精密な遺伝子編集を可能にします。
- 遺伝子機能と分化の研究のための基盤を提供します。
- 将来の応用には、発生における特定の遺伝子役割の調査が含まれます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Seamless genome editing in human pluripotent stem cells enables precise interrogation of gene function and disease modeling at the earliest stages of drug discovery. The protocol's efficiency and reliability in introducing point mutations at the HNF4α locus support high-confidence target validation and mechanistic de-risking. This capability strengthens translational continuity from discovery biology to preclinical research, directly impacting portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise introduction of disease-relevant mutations for functional genomics studies.
- Supports robust target validation by generating isogenic cell lines with defined genetic alterations.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing direct assessment of gene function in human cellular contexts.
- Improves predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Provides validated, genetically defined cell systems for assay development and compound screening.
- Ensures reproducibility and standardization through seamless editing and rigorous genotyping.
- Enables quantitative readouts by confirming precise genomic modifications via PCR and sequencing.
- Supports scalable generation of cell lines for high-throughput screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered cell models with disease-relevant genotypes for translational biomarker studies.
- Maintains pluripotency and differentiation potential, supporting continuity into preclinical validation.
- Reduces biological risk by confirming genetic and phenotypic fidelity of edited lines.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on validated genetic models.
Pipeline & Workflow Integration
This genome editing protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, enabling seamless transition from target validation to disease modeling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling targeted gene modification.
- Screening: Delivers reproducible, genetically defined cell lines for assay readiness and quantitative evaluation.
- Analytics: Provides robust genotyping and sequencing outputs for confident comparison of edited versus parental lines.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by generating models with disease-relevant mutations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating custom-edited pluripotent stem cell lines across multiple targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes genome editing workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genetically validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, nucleofection, and molecular genotyping.
- Needs access to electroporation devices, high-quality plasmids, and sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for cell handling and selection protocols.
- Adaptation may be needed for different gene targets or cell line backgrounds.
- Cell viability and confluency must be closely monitored during selection and expansion phases.
