シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

ヒト多能性幹細胞の遺伝子編集は困難です。このプロトコルは、標的ベクターと組み合わせたペアのCas-90ケースを使用して、これらの細胞におけるゲノム編集の詳細な手順を提供します。信頼性が高く、フォローしやすいです。

このプロトコルの主な利点は、シームレスなゲノム編集であることです。2段階の選択により、標的細胞を増やすことができ、ジェノタイピングスクリーニングがより効率的になりました。ヒト多能性幹細胞をmTeSR1培地中の組換えラミニン21コード表面上に維持します。

細胞は、1〜3の分割比の72時間後に70〜85%のコンフルエンシーに達するはずです。トランスフェクションの日には、24ウェルプレートの十分なウェルに300マイクロリットルのラミニン521溶液をコーティングし、プレートを摂氏37度で少なくとも2時間インキュベートします。インキュベーション後、コーティング溶液を静かに除去し、すぐに300マイクロリットルの新鮮なmTeSR1培地を各ウェルに10マイクロモルのROCK阻害剤を加えます。

その後、プレートをインキュベーターに戻します。ストックヒト多能性幹細胞をインキュベーターから取り出します。使用済みの培地を取り除き、1ミリリットルの滅菌DPBSで細胞を1回洗浄します。

次に、1ミリリットルの穏やかな細胞解離試薬を各ウェルに加え、摂氏37度で6〜8分間インキュベートして細胞を解離します。プレートを軽くたたいて、細胞が簡単に剥がれることを確認します。次に、P1000チップを使用して、ピペッティングで上下に動かして細胞を持ち上げます。

2ミリリットルのmTeSR1培地とROCK阻害剤を添加して、解離を終了します。懸濁液をよく混合し、50ミリリットルのチューブに移します。細胞を200 Gで3分間遠心分離します。

次に、上清を取り除き、ROCK阻害剤を含む2ミリリットルのmTeSR1培地に細胞を再懸濁します。血球計算盤とトリパンブルーを使用して細胞を数えます。各ヌクレオフェクション反応について、800,000〜100万個の細胞を1.5ミリリットルのチューブに移し、それらを200Gで3分間遠心分離します。

次に、上清を慎重に吸引します。ヒト幹細胞ヌクレオフェクションキットの混合ヌクレオフェクション溶液100マイクロリットルに、ペアになったCas-9nシングルガイドRNA発現プラスミド3マイクログラムとターゲティングベクタープラスミド5マイクログラムを混合します。GFPコントロールプラスミドミックスも調製します。

DNAミックスで細胞を再懸濁し、エレクトロポレーションキュベットに移し、気泡を避けます。ヒト多能性幹細胞に最適化された条件を用いて、ヌクレオフェクションデバイスを用いて細胞をエレクトロポレーションします。すぐに、10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した500マイクロリットルの新鮮で温かいmTeSR1培地をエレクトロポレーション細胞に加えます。

次に、混合物を事前に調製した24ウェルプレートの2つのウェルに移します。プレートを5%の二酸化炭素が供給された摂氏37度のインキュベーターに入れて、細胞が回復するのを待ちます。12〜16時間後に細胞維持培地を交換し、細胞が細胞間接触を確立した場合はROCK阻害剤を回収します。

24〜48時間後、コントロール細胞でのGFP発現を調べて、ヌクレオフェクション効率を確認します。ヌクレオフェクションの48時間後に、mTeSR1培地に1ミリリットルあたり1マイクログラムのピューロマイシンを補充して、細胞の選択を開始します。72時間後、培地に0.5マイクログラム/ミリリットルのピューロマイシンを補給します。

細胞の密度が30%未満の場合は、培地に10マイクロモルのROCK阻害剤も補充します。ヌクレオフェクションの4〜6日後、ピューロマイシン耐性細胞をウェルあたり0.8細胞の濃度で10〜15個の96ウェルプレートに継代する。培地にはROCK阻害剤とピューロマイシンを必ず補充してください。

細胞を摂氏37度と二酸化炭素10%に10〜12日間維持して、単一細胞由来のコロニーを形成します。播種から7日後に培地を補充します。1つのコロニーを含むウェルに印を付け、培地を1ミリリットルあたり0.5マイクログラムのピューロマイシンを含む新鮮なmTeSR1培地と交換しますが、ROCK阻害剤は含みません。

細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%でさらに2日間成長させます。次に、未分化コロニーを含むウェルの培地を変更します。コロニーを静かにこすり落とし、細胞懸濁液を1つのコロニーから別々の96ウェルプレート上の2つの新しいウェルに移します。

1つはジェノタイピング用、もう1つはメンテナンス用です。ジェノタイピング細胞のコンフルエンシーが50%以上に達したら、使用済みの培地を捨て、細胞をDPBSで一度洗浄します。Bradley Lysis Bufferで細胞を溶解し、各ウェルからゲノムDNAを単離します。

3つのプライマージャンクションPCRを実施し、製品のシーケンシングを行った後、コロニーを正しい遺伝子型に保ち、残りは廃棄します。連続的なピューロマイシン選択の下で正しいコロニーを拡大し、できるだけ早く凍結します。このプロトコルは、肝細胞核因子4α遺伝子のエクソン8に2つの点変異を導入するために使用されました。

3プライマーベースのPCR法を使用して、正しく標的化された細胞をスクリーニングし、PCR結果を確認するためにサンガーシーケンシングを実施しました。選択カセットの除去後、改変された領域を再度シーケンシングして、所望の点突然変異の正しい導入を確認しました。正しい遺伝子型のコロニーを選択し、さらなる分析の前に細胞を特徴付けました。

編集された細胞は親細胞と同じ形態を持ち、転写因子NanogやOct4などの代表的なヒト多能性幹細胞マーカー、細胞表面マーカーであるSSEA-4やTRA-160を発現しています。この手順を試みるときは、最初の24時間でピューロマイシン選択後の細胞の密度を確認することを忘れないでください。中央値をROCK阻害剤で補うことが不可欠です。

細胞の密度が30%未満の場合、細胞を続けます。ゲノム編集された多能性幹細胞株が確立されると、遺伝子機能や指向性分化の研究に使用できます。この手法は、研究者が遺伝子の特定の機能や遺伝性疾患の標的遺伝子修正など、さまざまな問題を研究するための道を開きます。